Expressie van recombinante eiwitten in het methylotrofe gist Pichia pastoris</em
Summary
Het protocol beschrijft het gebruik van de eiwitexpressie methylotrofe gist<em> Pichia pastoris</em>. De voorbereiding van elektrocompetente gistcellen, transformatie van de vector met het gen van interesse in<em> P. pastoris</em> En gist DNA-zuivering zijn ook uitgevoerd. Western blot analyse en eiwit zuivering te bouwen de laatste stappen in dit eiwit expressie protocol.
Abstract
Eiwitexpressie in de microbiële eukaryotische gastheer Pichia pastoris biedt de mogelijkheid om grote hoeveelheden recombinant eiwit te genereren op een snelle en eenvoudig te gebruiken expressie systeem.
Als een eencellige micro-organisme P. pastoris is gemakkelijk te manipuleren en groeit snel op goedkope media bij hoge celdichtheden. Omdat een eukaryoot, P. pastoris is in staat om vele van de post-translationele modificaties uitgevoerd door hogere eukaryotische cellen en de verkregen recombinante eiwitten ondergaan het vouwen van eiwitten, proteolytische verwerking, disulfidebinding vorming en glycosylatie [1].
Als een methylotrofe gist P. pastoris is in staat van metaboliserende methanol als enige koolstofbron. De sterke promotor voor alcohol oxidase, AOX1, wordt strak gereguleerd en veroorzaakt door methanol en het wordt gebruikt voor de expressie van het gen van belang. Bijgevolg kan de expressie van het vreemde eiwit geïnduceerd worden door het toevoegen van methanol aan het groeimedium [2, 3].
Een ander belangrijk voordeel is de afscheiding van het recombinante eiwit in het groeimedium, met behulp van een signaalsequentie voor de vreemde eiwitten te richten op de secretieroute van P. pastoris. Met slechts lage niveaus van endogene eiwit afgescheiden aan de media door de gist zelf en geen toegevoegde eiwitten aan de media, een heteroloog eiwit bouwt het grootste deel van de totale hoeveelheid eiwit in het medium en faciliteert volgende eiwit zuiveringsstappen [3, 4].
De hier gebruikte vector (pPICZαA) bevat de AOX1 promotor voor strak geregeld, methanol-geïnduceerde expressie van het gen van belang, de α-factor secretie signaal voor secretie van het recombinante eiwit, een Zeocin resistentiegen voor selectie in zowel E. coli en Pichia en een C-terminale peptide met de c-myc epitoop en een polyhistidine (6xHis) tag voor detectie en zuivering van een recombinant eiwit. We laten ook zien western blot-analyse van het recombinante eiwit met behulp van de specifieke anti-myc-HRP antilichaam dat de c-myc epitoop op de bovenliggende vector.
Protocol
Discussion
Eiwitexpressie het gebruik van de methylotrofe gist Pichia pastoris als host systeem is beschreven in dit protocol. Het eiwit kan worden uitgescheiden in het medium afhankelijk van de gebruikte kloneringsvector. De afscheiding van het recombinante eiwit maakt de daaropvolgende zuivering eenvoudiger. Kan echter de getoonde voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor de expressie van verschillende eiwitten en veranderingen in de voorwaarden en expressie tijden kan leiden tot verhoogde eiwit-niveaus. De vector …
Acknowledgements
We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds, en de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) bedanken voor de ondersteuning van dit werk. MT werd ondersteund door een beurs van de TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie (CMDE).
References
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
