从胚胎脊髓连合神经的解剖和文化
Summary
这个视频演示的方法来剖析和文化连合从E13大鼠脊髓背侧神经元。是有用的游离连合神经元轴突的生长和指导，研究细胞和分子机制。
Abstract
连合神经元已被广泛用于研究的内在机制，在胚胎脊髓发展的轴突指导。这些神经元的胞体位于脊髓背侧，其轴突遵循胚胎发育过程中的定型的轨迹。最初连合轴突项目的腹部朝向floorplate。越过中线后，这些轴突转向对大脑前部和项目。上述每个步骤是受几个指导线索的行动。连合神经元高度浓缩的文化，非常适合解决许多轴突寻路机制，包括车削实验，免疫组织化学和生物化学实验。在这里，我们描述的方法来剖析和文化连合从E13大鼠脊髓背侧神经元。首先，是孤立的脊髓和背条被解剖了。胰蛋白酶和机械破碎成细胞悬液，然后背的组织是分离的。神经元被镀上聚- L -赖氨酸镀膜玻璃盖玻片或组织培养皿。 30小时后<em>在体外</em>，大多数神经元轴突延长。文化的纯度（阴<em>等。</em> 2009），通常在90％以上，可评估，LH2连合神经元标记的DCC和TAG1（赫尔姆斯和约翰逊，1998年）免疫标记。这种神经元的准备是一个有用的工具<em>在体外</em>连合在轴突的生长和脊髓发展的指导细胞和分子机制的研究。
Protocol
Discussion
我们已经描述了一个方法来剖析和文化连合从胚胎大鼠脊髓神经元。这个程序已经在我们的实验室经常使用可靠准备的神经元的轴突导向的研究细胞和分子机制。细胞生物学和免疫组织化学实验，解剖一窝产生足够的神经元。当需要更多的细胞，如在许多生物化学实验，解剖两个窝可能是必需的。对于一个受过训练的人，可以进行清扫和分解〜20胚胎在不到4个小时。更长的时间范围内将导致一个?…
Acknowledgements
这项工作是支持的加拿大卫生研究院（CIHR），彼得Lougheed医学研究基金会，在Neuroengineering麦吉尔方案的补助金，全宗的RECHERCHE EN桑特魁北克（FRSQ），加拿大创新基金会（CFI ）。塞巴斯蒂安D.朗格卢瓦是硕士培训奖全宗支持DE LA RECHERCHE EN健康魁北克（FRSQ）和卫生研究所（CIHR）加拿大研究所加拿大研究生奖学金硕士奖由弗雷德里克班廷和查尔斯。我们感谢与数字援助杰西卡吨范。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
| B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
| L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
| Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
| DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
| MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
| HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
| L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
- E13 pregnancy-staged rat
- Ethanol 70%
- Surgical scissors, Fine Science Tools
- Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
- Petri dishes
- L-15 medium
- Dissection microscope, Leica
- Plastic transfer pipettes
- Microscissors, Fine Science Tools
- Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
- Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
- 15 ml plastic tubes
Commissural neuron culture (see also Table I)
- Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
- German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
- Poly-L-lysine, Sigma
- Sterile milliQ H2O
- Neurobasal, Invitrogen
- Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penicillin/Streptomycin antibiotics
- 37°C waterbath
- Sterile Pasteur Pipettes
- Bunsen gas burner
- HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO4
- Centrifuge
- Hemacytometer
- Trypan Blue Solution
References
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
- Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
- Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
