1. Isolamento da parede celular moer cerca de 60-70mg de ar ou congelar material vegetal seco com 5,5 milímetros esferas de aço inoxidável em um tubo de tampa de 2ml Sarstedt parafuso usando um retschmill (1 min, 25 Hz). Uma alternativa, o uso de uma moagem de alto rendimento e distribuição iWall robô chamado é descrito na Parte I 3. remover as bolas de aço antes de continuar com o procedimento de isolamento da parede celular O protocolo detalhado da preparação do material da parede celular é apresentado na parte I 3. Para completar os passos aqui escritos do protocolo. adicionar 1,5 ml de 70% de etanol aquoso, e completamente vortex centrifugação a 10.000 rpm por 10 min para o resíduo de álcool pellet insolúvel Aspirar ou decantar o sobrenadante adicionar 1,5 ml de solução de clorofórmio / metanol (1:1 v / v) ao resíduo do tubo e agitar cuidadosamente para ressuspender o sedimento centrifugação a 10.000 rpm por 10 min e Aspirar ou decantar o sobrenadante ressuspender pellet em 500 ul de acetona evaporar o solvente com um fluxo de ar a 35 ° C até secar Se necessário amostras secas podem ser armazenadas em temperatura ambiente até ulterior processamento. Para iniciar a remoção do amido da amostra re-suspender o sedimento em 1,5 ml de 0,1 M sodiumacetate tampão pH 5.0. tampa dos tubos Sarstedt e calor durante 20 min. a 80 ° C em um bloco de aquecimento. legal da suspensão sobre o gelo adicione os seguintes agentes para o pellet: 35 mL de Azida de sódio 0,01% (NaN 3), 35 mL de amilase (50 μg/1mL H 2 O, a partir de espécies de Bacillus, SIGMA); 17 pululanase mL (18,7 unidades de acidopullulyticus bacilo; SIGMA) . Tampe o tubo e vortex completamente. A suspensão é incubado durante a noite a 37 ° C no shaker. Orientar os tubos na horizontal assessores melhorou mistura. suspensão de calor a 100 ° C por 10 min em um bloco de aquecimento para terminar a digestão. centrifugação (10.000 rpm, 10 min) e descarte de amido contendo sobrenadante solubilizados lavar o pellet restantes três vezes pela adição de 1,5 ml de água, vórtex, centriguation, e decantação da água de lavagem. ressuspender pellet em 500 ul de acetona evaporar o solvente com um fluxo de ar a 35 ° C até secar. Pode ser necessário também para quebrar o material no tubo com uma espátula para secar melhor. O material seco apresenta parede celular isolada (lignocelulose). Se necessário amostras secas podem ser armazenadas em temperatura ambiente até ulterior processamento. 2. Composição da matriz de polissacarídeo Este método é essencialmente uma modificação do método publicado pela Albersheim 1. Para determinar a composição monossacarídica do material da parede pesam 2 mg do material da parede celular em tubos de 2ml starstedt à mão ou em uma forma highthroughput usando o iWall, um robô robótico de moagem e pesagem. Adicionar 20 uL de uma solução de Inositol (5mg/ml) como padrão interno. Para uma amostra de 2 mg de parede celular recomenda-se adicionar 100 ug. lavar paredes do tubo com 250 ul de acetona para recolher o material da parede celular na parte inferior do tubo, e evaporar a acetona muito gentil com fluxo de ar. Para a hidrólise ácida fraca adicionar 250 ul de ácido trifluoroacético 2M (TFA) para cada amostra. Adicionar TFA cuidadosamente para garantir que nenhum material é espirrada para cima as paredes do tubo. tampa bem e incubar por 90 min a 121 ° C em um bloco de aquecimento. arrefecer os blocos de aquecimento e amostras no gelo. centrifugar os tubos a 10.000 rpm por 10 min. transferir 100 ul do sobrenadante ácido contendo o polissacarídeo derivada da matriz de monossacarídeo a um vidro frascos com tampa de rosca tomando cuidado para não perturbar o material da pelota. O pellet pode ser usado para o ensaio de celulose cristalina abaixo (ver 3). evaporar a TFA no tubo de vidro sob um fluxo suave de ar em um dispositivo de evaporação. adicionar 300 ml 2-Propanol, vortex e evaporar a 25 ° C (repetir para um total de três vezes) O primeiro passo do procedimento alditol acetato de derivatização é executar uma redução da monossacarídeos aos seus alditols correspondente. Para este efeito, adicionar 200 mL de uma solução de borohidreto de sódio para cada amostra seca. Prepare uma nova solução de cada vez usando 10 mg de borohidreto de sódio por 1 ml de hidróxido de amônio 1M. deixar frasco de vidro em temperatura ambiente por 1,5 horas neutralizar a solução, adicionando 150 ul de ácido acético glacial vortex e evaporar a 25 ° C. adicionar 250 mL de ácido vortex / metanol (1:9, v / v), acético e evaporar a 25 ˚ C adicionar 250 mL de metanol e evaporar sob corrente de ar (repetir para um total de três vezes) Para a acetilação do alditols, adicione 50 ul de anidrido acético e 50 ul de Pyridine vortex e incubar por 20 min a 121 ° C em um bloco de aquecimento. amostras fresco no bloco baixo com gelo, enquanto espera para diminuir a temperatura para cerca de temperatura ambiente. evaporar os reagentes sob uma ligeira corrente de ar à temperatura ambiente. Tenha cuidado: acetatos alditol são altamente voláteis. adicionar 200 mL de tolueno, e evaporar sob ar (x3) Nas etapas finais do acetatos alditol são extraídos. Primeiro, adicionar 500 ul de acetato de etila e agite levemente. adicionar 2 ml de água, tubos de tampa e vortex. tubos de centrífuga a 2.000 rpm por 5 min para obter claras camadas separadas (acetato de etila em cima, água em baixo) pipeta 50 ul da camada de acetato de etila em GC / MS frascos com inserções. diluir adicionando 100 ul de acetona para a GC frasco e tampa. O volume de amostra e os volumes de diluição pode ser ajustado para evitar sobrecarregar o GC / MS, se a concentração da amostra é demasiado elevado. O GC frasco pode ser armazenado a 4 ° C, se a análise GC / MS não se proceder imediatamente As amostras são injetadas em um GC que está equipado com um MS quadrupolo, mas um detector de ionização de chama também é adequado. A Supelco SP-2380 (30mm X 0,25 milímetros x 0,25 mM filme espessura) coluna é usada com um atraso 4min solvente e um fluxo de 1.5ml/min. Amostras injetadas são submetidos ao programa de temperatura seguinte: segure inicial a 160 ° C por 2 min, uma rampa de 20 ° C / min a 200 ° C e mantenha por 5 min, uma rampa de 20 ° C / min a 245 ° C e manter 12 min; pico a 270 ° C e mantenha por 5 min antes de resfriamento para a temperatura inicial de 160 ° C 2.26) Peaks são identificados por perfis de massa e / ou tempos de retenção dos padrões.. Monossacarídeos são quantificados com base em curvas padrão. 3. Conteúdo de celulose cristalina Este método é essencialmente descrito por Updegraf 8. Há uma série de materiais de partida para este procedimento: material de paredes celulares isoladas (ver 1) ou na parede de material que já foi tratado com TFA 2M (ver 2.8) ou o pellet restante imediatamente após o tratamento ácido (ver 2.8) ou um TFA pellet, que foi lavado com 2-propanol e secas. Adicionar ao pellet TFA no vidro tampado parafuso tubo 1 ml de reagente Updegraff (ácido acético: ácido nítrico: água, 08:01:02 v / v). Tubo de tampa bem vórtice, e calor em um bloco de aquecimento a 100 ° C por 30 min. Como resultado deste tratamento apenas celulose cristalina permanece insolúvel, no pellet. Amostras fresco no bloco com gelo para temperatura ambiente ou mais frios amostras centrifugue a 10.000 rpm por 15 min Elimine o sobrenadante garantir que o pellet não é perturbado e nenhum material do pellet é removido. Para este efeito, deixe aprox. 150 ul do sobrenadante do tubo. adicionar 1,5 ml de água, agitar, centrifugar e descartar o sobrenadante como feito acima repetir a lavagem procedimento 3 vezes mais usando 1,5 ml de acetona Ar seco pellet muito suavemente com o ar, ou deixe secar no banco durante a noite o pellet (celulose cristalina) está agora completamente hidrolisada em glicose pelo que é chamado de hidrólise Saeman. Para este efeito, adicionar 175 mL de ácido sulfúrico 72% para o tubo Sarstedt incubar à temperatura ambiente por 30 min vortex e incubar por mais 15 min adicionar 825 mL de água e vortex centrifugar amostras a 10.000 rpm por 5 min. Pode haver algum material marrom insolúvel, lignina, permanecendo no tubo. O teor de glicose do sobrenadante é analisada utilizando o ensaio colorimétrico antrona. Este ensaio é realizado em uma placa de microtitulação de 96 poços de poliestireno. Para a curva padrão de usar um estoque de glicose 1mg/ml (armazenado a 0 ° C) e criar duplicado 0, 2, 4, 6, 8, e 10 ug padrões pipetando 0, 2, 4, 6, 8, e 10 ul em bem apropriado em separado. Preencher cada ul bem até 100 com água. adicionar 10 ml de cada sobrenadante de amostra e 90 ml de água em celas separadas, mas na placa de microtitulação, mesmo que o padrão. adicionar 200 mL de Reagente antrona preparada na hora (antrona dissolvido em ácido sulfúrico concentrado, 2 mg antrona / ml de ácido sulfúrico) de calor de placas por 30 min a 80 ° C em um forno (dissipador de calor de alumínio). Amostras contendo glicose passar de amarelo para azul-esverdeada. deixe a placa fria para a temperatura ambiente e agitar vigorosamente. ler absorção de placa a 625 mm usando um leitor de placas de microtitulação. Glicose (e, portanto, conteúdo de celulose cristalina) é calculado com base na absorbância em comparação com a curva padrão estabelecido no mesmo prato. 4. Resultados representante Um exemplo de uma análise de parede é apresentado na Figura 2. Neste caso, álamo-tronco (madeira) foi analisada por vários procedimentos descritos na seção de protocolo. A matriz pocomposição lysaccharide é destacado por um cromatograma exemplo identificando o açúcar presente típico na parede celular das plantas, fucose, ramnose, xilose, arabinose, galactose, manose e glicose (eo inositol padrão interno). O principal componente hemicelulósico de álamo é xilana como demonstrado pelo conteúdo de xilose de alta. No entanto, a abundância destes açúcares pode variar dependendo do used4 matéria-prima. A glicose nesta análise é derivado do xiloglucano hemicelulose e celulose amorfa. Devido à análise dos dados pode ser apresentado como mol% ou ug / mg material da parede (ou peso seco). O conteúdo de celulose cristalina é auto-explicativo, pode-se esperar valores entre 20-50% do peso seco da parede. Com base nos resultados aqui apresentados e em I3 parte da composição lignocelulósica de álamo madeira é 21% de lignina, hemicelulose 30%, e 41% de celulose cristalina. O restante seria cinzas. Figura 1:. Muros Visão geral de análise lignocelulósicos Cell (lignocelulose) são isolados a partir de material vegetal bruto seco. O material da parede é então ponderado em alíquotas e subdividida para os ensaios diversos. Composição da matriz de polissacarídeo é estabelecido após o tratamento do material da parede por um ácido fraco (TFA 2M), derivatizing os monossacarídeos resultantes solubilizados a seus acetatos alditol, e análise por GC-MS. O resíduo do tratamento ácido fraco é lavado com o reagente Updegraff chamados deixando apenas de celulose insolúvel crystlline trás. A celulose é solubilizado pelo ácido sulfúrico e quantificados por um teste colorimétrico determinar o teor de glicose. Em paralelo, o conteúdo ea composição da lignina pode ser determinado conforme descrito na Parte I 3. Figura 2:. Fichas análise abrangente lignocelulósicos de madeira de álamo madeira de álamo (Populus tremoloides) foram submetidos ao protocolo descrito. Superior esquerdo: composição do polissacarídeo Matrix; Fuc fucose, ramnose Rha; Ara arabinose; XYL xilose; Man manose; Gal galactose; glicose Glc; padrão interno inositol.
