تشريح المنظم وExplants القطب الحيواني من أجنة القيطم المورق وجمعية خلية الفحص الالتصاق
Summary
هذا الفيديو يوضح التقنية المستخدمة لإعداد منظم وexplants قطب من أجنة الحيوانات القيطم المورق ، بما في ذلك استخدام السكين الحاجب — أداة تشريح المتخصصة مصنوعة من الحاجب واحد. ويرد أيضا على بروتوكول لتجميع an مقايسة الالتصاق ، والتي تحقيقات عن وجود جزيئات الالتصاق الرئيسية موجودة على سطح منظم أو خلايا القطب الحيوانية التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق التنمية السليمة.
Protocol
تستعد الدوائر الالتصاق (قبل يوم من الحقن / تشريح) غرف الفحص التصاق إذا كان لديك مجهر مركب تقليدي (بصري يقع فوق خشبة المسرح) ، فمن ncecessary لجعل منخفضة الارتفاع التصاق الغرفة على النحو التالي. إذا باس?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x MBS-H | Buffer | Modified Barth’s medium: 1L recipe 5.14g NaCl 75mg KCl 0.2g NaHCO3 0.2g MgSO4•7H2O 60mg CaCl2•2H2O 80mg Ca(NO3)2•4H2O 2.38g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave. | ||
| CMF-MBS | Buffer | This is Ca2+/Mg2+-free version of MBS-H. 500ml recipe : 2.57g NaCl 37.5mg KCl 0.1g NaHCO3 1.19g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave. | ||
| 1% agarose/1x Barth’s plates | as many as the number of samples | |||
| 1% agarose/CMF-MBS plates | as many as the number of samples | |||
| E-Cadherin/Fc chimera | Reagent | Sigma | E-2278 | Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution. |
| Fibronectin, 0.1% solution | Reagent | Sigma | F-1141 | This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results. |
| 4% BSA /MBS-H | Buffer | BSA: molecular biology grade fraction V | ||
| Sigmacoted yellow tips | Tool | |||
| No.1 cover slips | 40x24mm or 60x24mm | |||
| Press-to-seal silicon insulator | Tool | Glace Bio-Labs | JTR20-2.5 | 2.5mm depth x 20mm diameter |
| NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass | Tool | Fisher | 12-565-471 | 2wells/slides |
| Grid slide glass | Tool | or Finder graticule for cell counting |
Cite This Article
Ogata, S., Cho, K. W. Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay. J. Vis. Exp. (3), e187, doi:10.3791/187 (2007).