ביטוי של חלבונים רקומביננטי השמרים Methylotrophic Pichia pastoris</em
Summary
הפרוטוקול מתאר ביטוי חלבון באמצעות שמרים methylotrophic<em> Pichia pastoris</em>. הכנת תאים שמרים electrocompetent, טרנספורמציה של וקטור עם הגן של עניין אל<em> פ ' pastoris</em> ו-DNA טיהור שמרים מבוצעות גם. ניתוח המערבי כתם וטיהור חלבונים בונים את הצעדים האחרונים בפרוטוקול זה ביטוי חלבון.
Abstract
ביטוי החלבון על pastoris Pichia חיידקים אוקריוטים לארח מציעה את האפשרות לייצר כמויות גדולות של חלבון רקומביננטי במערכת ביטוי מהירה וקלה לשימוש.
בתור מיקרואורגניזם חד תאיים P. pastoris קל לתפעל גדל במהירות על מדיה זולה בצפיפויות גבוהות התא. להיות eukaryote, פ pastoris הוא מסוגל לבצע רבים שלאחר translational שינויים שבוצעו על ידי התאים האיקריוטים גבוהה את החלבונים רקומביננטי שהושגו לעבור קיפול חלבונים, עיבוד פרוטאוליטי, היווצרות קשר דיסולפיד glycosylation ו [1].
כפי שמרים פ methylotrophic pastoris מסוגל חילוף חומרים מתנול כמקור פחמן הבלעדי. האמרגן חזק מונואמין אלכוהול, AOX1, מוסדר בחוזקה המושרה על ידי מתנול הוא משמש הביטוי של הגן של עניין. לפיכך, הביטוי של חלבון זר יכול להיגרם על ידי הוספת מתנול עד בינוני הצמיחה [2, 3].
יתרון חשוב נוסף הוא הפרשת חלבון רקומביננטי לתוך מדיום גידול, תוך שימוש ברצף אות למקד את החלבון זרים מסלול הפרשה של pastoris פ. רק עם רמות נמוכות של חלבון אנדוגני המופרש לתקשורת על ידי שמרים עצמו ולא חלבונים להוסיף התקשורת, חלבון Heterologous בונה את רוב החלבון הכולל במדיום ומקל על הצעדים הבאים טיהור חלבון [3, 4].
וקטור משמש כאן (pPICZαA) מכיל את מקדם AOX1 לביטוי מוסדר היטב מתנול-Induced, של הגן של ריבית; האות α-factor עבור הפרשת הפרשת חלבון רקומביננטי, גן עמידות Zeocin לבחירה בשני E. coli ו Pichia ו פפטיד C-מסוף המכיל את c-myc epitope ו (6xHis) polyhistidine תג זיהוי וטיהור של חלבון רקומביננטי. אנחנו גם מראים ניתוח כתם המערבי של חלבון רקומביננטי באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד myc-HRP הכרה epitope c-myc על וקטור האב.
Protocol
Discussion
ביטוי חלבון באמצעות pastoris methylotrophic Pichia שמרים כמערכת המארחת מתואר בפרוטוקול זה. חלבון יכול להיות מופרש לתוך המדיום בהתאם וקטור שיבוט בשימוש. הפרשת חלבון רקומביננטי הופך את טיהור הבאים קל. עם זאת, התנאים המוצג יכול להיות מותאם במיוחד הביטוי של חלבונים שונים וש?…
Acknowledgements
ברצוננו להודות לקרן קנדית עבור חדשנות, פיתוח קולומביה הבריטית קרן ידע, לבין המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) לתמיכה בעבודה זו. MT נתמך על ידי מענק ממרכז טולה היסוד במימון עבור גיוון התפתחות חיידקים (CMDE).
References
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
