植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

Summary

植物バイオマスは、バイオ燃料の生産に使用できる主要なカーボンニュートラルな再生可能な資源です。植物バイオマスは、主に細胞壁、リグノセルロースと呼ばれる構造的に複雑な複合材料で構成されています。ここでは、壁由来の炭水化物の含有量と組成の包括的な分析のためのプロトコルについて説明します。

Abstract

産業と社会のための再生可能エネルギー、カーボンニュートラル、そして持続可能な原材料の必要性は、21世紀の最重要課題の一つとなっている。これは輸送用液体燃料の生産のための工業用原料としての植物製品の使用に関心を再燃させたている²このようなbiocomposite材料として他の製品⁶。植物バイオマスは地球上で最大の未開発の埋蔵量の一つである⁴。それは主にセルロース、様々なヘミセルロース、およびポリフェノールリグニンを含むエネルギーリッチなポリマーで構成されている細胞壁で構成されています⁵そのため、時にはリグノセルロースと呼ばれる。しかし、植物の細胞壁は、壁は強度とプラント全体の構造的完全性に広く貢献して劣化に手に負えないように進化してきた。その必要な剛性にもかかわらず、細胞壁は、代謝的に活性であり、そのような植物の成長や分化などの多くの細胞活動において重要な役割を果たしている非常に動的なエンティティです。⁵。壁の様々な機能が原因で、単一工場内の異なる植物種や細胞タイプの城壁内に巨大な構造の多様性がある⁴。したがって、作物種、作物​​の品種、又は植物組織がバイオリファイナリーのために使用されているものによっては、化学/酵素的プロセスと液体バイオ燃料への様々な糖のその後の発酵による解重合のための処理手順を調整し最適化する必要があります。この事実を支える植物のバイオマス原料の徹底した特性評価のための必要性。ここでは、リグノセルロースの組成の決定を可能にし、ハイスループット分析への培地（図1）を受けやすい包括的な分析方法を説明します。このメソッドはdestarched細胞壁の材料を準備してから始まります。結果として得られるリグノセルロースは、そのヘミセルロースの単糖類組成と他の行列polysaccharides1、及び結晶セルロースのその内容を決定するために分割されます⁷。リグノセルロース系バイオマスのリグニン成分を分析するためのプロトコルは、私はパートで説明されています³。

Protocol

1。細胞壁の分離挽く約60 – 70mgの空気またはretschmillを（1分、25 Hz）を使用して2ミリリットルザルスタットのスクリューキャップチューブで5.5 mm、ステンレス鋼ボールで乾燥植物材料を凍結。選択肢は、高スループットの研削やロボットと呼ばれるiWallを調剤の使用は、パートI 3に記載されています。 細胞壁の分離の手順を続行する前に鋼球を取り除く細胞壁の材料の準備の詳細なプロトコールは、第I部3に示されています。プロトコルの書かれた手順は、ここに完全を期すために。 1.5 70％エタノール水溶液のmlと徹底的に渦を追加するペレットに10分アルコール不溶性残渣を10,000 rpmで遠心分離上清を吸引したり、デカントするペレットを再懸濁するために残渣にクロロホルム/メタノール（1:1 v / v）の溶液1.5mlを加え、よくチューブを振る 10分間、10,000 rpmで遠心し、上清を吸引除去したり、デカントするアセトン500 ULでペレットを再懸濁します 35で空気の流れで溶剤を蒸発させる℃を乾燥するまで必要に応じて乾燥試料は、さらに処理するまで室温で保存することができます。 サンプル0.1 M sodiumacetate緩衝液pH 5.0を1.5 mlの再サスペンドペレットから澱粉の除去を開始する。 20分間ザルスタット管と熱を締めくくる。 80℃の加熱ブロックインチ氷の上に、懸濁液を冷却するペレットには、次のエージェントを追加：0.01％Sodiumazideの35μlの場合（NaN 3）を、35μlのアミラーゼ（50μg/1mLH 2 O、バチルス属から、SIGMA）、17μlのプルラナーゼ（菌のacidopullulyticusから18.7単位; SIGMA） 。チューブと徹底的にボルテックスにフタを。 懸濁液を37℃で一晩インキュベート°回転シェーカーでC。管を配向させる水平側近は改良混合。 100℃の熱サスペンション° C消化を終了するために加熱ブロックに10分間。 遠心（10,000 rpm、10分）とを含む上清を可溶化されたでんぷんを破棄 、1.5 mlの水を加えボルテックス、centriguation、および洗浄水をデカンテーションによって、残りのペレット3回洗浄する。 アセトン500 ULでペレットを再懸濁します乾燥するまで35℃の空気の流れ° Cで溶媒を蒸発させる。それはよりよい乾燥用スパチュラでチューブの材料を分割することも必要になる場合があります。 乾燥した材料は、単離された細胞壁（リグノセルロース）を提示。必要に応じて乾燥試料は、さらに処理するまで室温で保存することができます。 2。マトリックス多糖類組成このメソッドは本質的にAlbersheim 1によって公表された方法を変更したものです。 壁材の単糖組成を決定するには、手またはiWall、ロボット研削や計量ロボットを用いたハイスループットな方法のいずれかで2ミリリットルstarstedtチューブに細胞壁物質2mgの重量を量る。 内部標準としてイノシトール溶液（5mg/ml）の20μlのを追加。 2mgの細胞壁のサンプルでは、​​100μgのを追加することをお勧めします。 チューブの底に細胞壁の材料を収集し、空気の流れの下で非常に優しいアセトンを蒸発させるためにアセトン250 ULで管壁を洗う。 弱い酸加水分解のために各サンプルに2Mトリフルオロ酢酸（TFA）250 ulを加える。ない材料がチューブの壁にまで飛散されていないことを確認するために慎重にTFAを追加。 しっかりとキャップ、121で90分間インキュベート加熱ブロックのC。 氷上での加熱ブロックとサンプルを冷却します。 10分間10,000 rpmでチューブを遠心する。 ペレットの材料を邪魔しないようにして作るガラススクリューキャップバイアルに単糖由来のマトリックス多糖類を含有する酸性上清の100μlを移す。ペレットは、以下の結晶セルロースのアッセイに使用することができます（3を参照。） 蒸発装置内の空気の気流下でガラス管でTFAを蒸発させる。 300μlの2 – プロパノール、渦を追加し、25℃蒸発° C（合計3回の繰り返し） アルジトールアセテート誘導体化の手順の最初のステップは、それらに対応するアルジトールする単糖の還元を実行することです。この目的のために各乾燥した試料に水素化ホウ素ナトリウム溶液200μlを加える。新鮮な溶液を1M水酸化アンモニウム1mlのあたりの水素化ホウ素ナトリウムの10mgのを使用して、各時間を準備します。 1.5時間室温でガラスバイアルを残す氷酢酸150 ulを加えることによってソリューションを中和する 25渦と蒸発° C。 250μlの酢酸/メタノール（1:9、v / v）を、渦を追加し、25℃蒸発˚C （3回の合計のために繰り返す）250μlのメタノールを加え、そして空気の気流下で蒸発アルジトールのアセチル化のために、無水酢酸とピリジン50μlの50μlを加える121℃で20分間ジアミン、渦とインキュベートします加熱ブロックのC。 氷のブロックのクールダウンサンプルは、ほぼ室温に温度の低下を待っている間。 室温で空気中の穏やかな流れの下で試薬を蒸発させる。注意してください：アルジトールアセテート、揮発性の高いです。 空気の下で200μlのトルエンを追加し、蒸発させる（X3） 最後のステップではアルジトールアセテートが抽出されます。最初に、酢酸エチルと軽く渦を500 ulを加える。 水、キャップ管と渦の2 mlを加える。 明確な別のレイヤーを取得するために5分間2,000 rpmでチューブを遠心（上に酢酸エチル、底の水） インサート付きGC / MSバイアル​​に酢酸エチル層のピペット50μlの。 GC -バイアルとキャップにアセトン100 ulを加えることにより希釈する。サンプル濃度が高すぎると試料量と希釈のボリュームは、GC / MSの過負荷を避けるために調整することができます。 GC / MS分析が直ちに行われない場合、GC -バイアルは、4℃で保存することができますサンプルは、四重極MSが装備されているGCに注入し、しかし、水素炎イオン化検出器も適しています。スペルコSP – 2380（30ミリメートルX 0.25ミリメートル× 0.25μmの膜厚）の列が4分溶剤遅延と1.5ml/minの流量で使用されます。注入されたサンプルは、次の温度プログラムに供される：160時の初期ホールド℃で2分間、20℃〜200℃/分のランプ℃、5分間保持、20℃〜245℃/分のランプ° Cとホールド12分、270〜スパイク° Cおよび160 ° C 2.26の初期温度に冷却する前に5分間保持）ピークが基準の質量プロファイル及び/または保持時間で識別されます。。単糖類は、標準曲線に基づいて定量化されています。 3。結晶セルロースのコンテンツこのメソッドは本質的にUpdegraf 8で記述されています。隔離された細胞壁物質（1を参照）または既に2M TFA（2.8参照）のどちらか、残りのペレットすぐに酸処理後の（2.8参照）またはTFAで処理されている壁材：この手順のための出発物質は数多くあります2 – プロパノールで洗浄し、乾燥されたペレット、。 アップダグラフの試薬のスクリューキャップ付きガラス管1ミリリットル（：硝酸：水、午前8時01分02秒V / V酢酸）にTFAペレットに追加します。 100℃の加熱ブロックにしっかりとキャップチューブ、渦、および熱℃で30分間。この治療の結果として、唯一の結晶セルロースは、ペレットに不溶のまま。 室温やクーラーに氷の上にブロックでクールサンプル 15分間10,000 rpmでサンプルを遠心ペレットが乱れていないと削除されたペレットからの材料されていないことを確実に上清を捨てる。この目的のために約残す。チューブの上清の150μlを。 、遠心分離機を振る、水1.5mlを追加し、上記で行ったように上清を捨てる洗浄手順のアセトン1.5mlを用いてさらに3回繰り返す空気乾燥した空気と非常に穏やかにペレット、または一晩ベンチに乾燥させるペレットは、（結晶セルロース）Saemanの加水分解と呼ばれるもので、今グルコースに完全に加水分解される。この目的は、ザルスタットのチューブに175μlの72％の硫酸を加えるために別の15分間、30分間、渦とインキュベート室温でインキュベート 825μLの水と渦を追加する 5分間10,000 rpmでサンプルを遠心する。チューブに残っているいくつか茶色の不溶性物質、リグニン、あるかもしれません。 上清のグルコース含有量は、比色アントロンアッセイを用いてアッセイされる。このアッセイは96ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートで実行されます。 標準曲線は、1mg/mlグルコースの株式を（0 ° Cで保存されている）を使用して、0、2、4、6、8、10 ulのピペッティングして0、2、4、6、8、および10μgの規格を重複作成するための別の適切なウェルに。水で100μlを各ウェルに埋めます。 別々のセルに、標準のと同じマイクロタイタープレート上に各サンプルの上清10μlと水90 mlを加える。 作りたてのアントロン試薬（濃硫酸に溶解したアントロン、2 mgをアントロン/ mlの硫酸）の200μlを加える 80℃30分間熱板オーブンで° C（アルミのヒートスプレッダ）。グルコースを含む試料は黄色から青緑色に変わります。 室温にプレートが冷ますと徹底的に振る。 マイクロタイタープレートリーダーを用いて625ミリメートルで、プレートの吸収を読み取る。 グルコース（それゆえ、結晶セルロースの含有量）は同じプレート上で確立された標準曲線と比較して吸光度に基づいて計算されます。 4。代表的な結果壁の解析の例を図2に示す。この場合にはポプラの幹（木）は、プロトコルのセクションで概説、様々な手順で分析した。行列POlysaccharide組成物を植物細胞壁における典型的な砂糖の存在を識別する例のクロマトグラムで強調表示されている、フコース、ラムノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノースとグルコース（および内部標準イノシトール）。高キシロースの含有量によって示されるようにポプラの主要なヘミセルロース成分はキシランである。しかし、これらの糖の存在量は、原料のused4によって異なります。この分析でグルコースは、ヘミセルロースのキシログルカンとアモルファスセルロースから導出されます。分析によるデータは、モル％またはUG / mgの壁材（または乾燥重量）として提示することができます。結晶セルロースの含有量は自明である、一つの壁乾燥重量の20〜50％の間の値を期待することができます。ここに示された結果に基づいており、パートI3にポプラ​​材のリグノセルロース系組成は21％のリグニン、30％のヘミセルロース、および41％の結晶セルロースである。残りは灰になる。 図1：。リグノセルロースの分析の概要細胞壁（リグノセルロース）は、原油乾燥植物材料から分離されています。壁材は、アリコートに重み付けをし、様々なアッセイのために分割されます。マトリックス多糖組成物は、弱酸（2M TFA）と壁材を扱う彼らのアルジトールアセテートに結果の可溶化単糖類を誘導体化し、GC – MSによる分析の後に確立されます。弱い酸処理の残渣を背後のみ不溶性crystllineのセルロースを残し、いわゆるアップダグラフの試薬で洗浄する。セルロースを硫酸で溶解し、グルコースの含有量を決定する比色分析によって定量化される。パートI 3で説明したように並行して、リグニンの含有量と組成を決定することができます。 図2：ポプラ（ ポプラtremoloides）からポプラ樹木木材チップの包括的なリグノセルロースの分析は、記載されたプロトコールを行った。 左上：マトリックス多糖組成物;フコースフコース、RHAラムノース、荒アラビノース、キシロースXYL、マンノースマン、ギャルガラクトース、グルコースのグルコース、イノシトール内部標準。

Discussion

記載された方法は、リグノセルロース系植物バイオマスの組成の迅速な定量的評価を有効にしてください。方法は、すなわちマトリックス多糖類ヘミセルロースの糖組成、結晶セルロースの含有量を含むような材料の組成の決定が可能になります。お一人様、様々な分析手法のスループットが異なります。ここに記載されているプロトコルを使用して、20サンプルは、結晶セルロースの含有量のための行列の多糖組成物および30で処理することができます。データに最適な原料作物の定量的な性質のために、様々なまたは遺伝子型は、バイオ燃料生産のためのその適合性の観点で評価することができる。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Trifluoroacetic acid		Sigma-Aldrich	T6508
myo-Inositol		Sigma-Aldrich	I5125
Sodium Borohydride		Sigma-Aldrich	213462
Pyridine		J.T. Baker	3348-01
Acetic Anhydride		Sigma-Aldrich	320102
Spectromax Plus 384		Molecular Devices	Plus384
GC-MS		Agilent	7890A GC/5975C MSD
5.5mm Stainless Steel Balls		Salem Ball Company	(N/A)
96 well plate heat spreader		Biocision	Coolsink 96F
Retsch Mill		Qiagen	TissueLyser II
Heating block		Techne	Dri-block DB-3D
Sample concentrator		Techne	FSC400D