Summary
ここでは、ドッグフード寒天培地を用いて線虫を一括培養し、線虫の集団行動を研究するシステムについて報告する。このシステムにより、研究者は多数のダウアーワームを繁殖させることができ、 Caenorhabditis elegans やその他の近縁種に適用できます。
Abstract
動物は、鳥の群れ、魚の群れ、人間の群れで観察されるように、ダイナミックな集団行動を示します。動物の集団行動は、生物学と物理学の両分野で研究されてきました。研究室では、約100年前からショウジョウバエやゼブラフィッシュなど様々なモデル動物を用いてきましたが、これらの遺伝的に扱いやすいモデル動物が司令する大規模で複雑な集団行動を研究することは大きな課題でした。この論文は、 Caenorhabditisエレガンスの集団行動の実験システムを作成するためのプロトコルを提示します。繁殖した線虫はペトリプレートの蓋に登り、集団的な群れ行動を示します。また、このシステムは、湿度と光刺激を変化させることで、線虫の相互作用と行動を制御します。このシステムにより、環境条件を変化させることで集団行動のメカニズムを調べたり、個体レベルの移動が集団行動に及ぼす影響を変異体を用いて調べたりすることができます。したがって、このシステムは、物理学と生物学の両方の将来の研究に役立ちます。
Introduction
非科学者も科学者も、鳥の群れや魚の群れなど、動物の集団行動に魅了されています。集団行動は、物理学、生物学、数学、ロボット工学など幅広い分野で解析されています。特に、鳥の群れ、魚の群れ、運動性細菌のバイオフィルム、活性分子からなる細胞骨格、自走コロイド群などの自走系、すなわち散逸系に着目した研究分野として、アクティブマター物理学が発展しています。アクティブマター物理学の理論では、個体の振る舞いがいかに複雑であっても、膨大な数の生物の集団運動は少数の単純な規則によって支配されていると主張しています。例えば、自走式粒子の集団運動の統一的記述の候補であるヴィクセックモデルは、動物の群れのように、2次元で偏心揺らぎを伴う長距離の秩序相を形成するためには、移動する物体の短距離整列相互作用が必要であると予測している1。アクティブマターの物理学に関するトップダウンの実験的アプローチは急速に発展しています。以前の実験では、大腸菌2の長距離秩序相の形成が確認されました。他の最近の研究では、細胞3,4、細菌5、運動性コロイド6、または移動するタンパク質7,8が用いられました。ヴィクセック模型のような単純な極小模型は、これらの現実の現象をうまく記述した。これらの単細胞実験系とは対照的に、動物による集団行動は野生で観察されるのが普通であり、10,000匹の本物の鳥や魚で対照実験を行うことは誰も望めません。
生物学者は物理学者と同じ関心を共有しており、個体が互いに相互作用し、グループとして機能的に振る舞う方法に関心を持っています。個人の行動を解析する伝統的な研究分野の一つに神経科学があり、その行動のメカニズムを神経細胞や分子レベルで調べてきました。これまでに多くの神経科学的なボトムアップアプローチが開発されてきました。物理学におけるトップダウンアプローチと生物学におけるボトムアップアプローチは、ショウジョウバエ、線虫 Caenorhabditis elegans、マウスなどのモデル動物を用いて促進することができる9。しかし、実験室でのこれらのモデル動物の大規模な集団行動に関する調査結果はほとんどありません10。遺伝的に扱いやすいモデル動物を実験室で大規模に作製することはまだ困難です。そのため、現在の生物学や物理学における集団行動の研究では、普段は実験室で研究をしている科学者が動物の集団行動を研究することが困難でした。
本研究では、線虫の集団行動を研究するために、線虫の大規模培養方法を確立した。このシステムにより、環境条件を変化させ、個体レベルの移動が集団行動に及ぼす影響を調べることができる10。アクティブマター物理学では、実験とシミュレーションの両方で数理モデルのパラメータを制御することができるため、そのモデルを検証して統一的な記述を特定することができます。遺伝学は、集団行動の根底にある神経回路のメカニズムを理解するために使用されます11。
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Protocol
1.ワームの準備
注:集団行動の観察および光遺伝学的実験のために、野生型N2ブリストル株12 およびZX899株(lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])13 をそれぞれ調製する。ZX899ひずみを暗所で維持します。
- 14 mLの線虫増殖培地(NGM)を含む60 mmプレートに、4匹の十分に摂餌された成虫を寒天培地とともに堆積させ、 大腸菌 OP5012を播種します。
- F1線虫をNGMプレート内で23°Cで7日間飢餓状態まで増殖させます。この時点で、F1 ワームの収量は約 100 ウォーム/プレートです。線虫の段階は、ダウアー幼虫と飢餓状態のL1幼虫の混合集団で構成されています。
2.ドッグフード寒天(DFA)培地プレートの調製
- 粉末ドッグフード2gと1%寒天培地5mLを入れたガラス瓶をオートクレーブし、室温まで冷却します(図1A)。
注:この実験では、さまざまなメーカーの他のドッグフードを使用できます。
3. DFA培地プレートへのワームの接種
- 少量(約0.5 g)のDFA培地を、 大腸菌 OP50を播種したNGMプレートの中央に移します(図1B)。光遺伝学的実験では、線虫を接種する前に、チャネルロドプシン2の補因子である50μMのオールトランスレチナール40μLをDFAに注ぎます。
- オートクレーブ水を使用して、4つのNGMプレートから飢餓状態の線虫を回収します。
- ドッグフードの小さな断片(約0.5 g)を、プレートの蓋から約2 mm離れたDFA培地に置きます。
- 汚れを防ぐために、クリーンベンチ内でNGMプレートを紫外線で15分間照らします。
- 採取した線虫(約400匹の線虫)をNGMプレート上のDFA培地に接種します。ペトリプレート内の湿度が上昇し、水滴が発生して蓋にワームが閉じ込められるのを防ぐために、プレートをパラフィルムで密封しないでください。
- ワームを23°Cで繁殖させ、約10〜14日間プレートの蓋まで登らせます。
注:蓋の上のワームの数は10〜14日後にほとんど増加しなかったため、ワームはおそらく餌を使い果たしたと推定されました。
4.集団行動の観察
- 実験当日は、大 腸菌 とドッグフード寒天培地を含まない新しいNGMプレートを、マクロズーム顕微鏡のステージ上のアルミプレート上に置きます(図2A)。この新しいNGMプレートの底部を、ペルチェ温度コントローラーユニットを使用して23°Cに少なくとも5分間保持します(図2B)。次に、この新しいNGMプレートの蓋を、ワームが登ったプレートの蓋と交換します。対物レンズ(x2、NA = 0.5)を低倍率対物レンズとして使用します(図2A)。
- ペトリプレートの底部の温度を23°Cから26°Cに上げて、プレート内の湿度を変化させます(図2)。
- 板蓋内面の画像を20フレームs-1 でカメラで取得します(補足動画S1)。
- 取り込んだ画像をタグ付き画像ファイル形式で保存します。
5. 光遺伝学的実験
- 100Wの水銀ランプを使用して、フィルターセットでフィルタリングされたブルーライトを照射します。電磁シャッターシステムを使用して照明時間を正確に制御します(図2B)。
- 青色光を照射する前に、これらの条件下でZX899をDFAに5分間維持します。
- 23°Cに維持された顕微鏡ステージ上のペトリプレートの蓋に取り付けられたZX899ワームを照射します。
- 板蓋内面の画像を20フレームs−1 のカメラで取得する(補足動画S2)。
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Representative Results
ここでは、野生型のダウアーワームを集団行動の観察に用いた。線虫を23°Cで約10〜14日間培養し、DFA培地プレートの蓋の内面まで登った。実験当日は、蓋のみを大 腸菌 とDFA培地を含まない新しいNGMプレートに移しました。このペトリプレートの底部は、ペルチェシステムを用いて最初に23°Cに保たれ、その後、その温度を26°Cに上げました。 顕微鏡で動画を撮影しました。 図 3 に、ムービーのスナップショットを示します。ワームは湿度の変化に応じてネットワークパターンを動的に改造した。湿度が上昇すると、ネットワークのコンパートメントサイズも大きくなります。最後に、ネットワークは崩壊し、蓋の内面には休眠中のワームの塊が残りました。
図1:多数のワームを培養するためのDFA培地の写真。 (A)ガラス瓶に調製したDFA培地の写真。(B)採取した線虫を接種した直後のDFA培地を装着したNGMプレートの写真。略語:DFA =ドッグフード寒天;NGM = 線虫増殖培地。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:集団行動を観察するための実験系。 (A)集団行動を観察するための顕微鏡。(B)ペルチェ方式によるメカニカルシャッターコントローラと温度制御システム。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:集合的ネットワークパターンの湿度依存性の代表的なデータ。C.エレガンスネットワークの周囲湿度への依存性。カメラのフレームレートは 1 fps です。スケールバー = 4 mm。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足動画S1:集合的ネットワーク形成 野生型ダウアー線虫をペトリプレート内のNGM上でDFAを用いて増殖させた。ワームはふたの中で自己組織化します。湿度はペルチェ素子を用いて変化させた。画像は蓋の上から撮影しました。ムービーの再生速度は、リアルタイム録画レートの 80 倍です。略語:DFA =ドッグフード寒天;NGM = 線虫増殖培地。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS2:線虫の集団の光遺伝学的操作。 オプトジェネティクスは、1、2、4、8、32、および128秒の青色光照明で実施されました。この活性化は、最初に束の樹木化と崩壊を引き起こしました。最後に、初期構造とは異なるネットワークが形成されました。動画は、リアルタイム録画レートの20倍の速さで再生されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、線虫の大規模集団行動のためのシステムを実験室で準備するためのプロトコルを示します。DFA法は、もともと非モデル動物であるCaenorhabditis japonica14とNeoaplectana carpocapsae Weiser15で確立されました。しかし、この方法は集団行動の調査には適用されませんでした。C.エレガンスは遺伝的に扱いやすいモデル動物である11,12。線虫を用いた行動遺伝学的研究は、個体レベルの行動研究の研究に貢献しています。しかし、線虫研究の長い歴史の中で、単純な凝集パターンが観察されたことはあるものの16,17,18,19、C.エレガンスの集団レベルの行動による動的なパターン形成を実証した報告はない。この研究の重要なアイデアは、DFA培地を使用して、ペトリプレート内で膨大な数の線虫を長期間維持することを容易にすることです。DFA培地を用いて、線虫の動的な集団行動の観察を提示し、新しい行動パラダイムを導入します。
これまで、いくつかのワームの大量生産方法が報告されています。これらの方法と比較して、この方法の利点は、ダウアーワームの分離のためのプロセスなしで蓋の集団行動の調査を可能にすることです。最近、蓋との静電相互作用を利用して、蓋とDFA培地の間の隙間を越えた模倣ダウアーワームの移動を報告する論文を発表しました20。この線虫の移動は、線虫が約100匹の線虫からなるニクテーションカラムを形成するときに起こります。この研究は、DFAの過度な密集によってダウアー形成が誘導された場合、ダウアーワームのみが移動できることを示しています。この方法で産生されるワームの数は、卵黄ベースの方法などの他の方法よりも少ない可能性があります。しかし、蓋の行動アッセイを行うには、飢餓状態のL1幼虫などの他の段階の線虫をほとんど含まないダウアー線虫の集団を使用できますが、以前の方法ではダウアー線虫を分離するプロセスが必要でした。したがって、この方法は、ダウアーワームを使用したより正確な集団行動検査を可能にします。さらに、実験者は、次の手順で線虫の密度を制御することもできます。まず、オートクレーブ水を使用して、蓋に移動したワームを集めて洗浄しました。次に、水中の線虫の濃度は、線虫懸濁液のアリコート中の線虫をカウントすることによって決定され、線虫懸濁液を基板上に滴下した。まとめると、私たちのシステムは、行動実験のための線虫の段階と密度の点でより制御可能です。
集団行動は、生きている自走粒子と生きていない自走粒子の集団運動の統一的な記述を明らかにすることを目的としたアクティブマター物理学の観点から分析されています。この目標に向けて、非生物の自走式粒子や細胞については多くの実験系が開発されてきましたが、神経回路に基づいてより複雑な振る舞いを示す多細胞生物については、あまり実験系が開発されていませんでした。したがって、私たちのシステムは、集団運動の統一された記述が存在する可能性を拡張します。湿度操作については、モデルに基づく数値シミュレーションにより、実験で湿度によって誘発されたと思われる線虫間の引力がパターン変化を誘発し、湿度によるパターン変化と定性的に一致することが示唆された10。しかし、パターンの変化が温度ではなく湿度によって引き起こされたことを示す決定論的な実験的証拠はないと考えています。したがって、実験者は、集団行動の変化が温度変化ではなく湿度の変化のみに起因するかどうかについて注意を払う必要があります。
動物の集団行動の神経機構を理解することは、生物学の分野における新たな課題です。集団行動は、個人レベルでは現れない新しい機能の出現につながります。動物は神経系を持っているので、記憶力や学習能力を持っていますが、これらの神経機能の違いを個体レベルと集団レベルで調べることは興味深いことです。集団行動は、外来生物や獲物に対する検出感度を向上させ、正しい意思決定の能力を高めることが注目されています21,22,23。また、線虫は302個のニューロンからなる神経系を有しており、それによって過去の培養温度24を記憶し、好ましい湿度25の場所に移動する。したがって、線虫の神経機能と集団行動の関係を調べることは興味深いことです。さらに、線虫の個体群の行動を観察することで、力学的パラメータを抽出することが期待できます。例えば、線虫群集の粘弾性特性を観察することで、1匹の線虫の弾性や線虫間の表面張力を推定することができます。ワームの塊のサイズ分布は、それらの間の表面張力に関連している必要があります。C.エレガンスの個体の推進力は、線虫が表面張力に反応して移動する頻度からも推定できます。したがって、線虫集団の巨視的情報のみに基づいて、個々の線虫レベルでの力学的パラメータを推定することが期待できます。
結論として、アクティブマター物理学は集団行動の統一的な記述を特定することを目的としており、この分野では、パラメータを制御することにより、提案された数理モデルのより多くの実験的検証が必要です。さらに、各動物の集団パターン形成の機能的意義と神経機能への機械的関連性は、重要な未解決の問題です。さらに、「ソフトロボティクス」の目的の一つがロボットの集団の精密制御であることから、ワームの集団行動の実験を通じてアルゴリズムを確立し、ソフトロボットの集団運動の制御に応用できると期待しています。
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Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究で使用した菌株を提供してくれた Caenorhabditis Genetics Centerに感謝します。本論文の発行は、日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(B)(課題番号JP21H02532)、日本学術振興会科学研究費助成事業「ソフトロボットの科学」プロジェクト(課題番号JP18H05474)、科研費学術変革領域B(課題番号JP23H03845)、国立研究開発法人日本医療研究開発機構PRIME(課題番号JP22gm6110022h9904)、JST-MIRAIプログラム(課題番号JPMJMI22G3)、 JST-FORESTプログラム(助成金番号JPMJFR214R)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP] | author | ZX899 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively |
| N2 Bristrol | Caenorhabditis Genetics Center | Wild-type C. elegans strain | |
| For worm cultivation | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| All-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | For optogenetics |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| Dog food | Nihon Pet Food | VITA-ONE | For preparation of dog food agar medium |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Observation | |||
| Computer | CT solution | CS6229 | Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM |
| CMOS Camera | Hamamatsu photonics | ORCA-Lightning C14120-20P | For data acquisition |
| CMOS Camera | Olympus | DP74 | For data acquisition |
| Microscope with SZX-MGFP set | Olympus | MVX10 | For data acquisition |
| x2 Objective lens | Olympus | MV PLAPO 2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Shutter control | |||
| Shutter | OptoSigma | BSH2-RIX | For controlling temporal pattern of light illumination |
| Shutter controller | OptoSigma | SSH-C2B-A | For controlling temporal pattern of light illumination |
| Temperature control | |||
| Peltier temperature controller unit | VICS | WLVPU-30 | For controlling humidity inside a Petri plate |
| UNI-THEMO CONTROLLER | Ampere | UTC-100 | For controlling humidity inside a Petri plate |
| Data acquisition software | |||
| HCImage | Hamamatsu photonics | For data acquisition |
References
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