هذا الفيديو يبين تحليل التجارب مع لاحقة من البروتين البروتين التفاعلات عن طريق استخدام الصغرى منقوشة السطوح. النهج توفر إمكانية الكشف عن تفاعلات البروتين في الخلايا الحية ، ويجمع بين قدرات إنتاجية عالية مع إمكانية استخراج المعلومات الكمية.
تفكيك شبكة تفاعل الجزيئات<em> في الجسم الحي.</em> هو المفتاح لفهم الآليات التي تنظم وظيفة الخلايا والأيض. وقد تم تطوير العديد من الخيارات المنهجية لمعالجة التفاعلات الجزيئية في الخلايا ، ولكن معظم هذه الطرق غير المباشرة تعاني من عدم وليس الكمية ، وبالتالي بالكاد. على العكس من ذلك ، أدخلت بضعة الراقية النهج الكمي ، والتي من الصعب مع ذلك توسيع لإنتاجية عالية. الجمع بين قدرات إنتاجية عالية مع إمكانية استخراج المعلومات الكمية ، ونحن وضعت مؤخرا مفهوم جديد لتحديد البروتين البروتين التفاعلات (Schwarzenbacher<em> وآخرون</em> ، 2008). هنا ، نحن تصف بروتوكول تفصيلية لتصميم وبناء على هذا النظام الذي يسمح لتحليل التفاعلات بين البروتينات وfluorophore المسمى ("فريسة") وبروتين الغشاء ("الطعم")<em> في الجسم الحي.</em>. وعلى سطوح الخلايا مطلي micropatterned functionalized مع أجسام مضادة ضد الطعم exoplasmic المجال. ويعاير الطعم والفريسة التفاعلات عن طريق إعادة توزيع فريسة الفلورسنت. يتميز الأسلوب حساسية عالية وصولا الى مستوى الجزيئات واحدة ، لديها القدرة على الكشف عن التفاعلات الضعيفة ، وارتفاع القدرة الإنتاجية ، مما يجعلها أداة الفحص حسب مقتضى الحال.
شريط الفيديو المرافق يوضح طريقة للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات في غشاء البلازما من الخلايا الحية (Schwarzenbacher وآخرون ، 2008 ؛. Brameshuber وآخرون ، 2009 ؛. Weghuber وآخرون ، تحت الطبع). من حيث المبدأ ، يمكن استخدام أي منصة المجهري TIRF القائم على نظام قراءات. فقط عندما يتم المطلوب حساسية عالية (على سبيل المثال للكشف عن الجزيئات واحد) ، سيكون مطلوبا المجاهر المتقدمة. لتحقيق أفضل النتائج على النقاط الهامة التالية أثناء عملية الإعداد تتطلب اهتماما خاصا :
تقنية الزخرفة الدقيقة فرصا عدة لتحليل البروتين البروتين التفاعلات. أولا ، مع تقدير المحلية ، وتفاعلات البروتين البروتين حل مكانيا أيضا في الكشف عن التفاعلات الضعيفة أو غير المباشرة ممكنة بدون عيوب إعطاء عدد كبير من ايجابيات كاذبة أو السلبيات. وثانيا أنها تمكن الباحث لتحليل التفاعلات بين البروتينات والبروتين في غشاء البلازما من الخلايا الحية ، والتي من الصعب تحقيقه من خلال نهج البيوكيميائية مثل الشاشة 2 – الهجين. ثالثا النهج يسمح للكشف عن الطعم والفريسة التفاعلات التي يتم عن طريق التضمين التغيرات البيئية مثل درجة الحرارة ، وجود جزيئات البروتينات المختلفة أو غيرها أو التعديلات بعد متعدية. وبالتالي يسمح للمقايسة جهري الفرز من زوج التفاعل المعطى في سياق الخلايا الحية. علاوة على ذلك ، عن طريق الحد من كثافة سطح يجند التقاط أو استخدام يغاندس الأحادي التكافؤ ، وتحليل لحالة الراحة يصبح ذلك ممكنا. أخيرا ، إذا كنت تستخدم منصات كافية المسح الضوئي ، وعدد الخلايا تحليل مرتفع بما يكفي لمواكبة متطلبات إنتاجية عالية من شركات الأدوية لفحص المخدرات (رم ، 2005).
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر Quentina بيتي ، جامعة لينز ، النمسا ، للحصول على مساعدة عينية لها ، كاتارينا Strub ، جامعة جنيف ، سويسرا ، من أجل بناء hCD71 – GFP ، ودانيال Legler ، جامعة كونستانس ، سويسرا ، لGPI – GFP DAF ، بناء. وأيد هذا العمل من قبل صندوق العلوم النمساوية (FWF ؛ المشروع Y250 – B03) ومشروع الاتحاد الأفريقي لGEN – الوزارة الاتحادية النمساوية للعلوم والبحوث.