Scatter microscopia ottica Sulla base bidimensionale Filtri di Gabor

Summary

Noi dimostrare un campo scuro metodo di microscopia in base a Gabor-come filtro per misurare la dinamica sub-cellulari all'interno delle cellule viventi singolo. La tecnica è sensibile alle alterazioni nella struttura degli organelli, quali la frammentazione mitocondriale.

Abstract

Si dimostra uno strumento microscopici in grado di misurare struttura subcellulare derivanti dalla morfologia degli organelli e organizzazione all'interno delle cellule viventi senza macchia. Lo strumento proposto estende la sensibilità di etichetta senza microscopia ottica a cambiamenti nelle dimensioni degli organelli nanoscala e la forma e può essere utilizzato per accelerare lo studio della relazione struttura-funzione degli organelli dinamiche relative alla base dei processi biologici fondamentali, come la morte cellulare programmata o cellulare differenziazione. Il microscopio può essere facilmente implementata su piattaforme microscopia esistenti, e può quindi essere diffusi ai laboratori, dove gli scienziati possono implementare e utilizzare i metodi proposti con accesso illimitato.

La tecnica proposta è in grado di caratterizzare la struttura subcellulare osservando la cellula attraverso filtri ottici bi-dimensionale Gabor. Questi filtri possono essere sintonizzati con senso su scala nanometrica (10 di nm) sensibilità, specifici attributi morfologici riguardanti le dimensioni e l'orientamento di organuli subcellulari non sferiche. Mentre in base al contrasto generato dalla diffusione elastica, la tecnica non si basa su un modello dettagliato scattering inverso o sulla teoria di Mie per estrarre le misurazioni morfometriche. Questa tecnica è quindi applicabile alle obbligazioni extracontrattuali sferiche organelli per i quali una descrizione precisa dispersione teorica non è facilmente dato, e fornisce distintivo parametri morfometrici che possono essere ottenuti all'interno di cellule viventi senza macchia per valutare la loro funzione. La tecnica è vantaggiosa in confronto con l'elaborazione digitale delle immagini, nel senso che opera direttamente sul campo dell'oggetto trasformare piuttosto che l'intensità dell'oggetto discretizzato è. Non si basa su alti tassi di campionamento delle immagini e può quindi essere usata per selezionare rapidamente l'attività morfologica all'interno di centinaia di cellule alla volta, facilitando in tal modo lo studio della struttura degli organelli organello di là di singoli segmentazione e ricostruzione di microscopia confocale di fluorescenza molto ingrandito le immagini digitali del campo di visuale limitato.

In questa dimostrazione si mostrano i dati da una diatomea marina per illustrare la metodologia. Mostriamo anche i dati preliminari raccolti da cellule viventi per dare un'idea di come il metodo può essere applicato in un contesto rilevante biologico.

Protocol

1. Come le cellule pronte Le cellule che sono stati placcati il ​​giorno prima deve essere etichettato con il verde Mitotracker per l'imaging di fluorescenza dei mitocondri. Rimuovere 100 soluzione madre di verde Mitotracker mM in DMSO fatte precedentemente dal 4 ° C freezer, e la temperatura ambiente con la mano. Altresì stipulare bovina cellule endoteliali aortiche (BAEC) terreno di coltura cellulare anche precedentemente preparato e caldo a 37 ° C in bagnomaria da banco. Una …

Discussion

Il metodo sopra descritto produce mappe morfometriche dell'oggetto che possono codificare la dimensione delle particelle o di orientamento per esempio. Queste informazioni strutturali possono essere utilizzati in diversi modi:

1. Può essere utilizzato come una schermata iniziale per identificare le regioni tessuti o cellule che sono state modificate nel corso di un trattamento specifico e poi analizzare ulteriormente queste regioni, con specifiche analisi molecolari e biochimici.
2. Può essere uti…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM		Invitrogen		Low glucose DMEM
Liebowitz L15 medium		Invitrogen		Without phenol red
L-glutamine		Invitrogen
Mitotracker Green		Invitrogen
Bovine Brain Extract		Clonetics
Fetal Bovine Serum		Gemini Biosciences
Heparin		Sigma
Staurosporine		Sigma
Dymethylsulfoxide		Sigma
Inverted microscope		Carl Zeiss	Axiovert 200M
DMD		Texas Instruments	TI 0.7 XGA DMD 1100
CCD		Roper Scientific	Cascase 512B	High (16 bit) dynamic range CCD
CCD		Roped Scientific	Coolsnap cf