تصنيع وتشغيل إدخال الأوكسجين للثقافات الخلوية منتسب

Summary

تلفيق والتحقق من منصة الإضافية التي توفر تعزيز الرقابة على الأوكسجين المكاني والزماني في صفيحة 6 – جيدا. الجهاز قابل للتكيف لعدد من النظم والثقافة ، ويمكن استخدامها للتحقق من آثار الأوكسجين على التئام الجروح.

Abstract

الأكسجين هو المغير الرئيسية للمسارات الخلوية كثيرة ، ولكن الأجهزة الحالية التي تسمح<em> في المختبر</em> تعديل الأكسجين تفشل في تلبية الاحتياجات من البحوث الطبية الحيوية. غرفة ميتة يوفر نظام بسيط للسيطرة على الأوكسجين في أوعية الثقافة القياسية ، لكنه يفتقر تحكم دقيق الزمانية والمكانية على مدى تركيز الأوكسجين على سطح الخلية ، ومنع تطبيقه في دراسة مجموعة من الظواهر الفسيولوجية. وقد تحسنت نظم أخرى على غرفة ميتة ، ولكنها تتطلب المعرفة المتخصصة والمعدات اللازمة لتشغيلها ، مما يجعلها مخيفة للباحث في المتوسط. وقد تم وضع لوحات ادخال microfabricated multiwell على نحو أكثر فعالية التحكم في تركيز الأوكسجين الزماني والمكاني للظواهر وجدت أفضل نموذج الفسيولوجية<em> في الجسم الحي</em>. منصة تتألف من ادخال polydimethylsiloxane أن أعشاش إلى لوحة multiwell القياسية ويعمل كشبكة الغاز ميكروفلويديك السلبي مع غشاء الغاز نفاذية الرامية لتعديل تسليم الاوكسجين الى خلايا ملتصقة. الجهاز سهل الاستخدام ومرتبط اسطوانات الغاز التي توفر لضغوط لتقديم تركيز الأوكسجين المطلوب في النظام الأساسي. تلفيق ينطوي على مزيج من ضوئيه SU – 8 القياسية ، صب المتماثلة ، وتعريف PDMS الغزل على رقاقة السيليكون. مستعبدين مكونات الجهاز بعد المعالجة السطحية باستخدام نظام البلازما باليد. ويتم إنجاز التحقق من صحة مع جهاز استشعار الأوكسجين الفلورسنت مستو. الوقت هو موازنة بناء على أمر من دقيقة ، ويمكن التوصل إلى تشكيلة واسعة من التشكيلات الأكسجين على أساس تصميم الجهاز ، مثل ملف دوري يتحقق في هذه الدراسة ، وحتى التدرجات الاوكسجين الى تقليد تلك التي وجدت<em> في الجسم الحي</em>. ويمكن للجهاز تعقيم للثقافة الخلية باستخدام الأساليب الشائعة دون فقدان وظيفة. الجهاز لدراسة انطباق<em> في المختبر</emسيظهر> ردا التئام الجروح.

Protocol

1. وظيفة الجهاز الجهاز يحتوي على إدراج ميتة 6 الركائز التي تعشش في لوحة 6 – جيدا القياسية. يتدفق الغاز إلى عمود ، عبر شبكة ميكروفلويديك عند قاعدة العمود ، وتدفقات التراجع عن الجهاز. في قاعدة العمود تشكيل الجدار أسفل متناهية هو 100 ميكرون سميكة غشاء PDMS الغاز نفاذية الأكسجين الذي يسمح نشرها بين متناهية الغاز ووسائل الإعلام الثقافة. وبالتالي ، فإن الجهاز يعمل عن طريق إنشاء الانحدار الذي يدفع التركيز على تركيز الأكسجين وسائل الإعلام من أجل التوصل إلى القيمة المطلوبة. الجهاز يوفر عددا من المزايا على الحجرة نقص الأوكسجين وغيرها من أنظمة تهوية الخلية : 1) يقلل المسار نشر أوكسجين السماح التحكم أسرع الزمانية ، 2) من شأنه أن يعزز السيطرة المكانية على الأوكسجين ، كما يعتمد على تصميم عمود متناهية ، 3) تمتلك أصغر البصمة المختبر والتعليم العالي لزيادة الكفاءة الإنتاجية التجريبية ، و 4) تتكيف مع الأدوات المشتركة ثقافة خلية (على سبيل المثال لوحة multiwell) دون الحاجة إلى المعرفة المتخصصة والمعدات. 2. جهاز تلفيق أول مجموعة متماثلة هو الركيزة مع مصبوب في قالب PDMS Delran تشكيله من قبل. المقبل الغاز ملفقة متناهية في أسفل كل عمود باستخدام معيار SU – 8 ضوئيه وPDMS صب متماثلة. غير ملفقة الغاز نفاذية الغشاء عن طريق الدوران محددة من PDMS على رقاقة السيليكون لتحقيق سمك المطلوب. في هذا المثال نستخدم غشاء 100 ميكرون سميكة التي كانت ملفقة من خلال الدوران 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية ثم 900 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. مستعبدين جميع المكونات معا بعد العلاج البلازما الأوكسجين مع جهاز محمول البلازما (النموذجي BD – 20 ، تكنيك الكهربائية والمنتجات). 3. الجهاز الإعداد بلطف إدراج الجهاز في لوحة ، مع التأكد من تجنب الفقاعات. الصيد الجهاز أثناء الإدراج يساعد على طرد فقاعات من جانب واحد. للتجارب خلية مقرها الفعلي ، لا بد من القيام بهذه الخطوة داخل غطاء تدفق الصفحي العقيمة. وتقلص إلى حد كبير من فرص تلوث مرة يتم إدراج الجهاز ، لذلك يمكن أن يتم التجميع عبر إلى حاضنة في بيئة غير معقمة. توصيل أنابيب من خزان الغاز المصدر إلى منافذ مدخل ومخرج الجهاز. لخلية مقرها التجارب ، ينبغي أن يكون حاضنة للثقافة حفرة لتأشيرة دخول ، وينبغي أن أنابيب توصيل الأنابيب بعد تحمل الجهاز ووضعه في الحاضنة. نتوخى الحذر لتجنب الضغط الزائد على الجهاز ، الذي يمكن أن تشوه PDMS يكفي لسحق الخلايا الكامنة. تأكد من إغلاق منظم التدفق الدقة قبل فتح المنظم الأعلى للدبابات لتجنب فيضان الجهاز. بدء تدفق الغاز. بلطف تدفق الدقة فتح المنظم لمعدل التدفق المطلوب (50-100 مل / دقيقة). يراقب عن كثب على مدى قيمة ساعة المقبلة ، وإجراء التعديلات حسب الحاجة ، حيث أن انخفاض الضغط في حين سيتم تغيير النظام equilibrates ، تغيير معدل التدفق. لتجنب تشكيل فقاعات في وسائل الإعلام ، والحد من معدل التدفق الى ما بين 10-20 دقيقة / مل بعد أولية مدتها 15 دقيقة مع موازنة ارتفاع معدل التدفق. بعد فترة تجريبية المطلوب ، ووقف تدفق الغاز ، وإزالة لوحة ، وخلايا العملية وفقا لذلك (مثل ليز ، وصمة عار ، والعد ، الخ.) 4. الجهاز التحقق من صحة معايرة تحديد عدد ومكان وجود مواقع على الأوكسجين الفلورسنت (ماكر) شريحة استشعار (اعتمادا على شروط المصادقة) التي سيتم استخدامها لقياس الأوكسجين. الشريحة تحتوي على صبغة الفلورسنت الروثينيوم طلاء التي تطفئ بواسطة الأوكسجين. تعرض الشريحة مباشرة إلى 10 ، 0 ، والأكسجين 21 ٪ من خزان الغاز والتقاط الصور بعد 5 دقائق للموازنة سليمة. تصدير صورة كثافة يعني لكل موقف وتركيز الأوكسجين مؤامرة كما تعتمد على كثافة الفلورسنت. إنشاء منحنى المعايرة منحنيات خطية من المناسب أن خط 00-10 ٪ ، وسطر 10-21 ٪. عدم التجانس إنشاء مراكز متعددة تغطي عرض القناة عند فاصل زمني محدد (على سبيل المثال كل 1 مم). علما أنه قد يكون هناك تداخل الصور اعتمادا على التباعد. قياس تركيز الأوكسجين في السطح بشكل جيد من خلال الجهاز موازنة اختيار ثلاث نقاط على الشريحة التي ماكر لقياس تركيز الأوكسجين. مباشرة بعد التقاط الصورة الأولى في مستويات الأكسجين المحيطة ، وفتح منظم التدفق الدقيق لبدء تدفق الغاز في الجهاز. التقاط الصور على فترات مناسبة لتقييم مدى ومدة الأوكسجين concentrموازنة العنصر (مثلا كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة). 5. تطبيقات التئام الجروح وقبل يوم من التجربة ، ونقع في إدراج PDMS معقمة خالية من مصل المتوسطة للحد من الغاز تمنع تشكيل فقاعة في البئر. ثقافة الخلايا إلى 100 ٪ في لوحة confluency 6 – جيدا. إنشاء خدوش على التوالي في monolayers مع طرف P200 ماصة لمحاكاة الجروح. نضح وسائل الإعلام الخلية ، وشطف مع وسائل الإعلام 5 مل ، ونضح مرة أخرى. من المهم أن لا تخل أحادي الطبقة من الخلايا. الملء مع 4 آبار متوسطة خالية مل مصل للحد من انتشار الخلايا. مكان إدراج في الآبار وتوصيل كل بئر إلى تركيز الأوكسجين المقابلة. 6 مكان جيد لوحة مع إدراج ساخنة على خشبة المسرح في 37 درجة مئوية. التقاط الصور الفاصل الزمني للخلايا عند الفاصل الزمني المطلوب والمدة الإجمالية. ويمكن استخدام T_Scratch MATLAB ، وهي خوارزمية قياس الجرح ، لتحليل مساحة الدامي. 6. ممثل النتائج الجهاز التحقق من صحة يسلك جهاز ادخال تحسينات كبيرة على مدى نقص الأوكسجين في الغرفة ميتة من حيث الوقت ومدى موازنة الأكسجين ، الأمر الذي يتطلب أقل من 2 دقيقة لتحقيق الاستقرار للأوكسجين 0.5 ٪. كان غشاء الجهاز جيدا حجم الفجوة السفلية العامل الحاسم في تحديد كفاءة موازنة ، مع أحجام أكبر من الفجوة التي تتطلب المزيد من الوقت للوصول إلى حالة استقرار قيم تركيز الأوكسجين. يسمح الجهاز أيضا قدرا كبيرا من السيطرة على الأوكسجين المكانية في بئر واحدة ، مما يسمح بتشكيل ظروف متعددة ، وتوليد الأوكسجين حتى التشكيل دوري عبر سطح البئر. التئام الجروح تعرضت monolayers الخلية إلى 10 ٪ أو 21 ٪ أكسجين ومساحة الجرح تم تحليل أكثر من مرة. مغلق الخدوش تتعرض للأوكسجين 21 ٪ أبطأ و 10 ٪ أسرع. الشكل 1 يبين صورا لنقطة الصفر على مدار 17 ساعة. الرسوم البيانية في الشكل 5 تظهر في المئة من مساحة الجرح مفتوحا أمام كل من تركيز الأوكسجين لمدة التجربة. الشكل 1. التخطيطي والمخططات التي توضح ميزات الجهاز. غير ملفقة الجهاز إدراج الأكسجين ضوئيه التقليدية (شبكة ميكروفلويديك) ، صب متماثلة (شبكة ميكروفلويديك وسقالة إدراج) ، وتعريف الغزل PDMS (الغاز نفاذية الغشاء). أ) جهاز الاوكسجين المتداخلة في لوحة 6 – جيدا. ب) أمثلة على 24 و 96 – جيدا صفائف العمود. ج) التخطيطي مستعرضة عمود. الأوكسجين يتدفق الجهاز من خلال مدخل ويسافر عبر شبكة ميكروفلويديك في الجزء السفلي من العمود. يمكن الأوكسجين منتشر بحرية عبر الغشاء PDMS الغاز نفاذية في الجزء السفلي من العمود ، ويذوب في وسائل الإعلام الثقافة. D) صورة المجهر إظهار ملامح مختلفة من عمود واحد من قناة أعلاه ، مع زجاج المشاركات المستعبدين للدراسات موازنة. الشكل 2. التحقق من صحة الجهاز مع أجهزة استشعار الأوكسجين. تميزت توتر الأوكسجين داخل كل بئر باستخدام الأكسجين الروثينيوم مستو الاستشعار. يتضمن كل الخلائط الأكسجين النيتروجين متوازنة و 5 ٪ CO 2 للالمؤقت وسائل الإعلام. أ) رسم يوضح تأثير ارتفاع آخر ، وبالتالي الأكسجين بعد نشرها بين الغشاء والخلايا ، في الوقت موازنة والفعالية. المرتفعات التي أنشئت قطع الزجاج المشاركات متجهة إلى أسفل الجهاز. كل ثلاثة أضعاف موازنة العائد أحجام آخر تحسنت كثيرا خلال غرفة ميتة. علما بأن الوقت على نطاق السجل. ب) رسم تصور موازنة الأكسجين زمن الاستجابة السريعة للجهاز الفجوة مم 0.2. كما اتخذت C) موقف متعدد linescans عبر البئر تحت متناهية لضمان تجانس تركيز الأوكسجين الذي قدمه الجهاز. رسم بياني يصور قياس تركيز الأوكسجين بعد غرس 0 ٪ ، 10 ٪ ، والأكسجين 21 ٪ لمدة 10 دقيقة. D) يحتفظ الجهاز بفعالية الأكسجين 10 ٪ على مدى 5 أيام. الشكل 3. التجريب مع تصاميم أكثر تعقيدا الأكسجين متناهية. أ) الإعداد المزدوجة حالة مستقرة متناهية غلة 0 ٪ و 21 ٪ أكثر من ملف الأكسجين 14 يوما. ب) نمط interdigitated والمتعرجة من 500 ميكرومتر microchannels عرض تمتد عبر الالنتائج دعامة ه في التشكيل الأكسجين بصفة دورية. علما بأن البيانات يصور ممثل واحد فقط المحاكمة كما كان من الصعب محاذاة متناهية. الشكل 4. الصور Timelapse اغلاق الجرح 0 ، 7 ، و 17 ساعة بعد الصفر الأولي. تم تسليم الخلايا الأوكسجين 21 ٪ طوال مدة التجربة. الشكل 5. تأثير على معدل تركيز الأوكسجين في التئام الجروح مقايسة الصفر.

Discussion

وملفقة من قبل جهاز ضوئيه SU – 8 القياسية ، صب المتماثلة ، وتعريف الغزل ومصنوع بالكامل من polydimethylsiloxane. يتم إدخال الغاز في الجهاز لإنشاء معامل تركيز عمود متناهية بين وسائل الإعلام والثقافة ، ونظام القيادة نحو تركيز الأوكسجين التوازن المطلوب. وقد تبين أن الجهاز لتعدل على نحو فعال الأوكسجين الزمانية والمكانية داخل البئر ، وكذلك تعدل السلوك الخلوية بشكل مناسب. يتم تعريف الزخرفة المكاني للالأوكسجين من قبل متناهية على قاعدة العمود ، لذلك يمكن أن تنفذ مجموعة متنوعة من التصاميم في صياغة والضوئية الرئيسية. بالإضافة إلى ذلك ، من المتوقع ضخ الغاز المطلوب في مرحلة الغاز من البئر لتحسين وقت موازنة ومدى نقص الأكسجة. ويمكن تكييف شبكة ميكروفلويديك الاختلاط إلى الجهاز لتوفير وسيلة لإنتاج الغاز مخاليط الرواية من الأسهم فقط من الدبابات الغاز قليلة. أخيرا ، فإن آلية لتبادل وسائل الاعلام للقضاء على الحاجة لإزالة الجهاز من لوحة multiwell ، التي قد تستجيب الخلايا.

الجهاز له تطبيقات في أي السابقين في المختبر أو التجربة الحية التي تتطلب السيطرة على تركيز الأوكسجين. والأكسجين هو متغير مهم الفسيولوجية التي تؤثر على الغالبية العظمى من مسارات الإشارات ، من محدودية مجالات البحوث التي من شأنها أن تستفيد من الابتكار لدى الباحث. بعض المجالات التي يمكن أن تستفيد من السيطرة على الزماني تعزيز تركيز الأوكسجين الانبثاث تشمل السرطان وتوقف التنفس أثناء النوم ، ونقص التروية القلبية الاصابة ضخه ، ضمن أشياء أخرى كثيرة. على سبيل المثال ، ارتبط نقص الأكسجة المتقطعة مع أكثر أنواع السرطان الغازية ، upregulating عددا من الجينات المرتبطة metastastis النسبية لنقص الأكسجة المستمر وnormoxia. السيطرة المكانية المهم أيضا ، كما هي التدرجات الأكسجين حاسما في التنمية ، وتحديد مناطق الكبد وسمية الدواء ، والخلايا الجذعية المتخصصة. سيقوم الجهاز المعروضة في هذه المقالة يستفيد عدد من المجالات البحثية من خلال توفير نظام البصمة مع أصغر المختبر ، والاحتياجات التشغيلية بسيطة نسبيا ، والسيطرة على أكبر بكثير التعرض الاوكسجين الى الخلايا.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PDMS-Sylgard 184		Dow Corning
Planar FOXY sensor		Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator		Omega	FL-1472-G
Gas		Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150		Microchem
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine		SAFC Biosciences	M3803
Fetal Bovine Serum		ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA		Sigma	T4049
L-Glutamine solution		Sigma	G7513