Summary
La manipolazione dell'interferenza dell'RNA (RNAi) rappresenta una sfida formidabile in molte specie di parassitoidi di dimensioni ridotte, come le vespe Trichogramma . Questo studio ha delineato un metodo RNAi efficiente in Trichogramma denrolimi. La presente metodologia fornisce un modello robusto per lo studio della regolazione genica nelle vespe Trichogramma .
Abstract
I parassitoidi dell'uovo, Trichogramma spp, sono riconosciuti come efficaci agenti di controllo biologico contro vari parassiti lepidotteri in agricoltura e foreste. Gli stadi immaturi della prole di Trichogramma si sviluppano all'interno dell'uovo ospite, mostrando una notevole piccolezza (circa 0,5 mm di lunghezza da adulto). La metodologia dell'interferenza dell'RNA (RNAi) è emersa come uno strumento cruciale per chiarire le funzioni dei geni in numerosi organismi. Tuttavia, la manipolazione dell'RNAi in alcune piccole specie di parassitoidi, come Trichogramma, ha generalmente posto sfide significative. In questo studio, presentiamo un metodo RNAi efficiente in Trichogramma denrolimi. La procedura delineata comprende l'acquisizione e l'isolamento di singoli campioni di T. dendrolimi da uova ospiti, la progettazione e la sintesi di RNA a doppio filamento (dsRNA), il trapianto e la coltivazione in vitro di pupe di T. dendrolimi , la micro-iniezione di dsRNA e la successiva valutazione del knockdown del gene bersaglio attraverso l'analisi RT-qPCR. Questo studio fornisce una procedura completa e visivamente dettagliata per condurre esperimenti di RNAi in T. dendrolimi, consentendo così ai ricercatori di studiare la regolazione genica in questa specie. Inoltre, questa metodologia è adattabile per studi di RNAi o micro-iniezioni in altre specie di Trichogramma con piccoli aggiustamenti, rendendola un prezioso riferimento per condurre esperimenti di RNAi in altre specie endoparassitarie.
Introduction
Trichogramma spp. è un gruppo di parassitoidi delle uova che sono stati ampiamente utilizzati come agenti di controllo biologico altamente efficienti contro un ampio spettro di parassiti lepidotteri negli ecosistemi agricoli e forestali di tutto il mondo 1,2,3,4. L'applicazione di Trichogramma allevato in massa fornisce un approccio ecologico per la gestione sostenibile dei parassiti 5,6,7. La comprensione della biologia molecolare delle vespe Trichogramma fornisce preziose informazioni per migliorare l'efficienza dell'allevamento di massa e le prestazioni sul campo di questi agenti di controllo biologico 8,9 studiando la metodologia di regolazione genica e l'editing del genoma10.
Dalla scoperta dell'interferenza genetica specifica mediata da RNA a doppio filamento (dsRNA) in Caenorhabditis elegans nel 1998, il metodo dell'interferenza dell'RNA (RNAi) si è evoluto in un kit di strumenti genetici vitali per esplorare i meccanismi di regolazione degli organismi sopprimendo l'espressione dei geni bersaglio11. Gli esperimenti di RNAi sono diventati una metodologia standard ampiamente applicata per studiare la funzione genica in numerose specie di insetti12,13. Ciononostante, la manipolazione dell'RNAi rappresenta una sfida formidabile in molte specie di parassitoidi, in particolare tra quelle appartenenti alla famiglia degli endoparassiti Chalcidoidea 14,15,16. Il metodo RNAi è stato documentato in almeno 13 specie di parassitoidi 14,15,16,17,18,19. Tra questi, l'approccio RNAi è stato condotto in modo completo nelle vespe di Nasonia ed è applicabile in tutte le fasi di sviluppo, inclusi embrioni, larve, pupe e adulti 14,15,16. È interessante notare che le vespe Nasonia sono ectoparassitoidi, con la loro prole che si sviluppa nello spazio interstiziale tra la pupa ospite e il pupario, consentendo la loro coltivazione in vitro e facendo tollerare loro alcuni trattamenti, come la microiniezione. A differenza delle vespe Nasonia, gli individui di Trichogramma subiscono l'intero sviluppo embrionale, larvale e pupale all'interno dell'uovo ospite. Lo strato allo stadio embrionale e larvale (che può ostacolare la permeabilità del dsRNA), la vulnerabilità ai danni e la difficoltà di sopravvivere in vitro presentano ostacoli formidabili 20,21,22. Inoltre, le dimensioni ridotte degli individui di Trichogramma, circa ~ 0,5 mm di lunghezza adulta o pupale, li rendono estremamente intricati da manipolare 20,21,22.
Nel presente studio, delineiamo una procedura completa per condurre esperimenti di interferenza dell'RNA (RNAi) in Trichogramma denrolimi Matsumura. Questa procedura comprende le seguenti procedure: (1) la progettazione e la sintesi di RNA a doppio filamento (dsRNA), (2) la microiniezione di pupe di T. denrolimi, (3) il trapianto e l'incubazione in vitro di queste pupe e (4) il rilevamento del knockdown del gene bersaglio attraverso l'analisi RT-qPCR. Il gene bersaglio selezionato per l'esperimento RNAi è l'omologia della catena pesante della ferritina (Ferhch). FerHCH, una proteina legante il ferro, contiene un centro ferroxidasico dotato di capacità antiossidanti, facilitando l'ossidazione di Fe2+ a Fe3+. Svolge un ruolo indispensabile nella crescita e nello sviluppo di vari organismi mantenendo l'equilibrio redox e l'omeostasi del ferro. La deplezione di FerHCH può provocare l'accumulo eccessivo di ferro, portando a danni irreversibili ai tessuti e spesso culminando in significative alterazioni fenotipiche, tra cui difetti di crescita, deformità e mortalità 23,24. Questo studio offre una guida passo-passo per la conduzione dell'RNAi in T. denrolimi, che sarà preziosa per studiare le funzioni geniche nel più ampio contesto delle vespe Trichogramma.
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Protocol
NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, strumenti, software e reagenti utilizzati in questo protocollo.
1. Raccolta e mantenimento della coltura degli insetti
- Far aderire un gruppo di ~5.000 uova di Corcyra cephalonica (Stainton) su un cartoncino di 9 cm per 16 cm utilizzando una soluzione 1:5 (v/v) di gomma arabica in polvere e acqua25,26.
NOTA: Evitare di attaccare troppe uova ospiti alla scheda in quanto il sovraffollamento rende impraticabile le successive procedure di trasferimento e dissezione. - Per evitare la schiusa delle uova dell'ospite, sottoporre le schede uovo dell'ospite a 30 minuti di irradiazione ultravioletta (UV) (Figura 1-i). Successivamente, tagliare la carta con le uova inattivate in cartoncini di 1 cm di spessore e 8 cm di diametro, ciascuno contenente circa 300-500 uova (Figura 1-ii)25,26,27.
- Introdurre una coorte di 80-120 vespe T. denrolimi in un tubo di vetro di 2 cm di diametro e 8 cm di lunghezza. Sigillare il tubo con del cotone.
NOTA: Mantenere le vespe ad una temperatura di 25 ± 1 °C, con un ciclo luce/buio di 16 h di luce e 8 h di buio e mantenere un'umidità relativa di circa il 75%. - Presentare una scheda uovo ospite alle vespe per la parassitazione (Figura 1-ii). Lasciare che le vespe depositino le uova nelle uova ospiti per 6 ore, dopodiché rimuovere prontamente le vespe.
NOTA: Evitare di prolungare eccessivamente il periodo di parassitizzazione in quanto ciò può portare al sovraffollamento della prole di T. denrolimi all'interno di un uovo ospite, con conseguente aumento della mortalità delle vespe della prole28,29.
2. Sintesi di dsRNA
- Progetta set di primer contenenti un promotore T7 per la sintesi di RNA a doppio filamento (dsRNA). Scegli un segmento di 300-400 bp dal gene bersaglio (Ferhch) per la sintesi di dsRNA.
- Acquisire set di primer sintetizzati commercialmente per la produzione di dsRNA per il gene bersaglio e dsGFP da utilizzare come controllo negativo.
- Estrarre il contenuto di RNA da 100 vespe T. denrolimi utilizzando il kit di riferimento seguendo il protocollo del produttore9. Controllare la qualità del contenuto di RNA; procedere se il valore di OD260/OD280 è compreso tra 1,8 e 2,09.
- Purificare il contenuto di RNA con 2 μL di tampone 5x (1 U/50 μL), 1 μL di DNAsi (1 U/50 μL) e 6,5 μL di RNA (~100 ng/μL), 0,5 μL di H2O a 42 °C per 2 min.
- Eseguire la reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR) per generare un modello di cDNA con 10 μL di RNA purificato (~100 ng/μL), 4 μL di tampone 5x (1 U/50 μL), 1 μL di miscela enzimatica I (1 U/50 μL) e 4 μL di H2O. Eseguire la RT-PCR utilizzando le seguenti impostazioni: 37 °C per 15 min, 85 °C per 5 s. Conservare il prodotto cDNA a -4 °C fino all'uso.
- Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare le sequenze di dsRNA in conformità con la miscela principale di riferimento (10 μL di Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL di primer diretto [0,4 μM], 0,8 μL di primer inverso [0,4 μM], 0,8 μL di DNA stampo [40 ng/μL] e 7,6 μL di H2O). Eseguire la PCR utilizzando le seguenti impostazioni: 94 °C per 2 min; 35 cicli con 94 °C per 30 s, 60 °C per 30 s, 72 °C per 30; 72 °C per 2 min.
- Valutare la qualità dei prodotti PCR mediante elettroforesi su un gel di agarosio al 2,0% 5,9 e confermare la sequenza target attraverso il sequenziamento Sanger.
- Purificare il prodotto PCR utilizzando il kit di estrazione del gel secondo le linee guida del produttore 9,23.
- Utilizzare un sistema RNAi per sintetizzare dsRNA per il gene bersaglio con 10 μL di tampone 2x (0,02 U/μL), 8 μL di stampo di DNA (75 ng/μL) e 2 μL di miscela enzimatica (1 U/50 μL) con le seguenti impostazioni: 37 °C per 30 min, 70 °C per 10 min e 25 °C per 20 min. Eluire il dsRNA sintetizzato con 30 μL di acqua priva di nucleasi.
- Valutare la qualità del prodotto dsRNA visualizzandolo su un gel di agarosio all'1,0% 5,9. Diluire il dsRNA a 7.000 ng/μL. Controllare la qualità del prodotto dsRNA; procedere se il valore di OD260/OD280 è compreso tra 1,8 e 2,09. Conservare il prodotto dsRNA a -20 °C fino al momento dell'uso.
3. Trapianto di pupe di T. denrolimi
- Coltivare le uova ospiti parassitate per circa 8 giorni a 25 ± 1°C, mantenendo un ciclo di 16 ore di luce/8 ore di buio e un'umidità relativa di ~75%. Le uova dell'ospite parassitato si anneriranno dopo 5 giorni30 (Figura 1-iv,v).
- Trasferire la scheda dell'uovo ospite su un microscopio da dissezione. Utilizzare un paio di aghi di tungsteno (Figura 1-vi) per rimuovere meticolosamente il corion dalle uova ospiti (Figura 1-vii) e recuperare la pupa dall'interno (Figura 1-viii)5,17,18.
NOTA: La punta dell'ago da dissezione deve essere inferiore a 0,05 mm. - Preparare una piastra pulita per il substrato. Versare 10-15 mL di una soluzione di agar da 15 g/L, lasciandola raffreddare naturalmente (Figura 2-i).
NOTA: Miscelare la soluzione di agar con 0,5 g di streptomicina per inibire la crescita di contaminanti in vitro. - Utilizzare un bulino disinfettato per incidere diverse scanalature che misurano 0,2-0,3 mm di profondità e 0,4-0,8 mm di larghezza (Figura 2-ii).
- Utilizzare uno spazzolino (Figura 2-iii) per trapiantare una pupa dall'uovo ospite sezionato in una delle scanalature del substrato di agar (Figura 2-iv).
- Ripetere i passaggi 3.4 e 3.5, trapiantando 100-300 pupe singolarmente nei solchi una per una (Figura 2-v).
4. Micro-iniezione di dsRNA nella pupa di T. denrolimi
- Utilizzare un estrattore di aghi di vetro per tirare un capillare di vetro (Figura 3-i,ii). Impostare il calore su 280, la velocità su 170, il ritardo su 250 e il tiro su 30 su un estrattore ad ago (Figura 3-iii). Preparare più aghi di vetro capillare per la microiniezione (Figura 3-iv,v).
- Smussare la punta dell'ago di vetro utilizzando una piastra abrasiva (Figura 3-vi).
NOTA: Assicurarsi che la punta dell'ago per iniezione rimanga affilata; in caso contrario, può causare la mortalità della pupa o impedire il flusso del reagente attraverso l'ago (Figura 3-vii). - Caricare circa 2 μL della soluzione iniettabile di dsRNA con 7.000 ng/μL nell'ago di iniezione preparato utilizzando una pompa per microiniezione (Figura 3-vii).
- Trasferire il substrato di agar contenente centinaia di pupe sulla piattaforma di un microscopio composto (Figura 3-viii).
- Inserire con cautela l'ago per iniezione nell'addome di una pupa di T. denrolimi con un angolo di ~30° rispetto all'addome sotto la lente (Figura 3-ix).
- Iniettare gradualmente ~5 nL della soluzione iniettabile (fase 4.3) nella pupa di T. denrolimi il più delicatamente possibile.
NOTA: La pupa di T. denrolimi può gonfiarsi leggermente quando viene iniettata la soluzione di dsRNA. L'iniezione di una quantità eccessiva di soluzione nella pupa o l'uso di aghi con aperture troppo grandi può provocare la morte prematura della pupa. Cambiare gli aghi quando si ostruiscono dopo aver iniettato da diverse a decine di pupe. - Ripetere i passaggi 4.5 e 4.6, iniettando dsRNA in 600 pupe una per una.
NOTA: Per un'analisi RT-qPCR affidabile, il contenuto di RNA deve essere isolato da almeno 100 pupe. Iniettare almeno 600 pupe per tre repliche nel trattamento con dsRNA e tre repliche nel controllo negativo con dsGFP 9.
5. Incubazione delle pupe di T. denrolimi
- Trasferire il substrato contenente le pupe iniettate in un'incubatrice a 25 ± 1 °C con un ciclo luce/buio di 16 ore/8 ore e ~75% di umidità relativa.
- Incubare circa 700 pupe di T. denrolimi per trattamento per 24 o 48 ore. Estrarre il contenuto di RNA da un gruppo di 100 pupe per replicato9.
NOTA: Rimuovere le pupe rimpicciolite (pupe morte) dai campioni; in caso contrario, potrebbero verificarsi errori nel rilevamento dell'espressione genica. - Incubare ~50 pupe di T. denrolimi per trattamento fino a quando le vespe non emergono (Figura 3-x). Registrare il tasso di emergenza e il tasso di deformità.
6. Rilevamento dell'espressione genica mirata
- Progettare il set di primer per il gene bersaglio e i geni di riferimento per la RT-qPCR utilizzando uno strumento di progettazione.
NOTA: Assicurarsi che le sequenze dei primer RT-qPCR non si sovrappongano alla regione bersaglio del dsRNA. - Utilizzare il gene forkhead box O (FoxO) come gene di riferimento nell'analisi RT-qPCR; i primer di FoxO sono stati segnalati in precedenza9.
- Ottenere set di primer sintetizzati commercialmente. Eseguire la RT-qPCR con 10 μL di Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL di primer diretto (0,4 μM), 0,8 μL di primer inverso (0,4 μM), 0,8 μL di stampo (10 ng/μL) e 7,6 μL di H2O. Eseguire la RT-qPCR utilizzando le seguenti impostazioni: 95 °C per 30 s; 35 cicli con 95 °C per 5 s, 57 °C per 30 s, 72 °C per 30; 95 °C per 10 s; 60 °C per 5 sec. e 95 °C per 5 s.
- Calcolare il valore di espressione del gene bersaglio utilizzando il metodo 2-ΔΔCt 9,25.
- Utilizzare il test di Kruskal-Wallis per analizzare l'espressione del gene bersaglio sotto l'influenza di diversi trattamenti (dsFerhch, dsGFP, non iniettabile).
NOTA: Evitare l'uso di test parametrici (ad esempio, t-test) per confronti post-hoc poiché l'eteroschedasticità e la non normalità dei dati possono portare a conclusioni errate25.
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Representative Results
Il tasso di emergenza delle pupe di T. denrolimi iniettate con dsFerhch è stato significativamente inferiore a quello di quelle iniettate con dsGFP o di quelle senza iniezione (Tabella 1). Tra le vespe emerse, il 51,85% delle vespe T. denrolimi sottoposte a dsFerhch ha sviluppato piccole ali deformate. Le vespe deformi non sono state osservate nelle vespe iniettate con dsGFP o senza alcuna iniezione (Tabella 1). Inoltre, gli addomi delle pupe di T. denrolimi iniettati con dsFerhch hanno mostrato melanismo, che è il fenotipo del metabolismo anormale del ferro23. Il melanismo non è stato osservato nelle pupe di T. denrolimi iniettate con dsGFP o in quelle senza alcuna iniezione (Figura 4).
L'analisi RT-qPCR ha mostrato che l'espressione di Ferhch nelle pupe di T. denrolimi , 24 ore dopo l'iniezione di dsFerhch (0,6460 ± 0,0056), era significativamente sottoregolata rispetto a quelle iniettate con dsGFP (1,4514 ± 0,5402; P = 0,0415). Tuttavia, non differiva significativamente dall'espressione nelle pupe senza alcuna iniezione (1,0000 ± 0,1953; P = 0,8725). L'espressione di Ferhch nelle pupe di T. denrolimi , 48 ore dopo l'iniezione di dsFerhch (0,5170 ± 0,0575), è risultata significativamente sottoregolata rispetto alle pupe iniettate con dsGFP (0,8515 ± 0,0233; P = 0,0182) e quelli senza alcuna iniezione (1,0548 ± 0,3006; P = 0,0113) (Figura 5).
Figura 1: Raccolta e manutenzione della coltura di Trichogramma denrolimi . (i) Esporre le carte uovo ospite all'irradiazione ultravioletta (UV). (ii) Tagliare la carta con le uova inattivate in cartoncini per le uova. (iii) Presentare una carta dell'uovo ospite alle vespe per la parassitazione. (iv) Coltivare le uova dell'ospite parassitate per 8 giorni. (v) Le uova dell'ospite parassitate si anneriranno dopo 5 giorni. (vi) L'ago da dissezione con punta da 0,04 mm. (vii) Rimuovere il corion dalle uova ospiti. viii) T. denrolimi pupa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Trapianto e incubazione di pupe di Trichogramma denrolimi . (i) Il substrato di agar. (ii) Utilizzare un bulino disinfettato per incidere diverse scanalature sul substrato. (iii) Utilizzare un piccolo pennello per (iv) trapiantare le pupe dall'uovo ospite sezionato in una scanalatura sul substrato. (v) Trapiantare 100-300 pupe singolarmente nelle scanalature una per una. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Procedura di microiniezione. i) Capillare di vetro. (ii) Estrattore di aghi in vetro. (iii) Impostazioni per l'estrattore dell'ago. iv) Preparare aghi di vetro capillari multipli per la microiniezione. v) La punta dell'ago di vetro capillare. (vi) Smussare la punta dell'ago di vetro utilizzando una piastra abrasiva. (vii) Caricare circa 2 μL della soluzione iniettabile di dsRNA. (viii) Microscopio composto. ix) Inserire l'ago per iniezione nell'addome e iniettare la soluzione per iniezione. (x) Comparsa di vespe. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Caratteristiche morfologiche della pupa e della vespa di Trichogramma denrolimi . La pupa e la vespa iniettate con dsFerhch mostrano melanismo con colore del corpo annerito. La vespa iniettata con dsFerhch mostra un paio di piccole ali deformi. Il melanismo e le ali deformate non si osservano nella pupa e nella vespa iniettate con dsGFP o in quelle senza alcuna iniezione. Barre di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Espressione del gene bersaglio Ferhch rispetto a FoxO a 24 ore e 48 ore dopo l'iniezione o la non iniezione di dsFerhch o dsGFP . Le barre di errore indicano gli errori standard. Diverse lettere minuscole indicano una differenza significativa a P < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Variabili | dsFerhch | dsGFP | Non iniettabile | χ2 | P |
| Tasso di emergenza | 54,00% (27/50) b | 78,00% (39/50) un | 90,00% (45/50) un | 17.46 | <.001 |
| Tasso di deformità | 51,85% (14/27) A | 0% (0/39) B | 0% (0/45) B | 49.84 | <.001 |
Tabella 1: L'emergenza e la deformità di Trichogramma denrolimi iniettato da dsFerhch, dsGFP o senza iniezione. Diverse lettere minuscole indicano differenze significative nel tasso di emergenza a P < 0,05. Diverse lettere maiuscole indicano differenze significative nel tasso di deformità a P < 0,05. I valori di χ2 e P elencati nella tabella sono stimati dal test indipendente χ2 e indicano l'effetto totale di tre livelli di trattamento sulla velocità di emergenza e sulla velocità di deformità.
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Discussion
Le vespe Trichogramma sono riconosciute come efficaci agenti di controllo biologico, mirati specificamente a una serie di parassiti lepidotteri in agricoltura e silvicoltura1. Queste minuscole vespe subiscono i loro stadi immaturi all'interno dell'uovo ospite, una caratteristica che presenta sfide nella conduzione di esperimenti RNAi 5,18. Questo studio offre una guida visiva completa per la conduzione di esperimenti di RNAi in T. denrolimi. Dati i tratti biologici condivisi tra le specie di Trichogramma, la procedura può essere prontamente adattata per studi di RNAi o micro-iniezioni in altre specie di Trichogramma e specie endoparassitarie con alcuni aggiustamenti.
La procedura introduce diversi approcci innovativi, facilitando micro-iniezioni efficienti di contenuto di dsRNA, semplificando il processo RT-qPCR per T. denrolimi e ottimizzando il trapianto e l'incubazione in vitro delle pupe di T. denrolimi. Secondo questo studio, il tasso di emergenza delle pupe trapiantate ha raggiunto il 90% senza alcuna iniezione. Quando le pupe trapiantate sono state sottoposte all'iniezione di dsGFP, il tasso di emergenza di queste pupe è stato del 78% (Tabella 1). Il successo degli esperimenti di RNAi in Trichogramma dipende in modo significativo da microiniezioni precise e dall'attenta incubazione delle pupe in vitro. La suscettibilità delle pupe isolate di Trichogramma ai danni durante l'iniezione può derivare da aghi per microiniezione sovradimensionati, tecniche di iniezione affrettate o contaminazione microbica sul substrato dell'agar. Il metodo visivo dettagliato qui presentato offre anche approfondimenti sulla tecnica di microiniezione in T. denrolimi, che non è solo essenziale per altri strumenti di editing genetico (ad esempio, il sistema CRISPR-Cas9) ma anche per condurre vari esperimenti fisiologici (ad esempio, la transinfezione artificiale di simbionti e la somministrazione di inibitori o attivatori di risposte fisiologiche)1,14,15,16.
Per l'analisi RT-qPCR, in questo studio sono state iniettate circa 1.500 pupe. Date le piccole dimensioni di T. denrolimi, è necessario un minimo di 100 pupe per replicato per garantire una qualità e una quantità di RNA sufficienti per l'analisi RT-qPCR9. Di conseguenza, l'iniezione di dsRNA in centinaia di pupe è imperativa. Inoltre, sono necessari miglioramenti nella procedura di isolamento dell'RNA (ad esempio, l'impiego di un kit specifico per l'estrazione dell'RNA, il perfezionamento dei programmi di PCR) per ottenere il contenuto di RNA idoneo da un numero ridotto di individui di Trichogramma per replica. Un approccio alternativo prevede la somministrazione di dsRNA attraverso l'ammollo o l'alimentazione, che può essere più conveniente per ottenere un numero sostanziale di individui sottoposti a dsRNA. Inoltre, è essenziale notare che l'attuale procedura RNAi è applicabile solo allo stadio pupale di T. denrolimi. La ricerca futura dovrebbe porre particolare enfasi sullo sviluppo di metodi efficaci di RNAi per gli stadi embrionali e larvali15,16.
In sintesi, questo studio ha delineato un metodo RNAi efficiente in T. denrolimi. Per decenni, le funzioni genetiche all'interno dell'intero genere Trichogramma sono state raramente esplorate. La presente metodologia fornisce un modello robusto per lo studio delle regolazioni geniche durante lo sviluppo e le attività fisiologiche nelle vespe Trichogramma. La ricerca futura dovrebbe enfatizzare lo sviluppo di strumenti genetici, come l'editing del genoma e l'interferenza dell'RNA nelle vespe Trichogramma. L'esplorazione approfondita della biologia molecolare delle vespe Trichogramma offre preziose informazioni per migliorare l'efficienza dell'allevamento di massa e le prestazioni sul campo di questi agenti di controllo biologico per il controllo dei parassiti 8,9.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dai progetti della National Natural Science Foundation of China (32172476, 32102275), dal Programma di innovazione tecnologica e scientifica agricola (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) e dai Fondi centrali che guidano lo sviluppo scientifico e tecnologico locale (XZ202301YD0042C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2x ES Taq MasterMix (Dye) | Cowin Biotech, China | CW0690H | To amplify the dsRNA sequences |
| 20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6) | Sangon Biotech, China | B540627-0500 | To dilute dsRNA |
| Agar strip | Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China | n/a | To make culture medium |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech, China | A610028 | To make culture medium |
| Bioer Constant temperature metal bath | BIOER, China | MB-102 | To synthesis dsRNA |
| Borosilicate glass capillary | WPI, USA | 1B100-4 | To pull capillary glass needle |
| Clean bench | Airtech, China | SW-CJ-1FD | To extract RNA |
| Double distilled water | Sangon Biotech, China | A500197-0500 | To dilute cDNA |
| Environmental Testing chamber | Panasonic, Japan | MLR-352H-PC | To culture T. denrolimi |
| Eppendorf Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5418R | To store RNA content |
| Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendrof, Germany | FemtoJet 4i | To inject T. denrolimi |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5810R | Centrifuge |
| Ethanol solution (75%, RNase-free) | Aladdin, China | M052131-500ml | To extract RNA |
| Gel Extraction Kit | Omega, USA | D25000-02 | To extract cDNA |
| GUM Arabic | Solarbio, China | CG5991-500g | To make egg card |
| Isopropyl alchohol | Aladdin, China | 80109218 | To extract RNA |
| Laser-Based Micropipette Puller | SUTTER, USA | P-2000 | To pull capillary glass needle |
| Microloader | Eppendrof, Germany | 20 µL | To load dsRNA |
| Multi-sample tissue grinder | LICHEN, China | LC-TG-24 | To grind T. denrolimi |
| Needle Grinder | SUTTER, USA | BV-10-E | To grind capillary glass needle |
| Nuclease-Free Water | Sangon Biotech, China | To dilute RNA | |
| OLYMPUS Microscope | OLYMPUS, Japan | XZX16 | To observe T. denrolimi |
| PCR machine | Bio-rad, USA | S-1000 | For DNA amplification |
| PowerPac Basic | Bio-rad, USA | PowerPacTM Basic | To detect the quality of dsRNA |
| Primer of dsGFP (Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA |
||
| Primer of dsGFP (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG |
||
| Primer of Ferhch for qPCR (Forward) | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
| Primer of Ferhch for qPCR (Reverse) | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
| Primer of Ferhch for RNAi (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC |
||
| Primer of Ferhch for RNAi(Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG |
||
| Primer of FoxO for qPCR (Forward) | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
| Primer of FoxO for qPCR (Reverse) | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
| PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) | TaKaRa, Japan | RR047A | |
| Quantitative Real-time PCR | Bio-rad, USA | CFX 96 Touch | To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) |
| Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
| T7 RiBoMAX Express RNAi System | Promega, USA | P1700 | To synthesis dsRNA in vitro |
TB Green Premix Ex TaqTM  (Til RnaseH Plus) |
TaKaRa, Japan | RR820A | To perform RT-qPCR |
| Trichloromethane | KESHI, China | GB/T682-2002 | To extract RNA |
| TRIzol Reagent | Ambion, USA | 15596018 | To extract total RNA content from samples |
| Ultra-low Temperature Freezer | Thermo, USA | Forma 911 |
References
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