接着細胞培養用の酸素挿入の作製と動作

Summary

6ウェルプレートでの空間的、時間的な酸素化のコントロールが強化さを提供するアドオンプラットフォームの作製と検証。デバイスは、文化のシステムの数に適応可能であり、創傷治癒に及ぼす酸素の影響を調査するために使用することができます。

Abstract

酸素は多くの細胞経路の重要なモジュレーターであるが、現在のデバイスが良ければ<em> in vitroで</em>酸素の変調は、生物医学研究のニーズを満たすことができない。低酸素室は、標準的な培養容器内の酸素化を制御するシンプルなシステムを提供していますが、生理現象のさまざまな研究に、そのアプリケーションを防止する、細胞表面での酸素濃度を正確に時間的空間的制御を欠いている。他のシステムでは、低酸素室に改良が、平均的な研究者のためのそれらを威圧すること、それらの操作のための専門知識と機器を必要としている。マルチウェルプレートのための微細加工インサートは、より効果的に発見より良いモデル生理現象に時間と空間の酸素濃度を制御するために開発されている<em> in vivoで</em>。プラットフォームは、標準のマルチウェルプレートに巣そのポリジメチルシロキサンのインサートで構成されており、付着細胞への酸素供給を調節することを目的としたガス透過膜とパッシブマイクロ流体ガスのネットワークとして機能します。このデバイスは使いやすく、プラットフォームに必要な酸素濃度を導入する圧力を提供するガスボンベに接続されています。製造は、シリコンウェハ上にスピン標準のSU – 8フォトリソグラフィー、レプリカの成形、および定義されたPDMSの組み合わせが含まれます。デバイスのコンポーネントは、ハンドヘルド型プラズマシステムを使用して表面処理後に接着されている。検証は、平面蛍光酸素センサーで実現されます。平衡時間は分のオーダーであり、酸素のプロファイルの多種多様なデバイスの設計に基づいて達成することができる、そのような本研究で達成された周期的なプロファイルとして、さらには酸素勾配が見られるものを模倣する<em> in vivoで</em>。デバイスは、機能を失うことなく一般的な方法を用いて細胞培養のために滅菌することができる。勉強へのデバイスの適用性<em> in vitroで</em>創傷治癒の応答が実証されます。

Protocol

1。デバイスの機能低酸素挿入装置は、標準の6ウェルプレートに巣その6柱を含んでいます。ガスは、柱の基部に微小流体ネットワークを介して、柱に流れ込み、およびデバイスの背面に流れ出します。マイクロチャネルの底壁を構成する柱の基部にマイクロガスと培地との間で酸素の拡散を可能にする厚さ100μmのガス透過性PDMS膜です。したがって、デバイスが所望の値に向かって、メディアの酸素濃度を駆動する濃度勾配を確立することによって動作します。 このデバイスは、低酸素室と他の細胞の酸素化のシステムに比べ多くの利点提供しています：1）、2を速く時間的制御を可能にする酸素の拡散経路を最小限に）柱マイクロチャネルの設計上のような依存酸素化における空間制御、3を強化）を有する小さな研究室の設置面積と実験効率を高めるためにより高いスループット、および4）専門的な知識や機器を必要とせずに一般的な細胞培養ツール（例えば、マルチウェルプレート）に適応します。 2。デバイス製造第一の柱の配列は以前に加工されたDelranの金型にPDMSで成形されたレプリカです。 各ピラーの下部にマイクロチャネル次にガスは、標準のSU – 8フォトリソグラフィーとPDMSレプリカモールドを用いて製造されています。 ガス透過性膜は、所望の厚さを達成するために、シリコンウエハ上にPDMSの定義紡糸により製造されています。この例では、10秒間に500回転してから30秒間、900 rpmの回転により作製された厚さ100μmメンブレンを使用してください。 すべてのコンポーネントは、ハンドヘルドプラズマ装置（モデルBD – 20、エレクトロテクニックプロダクツ）と酸素プラズマ処理の後に一緒に結合されています。 3。デバイスのセットアップ静かに泡を避けるために確認して、プレートにデバイスを挿入します。挿入中にデバイスを釣りには片側に気泡を追い出すのに役立ちます。実際の細胞ベースの実験については、このステップは、無菌層流フードの内部で行う必要があります。デバイスが挿入されると、汚染の可能性を大幅に削減され、アセンブリが​​非無菌環境でのインキュベーターに繰り越すことができるので。 装置の入口側と出口側に原料ガスのタンクからチューブを接続します。細胞ベースの実験のために、培養インキュベーターは、チューブのエントリを許可する穴があるはずですし、チューブは、デバイスを運ぶし、インキュベータにそれを配置した後に接続する必要があります。基盤となる細胞を破砕するのに十分なPDMSを変形させることができる装置、に過剰な圧力を置かないように注意してください。 精密フローレギュレータがデバイスのオーバーフローを避けるためにタンクトップレギュレータを開く前に閉じていることを確認してください。ガスの流れを開始します。所望の流量（50〜100 mL /分）にゆっくりと開いている精密フローレギュレータ。システムは、流量を変えること、平衡化しながら、圧力降下が変化するので、次の時間にわたって密接に価値を見て、必要に応じて調整を行います。メディアにおける気泡の形成を回避するために、より高い流速を持つ最初の15分間の平衡期間の後に10から20の間mL / minに流量を減少させる。 目的の実験期間中、ガスの流れを停止した後、プレートを取り外し、およびプロセスの細胞に応じて（例えば等、数え、染色、溶解）。 4。デバイスの検証 校正 蛍光酸素の位置の数と場所を選択酸素の測定に使用される（FOXY）センサーのスライド（検証の要件に応じて）。スライドは、酸素によって消光される蛍光ルテニウム色素のコーティングが含まれています。 0、10を直接スライド公開、およびガスのタンクから21％の酸素と適切な平衡化のため5分後に画像をキャプチャ。 蛍光強度に依存するように各位置とプロットの酸素濃度の平均画像の輝度をエクスポートします。 0〜10％のラインと10から21パーセントのラインに線形の曲線をフィッティングすることにより検量線を生成します。 異質 定義された間隔（例えば各1 mm）でのチャネルの幅をまたがる複数のポイントを確立する。間隔に応じて、画像の重複があるかもしれないことに注意してください。 デバイスを介しても表面で酸素濃度を測定する 平衡 酸素濃度を測定するためにFOXYスライド上の3つの点を選択してください。 すぐに周囲の酸素濃度での最初の画像をキャプチャした後、デバイスへのガスの流れを開始するために精密なフローレギュレータを開きます。酸素concentrの期間と程度を評価するために適切な間隔で画像をキャプチャエーションの平衡（30分間毎に10秒など）。 5。アプリケーション 創傷治癒 実験前日、ウェル中の気泡の形成を抑制減らすために無血清培地に滅菌PDMSインサートを浸す。 6ウェルプレートでコンフルエントに100％の培養細胞。 傷をシミュレートするために、P200のピペットチップを用いて単層でストレート傷を作成します。 細胞の培地を吸引除去する、5mLのメディアですすいでください、そして再び吸引。細胞の単層を乱さないことが重要です。 リフィル細胞増殖を減少させるために4 mLの無血清培地をウェルの中。 場所は、井戸に挿入し、対応する酸素の濃度を各ウェルに接続します。 37℃加熱ステージ上のインサートを持つ場所を6ウェルプレート℃に目的の間隔と継続時間の合計で細胞のタイムラプス画像をキャプチャします。 MATLABのT_Scratch、傷の測定アルゴリズムは、治癒表面積を分析するために使用することができます。 6。代表的な結果 デバイスの検証 低酸素挿入装置は、0.5％の酸素に安定するまで2分未満を必要とする、酸素の平衡時間と範囲の面で低酸素室と比較して大きな改善を示す。デバイスの膜ウェルボトムギャップサイズは大きくギャップのサイズは、定常状態の酸素濃度の値に到達するより多くの時間を必要とすると、平衡の効率を左右する重要な要因だった。また、このデバイスは、複数の条件の形成を可能にする、単一のウェル内の空間的な酸素化を制御するための多くを許可し、さらにウェルの表面全体に周期的な酸素のプロファイルを生成する。 創傷治癒 細胞単層は、10％または21％の酸素にさらされ、創傷面の面積は、時間をかけて分析した。 21％の酸素にさらされた傷は、最も遅いと10％の最速を閉じた。図1は、17時間の経過とともに傷の画像を示す。図5のグラフは、実験期間中の酸素濃度の両方のためのオープンな創傷面積の割合を示しています。 図1の回路とデバイスの機能を説明する図。酸素挿入装置はレプリカは（マイクロ流体ネットワークとインサート足場）成形、従来のフォトリソグラフィ（マイクロ流体ネットワーク）で作製し、PDMS（ガス透過性膜）の紡糸定義されています。 A）酸素のデバイスは、6ウェルプレートにネスト。 B）24および96ウェル柱の配列の例。柱のC）の断面概略図。酸素は、入口を通って装置内に流入し柱の下部に微小流体ネットワークを通過します。酸素は自由に柱の下部にガス透過性のPDMS膜を横切って拡散し、培地中に溶解することができる。 D）平衡の研究のための結合されたガラスのポストで、上からのシングルチャネルの柱の様々な機能を示す顕微鏡写真。 図2の酸素センサーとデバイスの検証。各ウェル内の酸素分圧は、平面ルテニウムの酸素センサを用いて特徴付けられた。すべての酸素の混合物は、メディアのバッファリングのためにバランスの窒素および5％CO 2を含んでいた 。 A）プロットは平衡時間および有効性を、後の高さの影響を示すため、細胞膜と細胞間の酸素の拡散距離。ハイツは、装置の底部にバインドされたカットグラスのポストによって設立された。すべての3つのポストのサイズは非常に低酸素室で改善平衡化時間を得る。時間は対数スケール上にあることに注意してください。 B）プロットは、0.2 mmギャップデバイスの急速な酸素の平衡応答時間を描いた。 C）マルチポジションのラインスキャンは、デバイスによって導入された酸素濃度の均一性を確保するためのマイクロチャネルでも越えて行われた。グラフは、0％、10％、および10分間21％の酸素を注入した後に測定した酸素濃度を示しています。 D）デバイスは、効果的に5日間にわたる10％の酸素を維持しています。 図3。複雑な酸素マイクロチャネルの設計と実験。 A）デュアル条件マイクロチャネル設定は、安定した0％、14日以上21％酸素のプロファイルを得られます。 B）番目にわたって延びる500μmの幅のマイクロチャネルの櫛歯と巻線パターンは、巡回酸素プロファイルのEピラー結果。マイクロチャネルアライメントが困難だったので、データは1つだけ代表的な裁判を描いていることに注意してください。 図4。創傷閉鎖0、7、および初期傷後17時間のタイムラプス画像。細胞は実験期間を通じて21％の酸素を配信されていました。 図5。スクラッチアッセイにおける創傷治癒の速度での酸素濃度の影響。

Discussion

デバイスは、標準のSU – 8フォトリソグラフィー、レプリカの成形、および定義されたスピンとポリジメチルシロキサンから完全に作られたことにより製造されています。ガスは、所望の平衡酸素濃度に向けてシステムを駆動する、マイクロチャネルの柱と培地の間に濃度勾配を確立するためにデバイスに導入される。デバイスは、効果的にも内部に時間的および空間的な酸素化を調節するだけでなく、適切な細胞挙動を調節することが示されている。酸素化の空間パターン形成が柱の基部でマイクロチャネルによって定義され、デザインの様々なフォトマスクを作り上げるに実施することができるので。さらに、井戸の気相への所望のガスの注入は、平衡時間と低酸素の程度の向上が期待される。マイクロ流体混合ネットワークは、少数の株式のガスのタンクから新規な混合ガスを生成する手段を提供するデバイスに適合させることができる。最後に、メディア交換のためのメカニズムは、細胞が応答する可能性があるからマルチウェルプレート、からデバイスの取り外しの必要性を削除してしまうことになります。

デバイスは、 インビトロまたは酸素濃度の制御を必要とするex vivoでの実験で任意のアプリケーションを持っています。酸素は、シグナル伝達経路の大部分に影響を与える重要な生理学的変数であるため、恩恵を受ける研究の分野は、研究者の創造性によって制限されます。酸素濃度の強​​化された時間的な制御の恩恵を受ける一部のフィールドは、他の多くの間で癌の転移、睡眠時無呼吸症候群、および心臓の虚血再灌流障害を、含まれています。例えば、間欠的低酸素症は、連続的な低酸素症および正常酸素の相対metastastis関連遺伝子の数を上方制御する、より多くの浸潤癌と相関している。空間的な制御は、酸素勾配が開発、肝臓の帯状分布、薬物毒性、および幹細胞のニッチで重要であるため、も重要です。この記事で紹介した装置は、小さなラボフットプリント、比較的単純な運用上の要件、および細胞への酸素曝露上はるかに優れた制御システムを提供することにより、研究の多くの分野の利益になる。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PDMS-Sylgard 184		Dow Corning
Planar FOXY sensor		Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator		Omega	FL-1472-G
Gas		Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150		Microchem
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine		SAFC Biosciences	M3803
Fetal Bovine Serum		ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA		Sigma	T4049
L-Glutamine solution		Sigma	G7513