私達はからすべてのtRNAの相対的アミノアシル化レベルを決定するためにマイクロアレイ解析のための方法を説明します。<em> S. cerivisiae。</em
tRNAのアミノアシル化、または充電、レベルは急速に環境[1]に応答して細胞内で変更することができます。原核生物と真核細胞の両方におけるtRNAの充電レベルの変化は、ストレス応答の主要な細胞機構である翻訳調節につながる。身近な例では、緊縮応答になります<em> E.大腸菌</em>と酵母のGCN2ストレス応答経路([2-6])。の最近の仕事<em> E.大腸菌</em>と<em> S.出芽酵母</em> tRNAの充電パターンは非常に動的であり、細胞を[1、6、7]が経験するストレスの種類に依存していることを示している。 tRNAの充電の非常に動的、変数の性質は完全に環境変化に対する細胞応答を解明するために、ゲノムスケールでのtRNAの充電レベルの変化を決定することが不可欠です。このレビューでは、同時に内のすべてのtRNAの相対的な充電レベルを測定するための方法を提示<em> S.出芽酵母</em>。ここで紹介するプロトコールは酵母のためですが、このプロトコルが正常にを含む生物の様々な相対的な充電レベルを決定するために適用されています<em> E.大腸菌</em>と人間の細胞培養[7、8]。
我々は、同時にゲノムスケールでのすべてのtRNAの相対的な充電レベルを決定するための方法を提示する。ここで紹介するプロトコルは、S.用に最適化されています出芽酵母 、そしてそれはまた、正常E.でtRNAの充電プロファイルを測定するために使用されています大腸菌やヒトの培養細胞。それは全体の荷電tRNAを得られる限り、知られているゲノム配列(全tRNA遺伝子の注釈を可能にする)と任意の生物を収容するように変更することができます。
The authors have nothing to disclose.
パンの実験室での酵母の作業は、味の素(株)日本衛生研修グラントT32GM007183 – 33の国立研究所からの助成金によって賄われていた。我々は、酵母のプロジェクトの長期的協力のための医学のインディアナ大学で博士ロナルドWekに感謝。我々はまた、マイクロアレイ法を充電tRNAを開発するための博士キンバリーディトマーに感謝。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | ||
E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | ||
E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | ||
E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | ||
E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | ||
T4 DNA ligase | USB | 70042X | ||
PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | ||
Hyb4 station | Digilab | |||
GenePix 4000B scanner | Axon instruments | |||
GenePix 6.0 | Axon instruments |