Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק
Summary
Microdissection לייזר יושמה כדי לנתח את הביטוי פרופיל גנטי בתאים מסוימים של הדיסק כנף תסיסנית נתון RNAi מקומי<em> In vivo</em>. RNA המופק אזורים המקבילה של תאים הושתק unsilenced נותח על ידי RT-PCR כמותי כדי לקבוע פרופיל השוואתי ביטוי גנים בהקשר של microecology רקמות הילידים.
Abstract
טבע הטרוגניות של רקמות הוכיחה להיות גורם מגביל בסכום של מידע ניתן להפיק מן דגימות ביולוגיות, להתפשר על מנתח במורד הזרם. בהתחשב עמותות הסלולר מורכב ודינמי הקיימים בתוך רקמות רבות, על מנת לשחזר את הניתוח באינטראקציות vivo מולקולרית יסודי אחד חייב להיות מסוגל לנתח אוכלוסיות תאים ספציפיים בהקשר הטבעי שלהם. לייזר בתיווך microdissection יכולים להשיג מטרה זו, המאפשרת זיהוי חד משמעי וקציר מוצלח של תאים בעלי עניין תחת להדמיה מיקרוסקופית ישירה תוך שמירה על שלמות מולקולרית. יש לנו ליישם את הטכנולוגיה הזאת כדי לנתח ביטוי גנים באזורים מוגדרים של הדיסק בפיתוח האגף תסיסנית, המייצג את מערכת מודל יתרון ללמוד לשלוט צמיחה, התמיינות תאים ו organogenesis. הדיסקים מחולקים דמותי הזחל מפותח על ידי גבולות הגבלה השושלת לתאים הקדמי ואת האחורי, הגבי ו הגחון. עשיית שימוש של ועין מתנהלת GAL4-כטב"מ ביטוי בינארי המערכת, כל אחד תאים אלה יכולים להיות מתויג במיוחד זבובים מהונדס המבטא כטב"מ-GFP transgene בשליטת המתאים GAL4 נהג לבנות. ב הדיסקים מהונדס, ביטוי גנים פרופיל של תת דיסקרטית של תאים יכול להיקבע בדיוק אחרי microdissection לייזר בתיווך, באמצעות אותות ה-GFP ניאון מדריך לחתוך לייזר.
בין מגוון של יישומים במורד הזרם, אנו מתמקדים פרופיל תעתיק הרנ"א לאחר מקומי התערבות RNA (RNAi). עם כניסתו של RNAi הטכנולוגיה, GFP תיוג יכול להיות בשילוב עם מציאה מקומי של גן מסוים, המאפשר דטרמיניסטיות תעתיק את התגובה של האוכלוסייה תא בדידים כדי להשתיק את הגן הספציפי. כדי לאמת גישה זו, ניתחנו אזורים המקבילה של הדיסק מן האחורי (מסומן על ידי ביטוי של GFP), ואת תא קדמי (תווית) על השתקה אזורי בתא P של הגן אחרת לידי ביטוי בכל מקום בגוף. RNA הופק מאזורים הושתק unsilenced microdissected ואת הגן השוואתי הביטוי פרופיל נקבע על ידי כמותי בזמן אמת RT-PCR. אנו מראים כי בשיטה זו יכול למעשה להיות מיושם עבור transcriptomics מדויק של תת קבוצות של תאים בתוך הדיסקים דמותי תסיסנית. ואכן, תוך הכנת דיסק מסיבי כמקור של RNA בדרך כלל מניחה הומוגניות התא, זה ידוע היטב כי הביטוי תעתיק יכול להשתנות במידה רבה בתוך מבנים אלה עקב מידע מיקומית. בעזרת ה-GFP מקומי אות ניאון מדריך לחתוך לייזר, ניתוחים תעתיק מדויק יותר ניתן לבצע ויישומי רווחי ליישומים שונים, כולל פרופיל תמליל של שושלות תאים נפרדים בהקשר הטבעי שלהם.
Protocol
Discussion
לגבי רמות הבסיס שלהם ביטוי להשיג התאים קדמית / אחורית של דיסקים כנף unsilenced, הפעילות של הגן X שנבחר נמצא מופחת 40% על ההשתקה. לעומת זאת, אחת המטרות המשוערת שלה (גנים Y) נמצא באופן משמעותי מעלה מוסדר (7 מתקפלת עליה), מוביל אותנו כדי לאמת את ההשערה כי זה היה מוסדר באופן שלילי על ?…
Acknowledgements
המחברים מודים פרופ. קיארה קמפנלה ואת עמרה מרכז כשירות, אוניברסיטת נאפולי פדריקו השני, נאפולי, איטליה, למתן אותם עם השימוש microdissector לייזר, ומר נצו Vicidomini לעזרה נדיבה אנימציה 3D.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DEPC water | Sigma | W4502 | ||
| RNase Zap | Sigma | R2020 | ||
| TRI Reagent | Sigma | T9424 | ||
| SuperScript III | Invitrogen | 18080093 | ||
| Master Mix | Invitrogen | 11761100 | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | ||
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | ||
| Chloroform | Sigma | C7559 | ||
| Dream taq | Fermentas | EP0701 |
Fly strains
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA).
Equipment
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5).
Tools
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
References
- Elliott, D. A., Brand, A. H., Dahmann, C. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. , (2008).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. . Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).
- Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).
- Martin, F. A., Morata, G. Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc. Development. 133, 4421-4426 (2006).
- Tabata, T. Genetics of morphogen gradients. Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).
- Moreno, E. &. a. m. p. ;. a. m. p., Basler, K. dMyc transforms cells into super-competitors. Cell. 117, 117-129 (2004).
