تقنيات التصوير كاليفورنيا 2 + في اشارة الى الحيوانات المنوية البشرية

Summary

التحفيز أثار [CA^{2 +} يتم تقييم] ط اشارات الحيوانات المنوية الإنسان الفردية. يتم تحميل خلايا متحركة مع CA^{2 +} حساسة صبغة الفلورسنت (AM – استر الأسلوب) وثبتوا في غرفة perfusable. يتم تصوير الخلايا الوقت الفاصل بين المجهري مضان وحفزت عبر المتوسط ​​perfusing. ويتم تحليل استجابات الخلايا واحد (أو مناطق) حاليا باستخدام اكسل.

Abstract

مضان المجهري للخلايا محملة الفلورسنت ، كاليفورنيا<sup> 2 +</supيستخدم> الأصباغ حساسة لقياس الجوانب المكانية والزمانية للكا^{2 +} الإشارات في الخلايا الحية. نحن هنا وصف الطريقة المستخدمة في مختبراتنا لتحميل تعليق الحيوانات المنوية البشرية مع CA^{2 +} الإبلاغ عن الأصباغ وقياس إشارة مضان خلال التحفيز الفسيولوجية. يتم عزل الخلايا متحركة بنسبة تصل السباحة مباشرة والمحتضنة في ظل ظروف لتقوية قدرات 0-24 ساعة ، وهذا يتوقف على التجربة. الخلوي نفيذ AM النموذج استر (acetoxy الميثيل استر) من كاليفورنيا<sup> 2 +</supثم يضاف> الإبلاغ عن صبغ لقسامة الخلية وفترة من 1 ح يسمح للتحميل من صبغة في السيتوبلازم. نستخدم الأصباغ مرئية الطول الموجي للتقليل من الصور الأضرار التي لحقت الخلايا ، ولكن هذا يعني أن تسجيل ratiometric غير ممكن. وتناقش مزايا وعيوب هذا النهج. خلال فترة التحميل الخلايا يتم تقديمها الى غرفة التصوير ، وسمح للانضمام إلى ساترة بولي – D – يسين المغلفة. في نهاية الفترة الصبغة الفائضة التحميل وفضفاضة تتم إزالة الخلايا عن طريق الاتصال من الغرفة إلى جهاز نضح. هو perfused الغرفة باستمرار ، ثم تضاف محفزات وملاحات المعدلة إلى رأس الارواء. التجارب التي تسجل مرور الزمن اقتناء الصور وتحليلها في مضان حاليا من التفصيل ، عن طريق رسم يدويا مناطق الفائدة. تم تطبيع البيانات إلى ما قبل مستويات التحفيز مثل ذلك ، كل خلية (أو جزء من خلية) ، رسم بياني يبين كاليفورنيا<sup> 2 +</supيتم الحصول على> ردا على نسبة التغير في مضان.

Protocol

الحيوانات المنوية من الذكور الخصبة صحية ، مع تحليل السائل المنوي الطبيعي ، وتعد عادة في التصوير على النحو التالي. يتم تخزين عينات السائل المنوي عند 37 درجة مئوية لمدة لا تتجاوز 30 دقيقة. يتم عزل الخلايا من البلازما المنوية التي تسبح يصل الى استكمال ايرل محلول الملح المتوازن (sEBSS ؛ ملي : 1.8 CaCl 2 0.2 H 2 O ، 5.37 بوكل ، 0.81 MgSO 4 0.7 H 2 O ، 26.2 NaHCO 3 ، 1،0 ناه 2 ص 4. 2H 2 O ، كلوريد الصوديوم 116.4 ، 55.6 D – غلوكوز ، 2.73 البيروفات نا ، نا 41.8 اكتات) تستكمل مع 0.3 ٪ حامض الفحم de-lipidated/fatty مجانا BSA الخامس الكسر (BSA نوعية أمر حاسم لتمكين الطاقات ناجحة من الحيوانات المنوية). هو pipetted 1 مل من sEBBS في كل من سلسلة من الأنابيب 5 مل وunderlayered بلطف مع 0.3 مل من السائل المنوي. بعد حضانة لمدة 1 ساعة (37 درجة مئوية ، 6 ٪ CO 2) تتم إزالة بلطف الأعلى 0.7 مل من كل أنبوب والمجمعة. غير المخفف 10 ميكرولتر لتعليق الحيوانات المنوية بنسبة 90 ميكروليتر من 1 ٪ (V / V) الفورمالين لشل حركة الخلايا ، ثم يتم عد الحيوانات المنوية في غرفة نويباور. ثم يتم ضبط كثافة خلية في تعليق (مع sEBSS) إلى 6 ملايين خلية / مل. ثم يتم تقسيم العينة إلى aliquots من 200 ميكرولتر في أنابيب فضفاضة وتوج وحضنت (37 درجة مئوية ، 6 ٪ CO 2). لمدة 5-6 في ساعة للسماح تمكين الطاقات سبق Coverslips (22×50 ملم) تعامل مع بولي يسين – D. يتم تطبيق ميكرولتر من 10 بولي – D – يسين حل (10 ٪ ث / ت) وعدد من قطرات صغيرة لمركز ساترة. وسمح للبولي – D – يسين في الهواء الجاف. هذا يمكن أن يكون في مرحلة ساخنة وينبغي لاستكمال جفاف. ومرفق مع الشحوم فراغ ساترة لالمغلقة ، بنيت لهذا الغرض ، perfusable ، وغرفة التصوير البولي (أبعاد 35 × 20 مم × 5 ملم ، والقدرة ≈ 180 ميكرولتر). مماثلة لغرفة RC20 وارنر وبولي – D – يسين ساترة المغلفة يشكل قاعدة للغرفة عندما يتم النظر إلى الخلايا على مجهر مقلوب ويبلغ قطرها 12 ملم دائرية ساترة أشكال السطح العلوي للغرفة ، مما يسمح للانتقال الضوء. وتستخدم ولاية أوريغون الخضراء BAPTA1 – AM (OGB) أو الأخضر 1 – AM الكالسيوم لخلايا وضع العلامات. مستعدة OGB عن طريق إذابة في DMSO. يتم تضمين Pluronic حمض F127 (أ المنظفات) في DMSO لمنع "تكتل" للصباغة. ويمكن إعداد هذا في المختبر (100 ملغ في Pluronic DMSO مل 0.5) ، وذلك مباشرة قبل استخدامها ، أو يمكن شراؤها معدة سلفا. يضاف إلى 20 ميكرولتر قسامة 50 ميكروغرام من OGB (2.5 ملغ / مل). ثم يمكن أن يتم تخزين القارورة المجمدة وإذابة لاستخدامها لاحقا. بعد تمكين الطاقات من الحيوانات المنوية (5-6 ساعة في sEBBS و 37 درجة مئوية ، 6 ٪ CO 2) يضاف يتم تحديد أنبوب للتصوير و 1.2 ميكرولتر من محلول OGB ، مع إعطاء تركيز النهائي من 10 ميكرومتر. ومن ثم حضنت الأنبوب عن 40 دقيقة أخرى ، وبعد ذلك يتم حقن الخلايا برفق تعليق بمنفذ تدفق غرفة التصوير مع طرف P1000 ماصة (الأزرق). وضعت الغرفة في الجانب ساترة الحاضنة ، وبولي – D – يسين المغلفة أسفل ، لمدة 20 دقيقة. الخلايا تميل إلى السباحة على طول سطح الغرفة ، وسوف تنضم إلى منطقة بولي – D – يسين المغلفة. الآن هي التي شنت الغرفة على المجهر ، متصلا جهاز نضح في وperfused دقيقة تقريبا 0.5 مل /. مضخة الأسطوانة يغذي إزالة الملوحة في الغرفة والفائض من ميناء الخروج عن طريق مضخة الشفط مع الفخ. ترك الإعداد في الظلام لمدة لا تقل عن 10 دقيقة في حين يتم إزالة الخلايا فضفاضة وصبغ خارج الخلية التي نضح للغرفة. استقرار درجة الحرارة في غاية الأهمية لأن التقلبات الصغيرة قد لا يؤثر فقط على الخلايا كا 2 + التوازن ، ولكنه قد يؤثر أيضا K د للصباغة. وتجرى التجارب عادة عند 25 درجة مئوية ، حقق من خلال الحفاظ على درجة حرارة غرفة مظلمة على هذا المستوى. لقد وجدنا أن الحفاظ على درجة حرارة الغرفة على المستوى المطلوب توفر قدرا أكبر من الاستقرار في درجة الحرارة والتركيز من استخدام مرحلة لدرجة الحرارة للرقابة أو سخان حراريا تسيطر على تدفق المياه المالحة. وينظر إلى الخلايا تحت النقيض من المرحلة (60x 40x او النفط الغمر) يتم تحديد الهدف ، ومنطقة للتصوير. ويفضل ذلك الجزء من منطقة بولي – D – يسين المغلفة التي تقع بالقرب من مدخل الميناء ، حيث تدفق المياه المالحة هو الصفحي ومتسقة. من المهم أيضا لاستخدام المنطقة حيث كثافة الخلية المناسب (الكثافة المفرطة يؤثر على نوعية وسلامة البيانات من خلال التقاط الإشارات من الخلايا المجاورة) ، وحيث الخلايا هي التي تعلق على نحو كاف ولكن النشاط سوطي غير واضحة. يتم حفظ صورة النقيض من المرحلة. ثم يتم تبديل إلى وضع المجهر مضان (480 نانومتر الإثارة ؛ انبعاث 540 نانومتر) ، ويتم تخفيض وقت التعرض إلى الحد الأدنى المطلوب للحصول على صورة واضحة مضان (عادة 5-20 مللي ثانية). وبدأت التجربة من خلال تفعيل الحصول على الصور وقتا سلسلة البرامج (IQ). عادة ما يتم الحصول على الصور عند 0.1 هرتز ويقتصر الإضاءة على فترات من الحصول على الصور فقط باستخدام softwaإعادة المغلاق للرقابة. ويمكن استخدام قدر أكبر من معدلات الحصول على الصور ولكن يجب أن يكون بدل لمشاكل تبييض وجيل من التحف بسبب ضرر الصورة إلى الخلايا (انظر المناقشة). والذكاء (ومعظم البرامج الأخرى اقتناء منصات) تسمح في الوقت الحقيقي الرسوم البيانية من خلال التجربة مضان. بعد فترة مراقبة التلاعب مدة 3-5 دقائق من مكونات المياه المالحة (مثل [كا 2 +] س) وتطبيق الأدوية ويتحقق عن طريق استبدال المالحة في رأس الارواء. ويلاحظ بالإضافة إلى ذلك الوقت من كل الحوافز بحيث يمكن احتساب ذلك الوقت من وصوله الى غرفة التصوير ، وتوفير الدقة الكافية لتقييم ردود الفعل البطيئة وصفها هنا (عينات عند 0.1 هرتز). ويمكن للاستجابات أسرع يتحقق قدر أكبر من الدقة عن طريق إضافة مؤثرات مباشرة إلى تدفق المياه المالحة من خلال منفذ تدفق الثانية على النحو الوارد في غرفة RC20 وارنر. ويتم تحليل الصور الرمزية باستخدام الذكاء. يتم رسم مناطق الفائدة (رويس) جولة كل خلية (أو جزء من الخلية) ، وكذلك تم تحديد منطقة حرة خلية (على خلفية الطرح التلقائي من قبل البرنامج. ثم يتم التحقق من هذه السلسلة الصورة لإزالة الخلايا التي ماتت أو خضع لتفاعل الجسيم الطرفي ( الذي يظهر على شكل زيادة كبيرة وسريعة في مضان يليه فقدان صبغة هيولي) خلال التجربة وتلك التي أظهرت حركة كافية للتسبب التحف عند تحليلها على شكل سلسلة الوقت. ثم يتم الحصول على سلسلة زمنية كثافة مضان لكل عائد الاستثمار ويتم تحليل هذه البيانات حاليا في Excel. في البداية هو تطبيع مضان إلى القيمة يعني الحصول عليها خلال فترة الرقابة ، وذلك باستخدام المعادلة R = [(FF بقية) / F بقية] × 100 ٪ ، حيث R هي نسبة التغير في مضان مقارنة بالفترة السيطرة ، و F هو شدة الإسفار في الوقت t وبقية F هو يعني ما لا يقل عن 30 من قرارات F تم الحصول عليها خلال فترة مراقبة. ممثل النتائج الشكل 1 يبين سلسلة من الصور من التجربة التي كانت في حفز الخلايا مع هرمون البروجسترون ميكرومتر 3. الصف العلوي والفيلم عرض الصور 1 مضان النطاق في الرمادي ، وهي واردة في نفس السحراء أدناه (في الفيلم و2) في pseudocolor (بحث '16_colorsالجدول' J في الصورة) ، حيث "بارد" الألوان تشير كثافة منخفضة والفلورسنت 'الحارة' تشير إلى كثافة مضان الألوان عالية. يمكن الاطلاع على الخلايا في pseudocolor خلال التجربة ، وذلك باستخدام جداول البحث في معدل الذكاء ، ولكن باستخدام مقياس الرمادية عموما أكثر إفادة لتقييم فيما إذا كانت الخلايا التي تحمل علامات جيدة. وقد جمعت أول صورتين في 0 ق ق 100 ، وبعد بدء التسجيل. وينبغي أن تكون مستقرة ومضان يميل إلى أن يكون الأقوى في منطقة الرقبة وجسيم آخر الحيوانات المنوية. دخلت غرفة التصوير البروجستيرون في حوالي 175 ق والثالث 3 والرابع 4 لوحات (180 ق ق و 220) تظهر الزيادة السريعة في [كا 2 +] ط (مضان) الصادرة في الرأس ومنطقة الرقبة الخلفي للخلية. الصور اللاحقة في 290 ، 360 ، 740 ، 990 و s 1440 ، تبين اضمحلال الأولي [كا 2 +] ط عابرة والتنمية من ارتفاع متواصل الثانوية. الشكل 2 يبين تحليل البيانات ، وتحويل القيم مضان الخام لكل عائد إلى تطبيع مضان (نسبة التغير في مضان مقارنة بالفترة التحكم) ويبين الشكل 3 الوقت تطبيع المؤامرات مضان لمدة 3 خلايا تظهر "نموذجي" الاستجابة لهرمون البروجسترون ميكرومتر 3. الشكل 1. مثال البيانات من خلية وحفز مع البروجسترون. وتظهر سلسلة من الصور مضان في مقياس الرمادية (الصف العلوي) ، وpseudocolor (الصف السفلي). النقاط الزمنية هي 0 ، 180 ، 220 ، 290 ، 360 و 990s. دخلت 3 ميكرومتر البروجسترون غرفة التصوير في 175 ثانية. وتظهر في لوحة رويس الأولى. الشكل 2. تحليل البيانات وحيدة الخلية في Excel مضان. ترتيب الأرقام في الأسود وسلسلة زمنية من البيانات مضان ، عموديا. الأرقام الواردة في الحمراء (أدناه) هي البيانات التي تم الحصول عليها تطبيع باستخدام المعادلة الواردة في النص. يبين الرسم البياني تطبيع مضان وقت مؤامرة لمدة 64 خلية في هذه التجربة التي ، بناء على التحفيز ، ويظهر ارتفاع عابر في مضان يليه ارتفاع بطيء وسلسلة من التذبذبات الصغيرة. الشكل 3. الإسفار وقت آثار لمدة 3 الخلايا الفردية ، كما أعربت نسبة التغير فيما يتعلق بمكافحة القيمة.. تم ادراج 3 ميكرومتر البروجستيرون في ذلك الوقت والتي تمثلت في السهم. يظهر خط متقطع يعني مضان السيطرة.

Discussion

عندما نفذت بنجاح ، وهذا الأسلوب يسمح بتسجيل توزيع وحركية والعفوية التي يسببها الاشارات ⁺ كا ² في الحيوانات المنوية البشرية. ويمكن الحصول على ردود من عدد كبير من الخلايا (حتى 200) وهو أمر مهم لأن الحيوانات المنوية البشرية يمكن أن تظهر الكثير من التباين في إشاراتها العفوية وحفز ⁺ كا ^2. العلامات الناجحة وبقاء خلايا أثناء التسجيل تعتمد اعتمادا كبيرا على نوعية العينة. عينات الفقراء تعطي العلامات الفقراء ، والاستجابات الفقراء والخلايا قد يموت أثناء التسجيل.

الحيوانات المنوية البشرية حساسة جدا للضرر الصورة ونحن بالتالي استخدام الحد الأدنى من الإضاءة اللازمة (حيث شدتها وزمن التعرض) من أجل تعظيم بقاء الخلية وتقليل الآثار بسبب وفاة الخلية. كاميرا عالية الحساسية (السماح باستخدام الإضاءة المنخفضة الحدة) هو مكسب كبير منذ سوف تلتقط الكاميرا مضان ضعيفة. الخلفية المضاءة ، EM – CCD الكاميرات بشكل خاص مناسبة تماما ، وإن كان مكلفا للغاية. إنارة LED (بدلا من استخدام الزئبق مصباح زينون أو مع مرشح الإثارة يحسن أيضا بقاء الخلية (Nishigaki وآخرون ، 2006).

نحن لا نستخدم Fura – 2 ، على الرغم من مزايا واضحة لنسبة متري ، والتصوير ، ولأن Fura يتطلب إثارة للأشعة فوق البنفسجية ، ولأنه من الضروري اتخاذ صورتين لكل نسبة. بالنسبة للبيانات التي تم الحصول عليها مع طول موجي واحد ، والأصباغ الضوء المرئي ، وتطبيع كثافة مضان يعوض إلى حد كبير عن الفرق في تحميل صبغ بين الخلايا ، ولكن ليس للتوزيع الصبغة داخل خلية واحدة ، ويجب أن يؤخذ هذا في الاعتبار. وإن كان يمكن ، والأصباغ الطول الموجي واحد من حيث المبدأ ، يجب معايرة ، ودقة الأسلوب ونحن الفقراء لا تحاول القيام بذلك.

في حين أن البيانات التي تم الحصول عليها مع نسبة Fura – 2 (أو انبعاث نسبة الصبغة الهندية) ، حتى من دون المعايرة ، وإعطاء تمثيل المؤمنين مقبول من التغيرات النسبية في [كا ^{2 +]} ط ، كثافة مضان من الأصباغ طول موجي واحد بعيد عن خطي المتصلة [كا ^{2 +]} ط على الجزء الأكثر فائدة من منحنى العلاقة لتشبع الأصباغ طول موجي واحد يقترب عادة لوغاريتمي. نستخدم حاليا أوريغون الخضراء BAPTA – 1 (الشكل 4) لأنها حساسة للتغيرات صغيرة في [كا ^{2 +]} ط قريبة من مستوى الراحة ليالي (50-100 نانومتر). عندما [كا ^{2 +]} يرتفع فوق ط 1 ميكرومتر الردود ستكون ممثلة تمثيلا ناقصا من حيث التغير مضان وصبغ قد تشبع. خيار لتحسين هذه التقنية دون اللجوء إلى الإثارة الأشعة فوق البنفسجية هو مضاعفة الخلايا مع صبغة تحميل مثل Fluo – 3 و الحمراء Fura. يمكن متحمس سواء في 488 نانومتر ولكن في نفس الوقت من ردود مختلفة جدا. تسجيل الانبعاثات في 540 و 650 نانومتر يوفر النسبة التي يمكن أن توفر أفضل طريقة لمراقبة دقيقة من [كا ^{2 +]} ط (Haughland ، 2002) ويمكن أن تنطبق على الحيوانات المنوية (Nisigaki وآخرون ، 2006).

الشكل 4. العلاقة بين حرة [كا ^{2 +]} (نانومتر) وانبعاث مضان في ذروة الموجة (حوالي 525 نانومتر) لجرين ولاية أوريغون BAPTA – 1 وأوريغون الخضراء BAPTA – 2. OGB1 يعطي أعلى مضان يستريح في [كا ^{2 +]} ولكن التشبع في المستويات الأدنى ، وبالتالي لديه مجموعة صغيرة صالحة للاستخدام. تم الحصول على بيانات عن هذه المؤامرات من كتيب المسابر الجزيئية (Haughland ، 2002).

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Low light level Camera		QImaging	Rolera XR
Oregon Green BAPTA-1		Invitrogen	06807
Imaging Software		Andor	IQ
Imaging Software		National Institues of Health	Image J	Public domain software
LED illumination system		Cairn Research	Opto LED
Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)		Invitrogen	P3000MP