Modelo murino de CD40-ativação de células B
Summary
Neste vídeo, demonstramos o procedimento de ativação CD40-e expansão de células B murino de esplenócitos de camundongos C57BL / 6, que pode ser usado como um modelo de células apresentadoras de antígenos (APC) para estudar a indução de imunidade.
Abstract
A investigação sobre células B CD40 mostrou que melhora a sua capacidade de ativação apresentação de antígenos. Quando estimuladas com interleucina-4 e CD40 ligante (CD40L), células B humano pode ser expandido sem dificuldades a partir de pequenas quantidades de sangue periférico dentro de 14 dias para grandes quantidades de altamente pura CD40 células-B (> 10<sup> 9</sup> Células por paciente) de doadores saudáveis, bem como pacientes com câncer<sup> 04/01</sup>. Células CD40-B expressam moléculas linfáticos importante nó de homing e podem atrair células T<em> In vitro</em<sup> 5</sup>. Além disso, eles ocupam de forma eficiente, processar e apresentar antígenos às células T<sup> 6,7</sup>. Células CD40-B se mostraram não só ingênua prime, mas também expandir células T de memória<sup> 8,9</sup>. Portanto CD40-ativação de células B (CD40-células B) têm sido estudadas como uma fonte alternativa de imuno-estimulantes células apresentadoras de antígenos (APC) para a célula-base immunotherapy1, 5,10. A fim de estudar ainda mais se as células CD40-B induzir eficazes respostas de células T in vivo e estudar o mecanismo subjacente foi estabelecido um sistema de cultura celular para a geração de células CD40 de murino B ativadas. Usando esplenócitos ou purificada de células B de camundongos C57BL / 6 para CD40-ativação, as condições ideais foram identificados da seguinte forma: A partir de esplenócitos de camundongos C57BL / 6 (haplótipo H-2b) linfócitos são purificados por gradiente de densidade centrifugação e co-cultivados com HeLa células que expressam recombinante ligante CD40 de murino (tmuCD40L HeLa)<sup> 11</sup>. Células são recultured cada 3-4 dias e componentes-chave, como CD40L, a interleucina-4, Mercaptoetanol e ciclosporina A são reabastecidos. Neste protocolo que demonstrar como obter totalmente ativado murino CD40-B células (mCD40B) com semelhante APC-fenótipo CD40 humano para células-B (Fig. 1a, b). CD40-estimulação leva a um resultado rápido e expansão de alta pureza (> 90%) CD19 + células B no prazo de 14 dias de cultura de células (Fig 1c, d). Para evitar a contaminação com os não-transfectadas células, a expressão do ligante CD40 de murino na transfectants tem que ser controlado regularmente (Fig. 2). Murino células CD40-activated B pode ser usado para estudo de células B de ativação e diferenciação, bem como para investigar seu potencial para funcionar como APC in vitro e in vivo. Além disso, eles representam uma ferramenta promissora para o estabelecimento de vacinação terapêutica ou preventiva contra tumores e vai ajudar a responder questões relativas à segurança e imunogenicidade desta abordagem<sup> 12</sup>.
Protocol
Discussion
Modificações deste protocolo são possíveis, especialmente quanto à origem do estímulo-CD40 e do tipo de estirpe do rato utilizado, rendendo também na geração eficiente de células CD40 de murino B ativadas. Ahmadi et al. têm mostrado resultados semelhantes para fibroblastos de rato transfectadas com murino CD40 ligante. Nesta apresentação contexto de xeno-antígeno pode ser excluída com certeza, mas estudos intensivos em matéria de segurança e toxicidade in vivo não deu sinais de inflamação ou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pedimos gentilmente agradecer ao Dr. Clemens Wendtner para fornecer tmuCD40-Ligand-linha celular HeLa.
Materials
A. Preparation of Media:
| Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamine | 300 μg/mL | L-Glutamine | 300 μg/mL |
| FBS | 10 % | FBS | 10 % |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| Hygromycin B | 0.2 mg/mL |
| mCD40-B washing medium | mCD40-B culture medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| D-MEM | |
D-MEM | |
| L-Glutamine | 580 μg/mL | L-Glutamine | 580 μg/mL |
| Glucose | 4.5 mg/mL | Glucose | 4.5 mg/mL |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| MEM | 0.1mM (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Miscellaneous Reagents:
| Reagent | Company | Order No |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco® | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco® | REF 41965 |
| Dulbecco´s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco® | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Cat No P02-015 |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
| Reagent | Company | Order No |
| Sterile pipette tips | Sarstedt | |
| 6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
| 50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
| Tissue culture flask | Sarstedt | Cat No 83.1813.002 |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
