Rening av M. magneticum Sila AMB-1 Magnetosome Medverkande Protein MamAΔ41
Summary
Mamma är en unik Magnetosome tillhörande protein som visade sig vara involverad i magnetosome aktivering. Här presenterar vi rening protokollet för Mama radering mutant (MamAΔ41) från<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Abstract
Magnetotactic bakterier utgör en mångskiftande grupp vattenlevande mikroorganismer som har möjlighet att orientera sig längs geomagnetiska fält. Detta beteende tros Stödet sitt sökande efter lämpliga miljöer<em> (1)</em>. Denna funktion är knutna till magnetosome, blåsor en subcellulära organell som består av en linjär kedja montering av lipid varje möjlighet att biomineralize och bifoga en ~ 50-nm kristaller av magnetit eller greigite. En princip komponent i magnetosome som visat sig krävas för att bilda funktionella blåsor är mamma. Mamma är en mycket riklig magnetosome-associerad protein som är en av de mest kännetecknas magnetosome-associerade proteiner<em> In vivo</em><em> (2-6)</em>. Denna artikel fokuserar på rening av mamma, som trots studeras<em> In vivo</em> Har ingen tydlig funktionell eller strukturell information identifierats för det. Bioinformatik analys föreslog att mamma är en tetra-tricopeptide upprepa (TPR) som innehåller protein. TPR är en strukturell motiv finns som sådan eller som ingår i en större vik i ett brett spektrum av proteiner, fungerar den som en mall för protein-protein interaktioner och förmedlar flera proteinkomplex<em> (7)</em>. TPRs är inblandade i många viktiga uppgifter i eukaryota celler organell processer och många bakteriella vägar<em> (8-14).</em> För att förstå mamma, en unik TPR innehåller protein är renat protein krävs som ett första steg. I denna artikel presenterar vi reningen protokollet för en stabil Mama radering mutant (MamAΔ41) från<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Protocol
Discussion
Protein rening är det viktigaste steget i alla proteiner biokemiska eller strukturella studier. Eftersom varje protein är unik med sitt eget beteende måste man definiera dess egenskaper och ändra dess rening därefter. Protein mål bör analyseras som ett första steg mot rening med hjälp av bioinformatiska verktyg. De används för att beräkna målet iso-elektriska punkten, bedöma behovet av att minska / oxiderande miljön och dess behov av speciella joner / ligander. Det finns flera viktiga ändringar av våra …
Acknowledgements
Vi erkänner Dr Amir Aharoni för hans stöd och Geula Davidov, Noam Grimberg och Chen Guttman för deras råd och kommentarer.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French Press | Equipment | Thermo scientific | FA-078A | |
| Pressure cell | Equipment | Thermo scientific | FA-032 | |
| Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall | Discovery 90SE | |
| Rottor | Equipment | Beckman | Ti60 | |
| Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman | BC-355618 | |
| 2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | BioRad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen | M0063428 | |
| Spectrophotometer | Equipment | Amersham Biosiences | Ultraspec 2100 pro | |
| Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
| Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 28-4062-64 | |
| Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 10025543 | |
| Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 17-1071-01 | |
| Centricon – Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius Stedim Biotech GmbH | VS1501 | |
| Table centrifuge | Equipment | Thermo scientific | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Equipment | Bruker Daltonics | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
| Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma | DN-25 | |
| Bovine Thrombin | Reagent | Fisher BioReagents | BP25432 | |
| Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
| Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M-3148 | |
| InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |
References
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes. Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).
- D’Andrea, L. D., Regan, L. TPR proteins: the versatile helix. Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).
- Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. l. r. i. c. h., F, . More than folding: localized functions of cytosolic chaperones. Trends Biochem Sci. 28, 541-547 (2003).
- Brocard, C., Hartig, A. Peroxisome targeting signal 1: is it really a simple tripeptide?. Biochim Biophys Acta. 1763, 1565-1573 (2006).
- Fransen, M., Amery, L., Hartig, A., Brees, C., Rabijns, A., Mannaerts, G. P., Van Veldhoven, P. P. Comparison of the PTS1- and Rab8b-binding properties of Pex5p and Pex5Rp/TRIP8b. Biochim Biophys Acta. 1783, 864-873 (2008).
- Baker, M. J., Frazier, A. E., Gulbis, J. M., Ryan, M. T. Mitochondrial protein-import machinery: correlating structure with function. Trends Cell Biol. 17, 456-464 (2007).
- Mirus, O., Bionda, T., von Haeseler, A., Schleiff, E. Evolutionarily evolved discriminators in the 3-TPR domain of the Toc64 family involved in protein translocation at the outer membrane of chloroplasts and mitochondria. J Mol Model. 15, 971-982 (2009).
- Gatsos, X., Perry, A. J., Anwari, K., Dolezal, P., Wolynec, P. P., Likic, V. A., Purcell, A. W., Buchanan, S. K., Lithgow, T. Protein secretion and outer membrane assembly in Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol Rev. 32, 995-1009 (2008).
- Tiwari, D., Singh, R. K., Goswami, K., Verma, S. K., Prakash, B., Nandicoori, V. K. Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host. J Biol Chem. 284, 27467-27479 (2009).
- Edqvist, P. J., Broms, J. E., Betts, H. J., Forsberg, A., Pallen, M. J., Francis, M. S. Tetratricopeptide repeats in the type III secretion chaperone, LcrH: their role in substrate binding and secretion. Mol Microbiol. 59, 31-44 (2006).
- Grunberg, K., Muller, E. C., Otto, A., Reszka, R., Linder, D., Kube, M., Reinhardt, R., Schuler, D. Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Appl Environ Microbiol. 70, 1040-1050 (2004).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 3839-3843 (2004).
- Okuda, Y., Fukumori, Y. Expression and characterization of a magnetosome-associated protein, TPR-containing MAM22, in Escherichia coli. FEBS Lett. 491, 169-173 (2001).
- Taoka, A., Asada, R., Sasaki, H., Anzawa, K., Wu, L. F., Fukumori, Y. Spatial localizations of Mam22 and Mam12 in the magnetosomes of Magnetospirillum magnetotacticum. J Bacteriol. 188, 3805-3812 (2006).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
