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Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Published: April 29, 2007
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Dieses Video zeigt die Technik für die Herstellung von Veranstalter und animalen Pol Explantaten aus Xenopus laevis Embryonen, einschließlich der Verwendung der Augenbraue Messer eingesetzt – ein spezialisiertes Werkzeug Dissektion einer Augenbraue gemacht. Das Protokoll zur Montage eines Adhäsionsassay ist auch gegeben, die Sonden für die Präsenz der wichtigsten Adhäsionsmoleküle auf der Oberfläche Veranstalter oder animalen Pol Zellen, die entscheidend für die richtige Entwicklung vorhanden sind.

Protocol

Vorbereitung Adhesion Chambers (der Tag vor der Injektion / Dissektion) Adhesion Assay Chambers Wenn Sie eine herkömmliche zusammengesetzte Mikroskop (optisch lokalisiert über der Bühne) haben, ist es ncecessary um eine niedrige Bauhöhe Haftung Kammer wie folgt. Bei Verwendung des invertierten-Optik Mikroskop, dann "NUNC Lab-Tek Chambered Deckglas" kann nur verwendet werden, und überspringen Sie die Schritte # 1 bis 2. Bringen Sie eine der …

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
1x MBS-H Buffer     Modified Barth’s medium: 1L recipe 5.14g NaCl 75mg KCl 0.2g NaHCO3 0.2g MgSO4•7H2O 60mg CaCl2•2H2O 80mg Ca(NO3)2•4H2O 2.38g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS Buffer     This is Ca2+/Mg2+-free version of MBS-H. 500ml recipe : 2.57g NaCl 37.5mg KCl 0.1g NaHCO3 1.19g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
1% agarose/1x Barth’s plates       as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates       as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera Reagent Sigma E-2278 Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution Reagent Sigma F-1141 This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H Buffer     BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips Tool      
No.1 cover slips       40x24mm or 60x24mm
Press-to-seal silicon insulator Tool Glace Bio-Labs JTR20-2.5 2.5mm depth x 20mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass Tool Fisher 12-565-471 2wells/slides
Grid slide glass Tool     or Finder graticule for cell counting
check_url/187?article_type=t

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Cite This Article
Ogata, S., Cho, K. W. Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay. J. Vis. Exp. (3), e187, doi:10.3791/187 (2007).

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