הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח
Summary
נוהל זבול<em> Xenopus ביציות</em> לפי שיטת העברת המארח.
Abstract
הלומד את תרומתה של מולקולות בירושה אימהי על התפתחות החולייתנים הראשונים נפגעת לעתים קרובות על ידי הזמן וההוצאות הדרושים כדי ליצור חיות השפעה אימהית מוטנטי. בנוסף, רבים של טכניקות כדי overexpress או לעכב תפקוד הגן באורגניזמים כגון Xenopus ו דג הזברה מצליחים מספיק יעד קריטי מסלולי איתות אימהית, כגון איתות Wnt. ב Xenopus, מניפולציה לתפקד גנים ביציות בתרבית ולאחר מכן זבול אותם ניתן לשפר את הבעיות הללו במידה מסוימת. ביציות הן defolliculated ידני מרקמת השחלה התורם, הזריק או מטופל בתרבות כפי הרצוי, מגורה אז עם פרוגסטרון כדי לזרז הבשלה. לאחר מכן, ביציות הן הציג לתוך חלל הגוף של צפרדע מארח הביוץ הנשי, ואז הם יהיו translocated דרך oviduct של המארח ולרכוש שינויים ומעילים ג'לי הכרחי הפריה. עוברים שהתקבל לאחר מכן ניתן להעלות לבמה הרצוי ניתחו את ההשפעות של כל הפרעות ניסיוני. שיטה זו המארח להעביר כבר יעיל מאוד בחשיפת המנגנונים הבסיסיים של ההתפתחות המוקדמים, ומאפשר מגוון רחב של אפשרויות ניסיוני אינו זמין בכל אורגניזם מודל חוליות אחרים.
Protocol
Discussion
העברה מוצלחת תגרום דישון מחשוף נורמלי של 50%> של ביציות (איור 3). בדרך כלל בין 30-60% של ביציות הועבר ישרדו בעבר בשלבים neurula. אנחנו בדרך כלל להעביר 75-150 ביציות לכל קבוצת הניסוי, אשר תניב עוברים מספיק מספר סוגים של ניתוח (באתרו, RT-PCR) וכן לדמיין את הפנוטיפ. השתלת ביציות באופן מש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים חברי הודות המעבדה יוסטון לקריאה ביקורתית של כתב היד. המחקר נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (GM083999) הוענק DWH
Materials
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
| 70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine) | (Invitrogen 11415-064) |
| 0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V) | (Sigma A-9418-50g) |
| 1x Penicillin-Streptomycin | (Sigma P-0781) |
| Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH | |
| Make fresh weekly, store at 18°C. | |
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
| 1M NaCl |
| 20 mM KCl |
| 20 mM CaCl2 |
| 10 mM MgCl2 |
| 150 mM HEPES |
| adjust to pH 7.6-7.8 |
| Store at 4°C |
Anesthetic solution
| 1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) | (Sigma A-5040) |
| 0.7 g/L sodium bicarbonate | |
| Dissolve in Amquel-treated water | |
| Make fresh weekly | |
Progesterone stocks
| 10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol |
| Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution |
| Store at -20°C |
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
| Blue: 0.1% Nile Blue A | (Aldrich 121479-5G), |
| Red: 0.25% Neutral Red | (Sigma N-6634), |
| Brown: 1% Bismarck Brown | (Sigma B-2759), |
| Green (80 μl blue + 80 μl brown), | |
| Mauve (80 μl blue + 80 μl red). | |
| A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown. | |
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.
References
- Brun, R. Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis. Experientia. 31, 1275-1276 (1975).
- Elinson, R. P., Pasceri, P. Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos. Development. 106, 511-518 (1989).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro. Development. 100, 735-743 (1987).
- Houston, D. W., King, M. L. A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus. Development. 127, 447-456 (2000).
- Mir, A., Heasman, J. How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique. Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).
- Rugh, R. . Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).
- Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles. Dev Biol. 17, 627-643 (1968).
- Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. Oogenesis and oocyte isolation. Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).
- Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos. Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).
- Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. Maternal beta-catenin establishes a ‘dorsal signal’ in early Xenopus embryos. Development. 122, 2987-2996 (1996).
- Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos. Cell. 94, 515-524 (1998).
- Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).
