विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति
Summary
यह वीडियो एक विधि काटना और संस्कृति E13 चूहे पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी से commissural न्यूरॉन्स को दर्शाता है. Dissociated commissural न्यूरॉन्स अक्षतंतु विकास और मार्गदर्शन के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं.
Abstract
Commissural न्यूरॉन्स को व्यापक रूप से किया गया है भ्रूण रीढ़ की हड्डी के विकास के दौरान अक्षतंतु मार्गदर्शन अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया. इन न्यूरॉन्स सेल निकायों पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी में स्थित हैं और उनके axons भ्रूण विकास के दौरान टकसाली trajectories का पालन करें. Commissural axons शुरू floorplate की ओर ventrally परियोजना. Midline पार करने के बाद, इन axons मस्तिष्क की ओर बारी पूर्व से और परियोजना. इन कदमों के प्रत्येक कई मार्गदर्शन cues के कार्रवाई द्वारा विनियमित है. Commissural न्यूरॉन्स में अत्यधिक समृद्ध संस्कृतियों आदर्श कई मोड़ assays, immunochemistry और जैव रसायन सहित, अक्षतंतु pathfinding के तंत्र को संबोधित प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं. यहाँ, हम काटना और संस्कृति E13 चूहे पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी से commissural न्यूरॉन्स विधि का वर्णन करता है. सबसे पहले, रीढ़ की हड्डी अलग है और पृष्ठीय स्ट्रिप्स बाहर dissected कर रहे हैं. पृष्ठीय ऊतक तो trypsinization और यांत्रिक विघटन से एक सेल निलंबन में अलग है. न्यूरॉन्स पाली एल lysine लेपित गिलास coverslips या ऊतक संस्कृति व्यंजन पर चढ़ाया जाता है. 30 घंटे के बाद<em> इन विट्रो में</em> सबसे न्यूरॉन्स एक अक्षतंतु बढ़ाया है. संस्कृति की पवित्रता (रतालू<em> एट अल.</em>) 2009, आमतौर पर 90% से अधिक, commissural न्यूरॉन मार्करों डीसीसी, एलएच 2 और tag1 (हेल्म्स और जॉनसन, 1998) के साथ immunolabeling द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. इस neuronal तैयारी उपकरण के लिए एक उपयोगी है<em> इन विट्रो में</em> Commissural अक्षतंतु और रीढ़ की हड्डी के विकास के दौरान विकास और मार्गदर्शन के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन.
Protocol
Discussion
हम एक काटना और संस्कृति भ्रूण चूहे रीढ़ की हड्डी से commissural न्यूरॉन्स की विधि वर्णित है. इस प्रक्रिया को नियमित किया गया है, हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल करने के लिए मज़बूती से न्यूरॉन्स को तैयार अक्षतं?…
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा (CIHR), पीटर Lougheed मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, Neuroengineering में मैकगिल कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, डे Recherche एन SANTE डु (FRSQ) क्यूबेक, और अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI Fonds ). Sebastien डी. Langlois एक मास्टर Fonds से प्रशिक्षण पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया डे ला Recherche एन SANTE डु (FRSQ) क्यूबेक और फ्रेडरिक Banting और चार्ल्स द्वारा स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) की कनाडा के संस्थानों से सर्वश्रेष्ठ कनाडा ग्रेजुएट छात्रवृत्ति मास्टर पुरस्कार. हम जेसिका मीट्रिक टन फाम आंकड़ों के साथ सहायता के लिए आभारी हैं.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
| B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
| L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
| Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
| DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
| MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
| HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
| L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
- E13 pregnancy-staged rat
- Ethanol 70%
- Surgical scissors, Fine Science Tools
- Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
- Petri dishes
- L-15 medium
- Dissection microscope, Leica
- Plastic transfer pipettes
- Microscissors, Fine Science Tools
- Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
- Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
- 15 ml plastic tubes
Commissural neuron culture (see also Table I)
- Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
- German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
- Poly-L-lysine, Sigma
- Sterile milliQ H2O
- Neurobasal, Invitrogen
- Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penicillin/Streptomycin antibiotics
- 37°C waterbath
- Sterile Pasteur Pipettes
- Bunsen gas burner
- HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO4
- Centrifuge
- Hemacytometer
- Trypan Blue Solution
References
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
- Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
- Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
