تنقية م. magneticum سلالة AMB - 1 بروتين المرتبطين Magnetosome MamAΔ41
Summary
ماما هي فريدة من نوعها Magnetosome البروتينات المرتبطة بها والتي كانت معروضة على المشاركة في تنشيط magnetosome. هنا نقدم بروتوكول تنقية ماما الحذف متحولة (MamAΔ41) من<em> م. magneticum</em> AMB – 1.
Abstract
البكتيريا Magnetotactic تضم مجموعة متنوعة من الكائنات المجهرية المائية التي تكون قادرة على توجيه نفسها على امتداد الحقول المغنطيسية. ويعتقد أن هذا السلوك للمساعدة في بحثهم عن بيئات مناسبة<em> (1)</em>. وتمنح هذه القدرة التي magnetosome ، والتحت خلوية عضية التي تتكون من سلسلة التجميع خطية من الدهون قادرة على حويصلات كل biomineralize وأرفق ~ 50 نانومتر من الكريستال أو المغنتيت greigite. وثمة عنصر مبدأ magnetosome التي كانت معروضة لتكون هناك حاجة لتشكيل حويصلات الوظيفية ماما. ماما هو وفيرة للغاية magnetosome المرتبطة البروتين الذي هو واحد من البروتينات المرتبطة magnetosome تتميز معظم<em> في الجسم الحي</em><em> (2-6)</em>. هذا المقال يركز على تنقية ماما ، والتي على الرغم من كونها درست<em> في الجسم الحي</em> ، لم يتم تحديد أي تفاصيل واضحة وظيفي أو هيكلي لذلك. واقترح أن تحليل المعلومات البيولوجية ماما هو تكرار رباعي tricopeptide (TPR) التي تحتوي على البروتين. TPR هو عزر الهيكلية موجودة كجزء من هذا القبيل أو تشكيل أكبر أضعاف في طائفة واسعة من البروتينات ، وأنها تخدم كنموذج للبروتين البروتين التفاعلات ويتوسط متعدد البروتين المجمعات<em> (7)</em>. ويشارك في TPRs المهام الحاسمة في العديد من عمليات الخلية حقيقية النواة عضية ومسارات كثيرة البكتيرية<em> (14/08).</em> ولكي نفهم ماما ، وهي فريدة من نوعها تحتوي على البروتين TPR ، مطلوب بروتين عالي النقاء ، كخطوة أولى. في هذه المقالة ، فإننا نقدم للبروتوكول لتنقية متحولة مستقرة الحذف ماما (MamAΔ41) من<em> م. magneticum</em> AMB – 1.
Protocol
Discussion
تنقية البروتين هو خطوة رئيسية في أي البروتينات الحيوية أو الدراسات البنيوية. لأن كل من البروتين هي فريدة من نوعها مع سلوكها ، ويحتاج المرء لتحديد خصائصه وتعديلها وفقا لذلك تنقية. وينبغي تحليل البروتين الهدف كخطوة أولى نحو تنقية استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية. يت?…
Acknowledgements
نعترف الدكتور أمير أهاروني لدعمه وجينو دافيدوف ، Grimberg نعوم وتشن غوتمان للحصول على المشورة وتعليقاتهم.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French Press | Equipment | Thermo scientific | FA-078A | |
| Pressure cell | Equipment | Thermo scientific | FA-032 | |
| Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall | Discovery 90SE | |
| Rottor | Equipment | Beckman | Ti60 | |
| Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman | BC-355618 | |
| 2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | BioRad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen | M0063428 | |
| Spectrophotometer | Equipment | Amersham Biosiences | Ultraspec 2100 pro | |
| Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
| Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 28-4062-64 | |
| Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 10025543 | |
| Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 17-1071-01 | |
| Centricon – Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius Stedim Biotech GmbH | VS1501 | |
| Table centrifuge | Equipment | Thermo scientific | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Equipment | Bruker Daltonics | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
| Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma | DN-25 | |
| Bovine Thrombin | Reagent | Fisher BioReagents | BP25432 | |
| Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
| Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M-3148 | |
| InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |
References
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes. Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).
- D’Andrea, L. D., Regan, L. TPR proteins: the versatile helix. Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).
- Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. l. r. i. c. h., F, . More than folding: localized functions of cytosolic chaperones. Trends Biochem Sci. 28, 541-547 (2003).
- Brocard, C., Hartig, A. Peroxisome targeting signal 1: is it really a simple tripeptide?. Biochim Biophys Acta. 1763, 1565-1573 (2006).
- Fransen, M., Amery, L., Hartig, A., Brees, C., Rabijns, A., Mannaerts, G. P., Van Veldhoven, P. P. Comparison of the PTS1- and Rab8b-binding properties of Pex5p and Pex5Rp/TRIP8b. Biochim Biophys Acta. 1783, 864-873 (2008).
- Baker, M. J., Frazier, A. E., Gulbis, J. M., Ryan, M. T. Mitochondrial protein-import machinery: correlating structure with function. Trends Cell Biol. 17, 456-464 (2007).
- Mirus, O., Bionda, T., von Haeseler, A., Schleiff, E. Evolutionarily evolved discriminators in the 3-TPR domain of the Toc64 family involved in protein translocation at the outer membrane of chloroplasts and mitochondria. J Mol Model. 15, 971-982 (2009).
- Gatsos, X., Perry, A. J., Anwari, K., Dolezal, P., Wolynec, P. P., Likic, V. A., Purcell, A. W., Buchanan, S. K., Lithgow, T. Protein secretion and outer membrane assembly in Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol Rev. 32, 995-1009 (2008).
- Tiwari, D., Singh, R. K., Goswami, K., Verma, S. K., Prakash, B., Nandicoori, V. K. Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host. J Biol Chem. 284, 27467-27479 (2009).
- Edqvist, P. J., Broms, J. E., Betts, H. J., Forsberg, A., Pallen, M. J., Francis, M. S. Tetratricopeptide repeats in the type III secretion chaperone, LcrH: their role in substrate binding and secretion. Mol Microbiol. 59, 31-44 (2006).
- Grunberg, K., Muller, E. C., Otto, A., Reszka, R., Linder, D., Kube, M., Reinhardt, R., Schuler, D. Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Appl Environ Microbiol. 70, 1040-1050 (2004).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 3839-3843 (2004).
- Okuda, Y., Fukumori, Y. Expression and characterization of a magnetosome-associated protein, TPR-containing MAM22, in Escherichia coli. FEBS Lett. 491, 169-173 (2001).
- Taoka, A., Asada, R., Sasaki, H., Anzawa, K., Wu, L. F., Fukumori, Y. Spatial localizations of Mam22 and Mam12 in the magnetosomes of Magnetospirillum magnetotacticum. J Bacteriol. 188, 3805-3812 (2006).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
