Summary
A manipulação de RNA de interferência (RNAi) apresenta um formidável desafio em muitas espécies de parasitoides com tamanho diminuto, como as vespas Trichogramma . Este estudo delineou um método RNAi eficiente em Trichogramma denrolimi. A presente metodologia fornece um modelo robusto para investigar a regulação gênica em vespas Trichogramma .
Abstract
Os parasitoides de ovos, Trichogramma spp, são reconhecidos como eficientes agentes de controle biológico contra diversas pragas de lepidópteros na agricultura e florestas. Os estágios imaturos da prole de Trichogramma desenvolvem-se dentro do ovo hospedeiro, exibindo notável diminuividade (aproximadamente 0,5 mm de comprimento adulto). A metodologia de RNA-interferência (RNAi) tem emergido como uma ferramenta crucial para elucidar funções gênicas em inúmeros organismos. No entanto, a manipulação de RNAi em certas espécies de pequenos parasitoides, como Trichogramma, tem geralmente representado desafios significativos. Neste estudo, apresentamos um método RNAi eficiente em Trichogramma denrolimi. O procedimento delineado abrange a aquisição e o isolamento de espécimes individuais de T. dendrolimi a partir de ovos hospedeiros, o planejamento e a síntese de RNA de fita dupla (dsRNA), o transplante e cultivo in vitro de pupas de T. dendrolimi , a microinjeção de dsRNA e a subsequente avaliação do knockdown do gene alvo através da análise de RT-qPCR. Este estudo fornece um procedimento abrangente e visualmente detalhado para a realização de experimentos de RNAi em T. dendrolimi, permitindo que os pesquisadores investiguem a regulação gênica nesta espécie. Além disso, esta metodologia é adaptável para estudos de RNAi ou micro-injeções em outras espécies de Trichogramma com pequenos ajustes, tornando-se uma referência valiosa para a realização de experimentos de RNAi em outras espécies endoparasitárias.
Introduction
Trichogramma spp é um grupo de parasitoides de ovos que tem sido extensivamente utilizado como agentes de controle biológico altamente eficientes contra um amplo espectro de lepidópteros pragas em ecossistemas agrícolas e florestais em todo o mundo 1,2,3,4. A aplicação de Trichogramma criado em massa proporciona uma abordagem ambientalmente correta para o manejo sustentável de pragas 5,6,7. A compreensão da biologia molecular de vespas Trichogramma fornece informações valiosas para aumentar a eficiência de criação em massa e o desempenho em campo desses agentes de controle biológico 8,9, investigando a metodologia de regulação gênica e edição do genoma10.
Desde a descoberta da interferência genética específica mediada por RNA de fita dupla (dsRNA) em Caenorhabditis elegans em 1998, o método de interferência de RNA (RNAi) evoluiu para um kit de ferramentas genético vital para explorar os mecanismos regulatórios de organismos suprimindo a expressão de genes-alvo11. Experimentos com RNAi tornaram-se uma metodologia padrão amplamente aplicada para estudar a função gênica em inúmeras espécies de insetos12,13. No entanto, a manipulação de RNAi representa um formidável desafio em muitas espécies de parasitoides, particularmente naquelas pertencentes à família endoparasitária Chalcidoidea14,15,16. O método RNAi foi documentado em pelo menos 13 espécies de parasitoides 14,15,16,17,18,19. Dentre estas, a abordagem RNAi tem sido amplamente conduzida em vespas Nasonia e é aplicável em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo embriões, larvas, pupas e adultos 14,15,16. Vale ressaltar que as vespas Nasonia são ectoparasitóides, com seus filhotes se desenvolvendo no espaço intersticial entre a pupa hospedeira e o pupário, possibilitando seu cultivo in vitro e fazendo-os tolerar certos tratamentos, como a microinjeção. Ao contrário das vespas Nasonia, os indivíduos de Trichogramma passam por todo o seu desenvolvimento embrionário, larval e pupal dentro do ovo hospedeiro. A camada nos estágios embrionário e larval (que pode impedir a permeabilidade ao dsRNA), a vulnerabilidade a danos e a dificuldade de sobrevivência in vitro apresentam obstáculos formidáveis 20,21,22. Além disso, o tamanho diminuto dos indivíduos de Trichogramma, aproximadamente ~0,5 mm no comprimento adulto ou pupal, torna-os extremamente intrincados para manipular20,21,22.
No presente estudo, delineamos um procedimento abrangente para a realização de experimentos de RNA de interferência (RNAi) em Trichogramma denrolimi Matsumura. Esse procedimento engloba os seguintes procedimentos: (1) o planejamento e síntese de RNA de fita dupla (dsRNA), (2) microinjeção de pupas de T. denrolimi, (3) o transplante e incubação in vitro dessas pupas e (4) a detecção de knockdown do gene alvo por meio da análise de RT-qPCR. O gene alvo selecionado para o experimento RNAi é a homologia da cadeia pesada de ferritina (Ferhch). FerHCH, uma proteína ligadora de ferro, contém um centro de ferroxidase dotado de capacidades antioxidantes, facilitando a oxidação de Fe2+ a Fe3+. Desempenha um papel indispensável no crescimento e desenvolvimento de vários organismos, mantendo o equilíbrio redox e a homeostase do ferro. A depleção de FerHCH pode resultar no acúmulo excessivo de ferro, levando a danos teciduais irreversíveis e, muitas vezes, culminando em alterações fenotípicas significativas, incluindo defeitos de crescimento, deformidades e mortalidade23,24. Este estudo oferece um guia passo-a-passo para a condução de RNAi em T. denrolimi, que será inestimável para investigar as funções gênicas dentro do contexto mais amplo de vespas Trichogramma.
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Protocol
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos, software e reagentes usados neste protocolo.
1. Coleta e manutenção da cultura de insetos
- Aderir um grupo de ~5.000 ovos de Corcyra cephalonica (Stainton) em um cartão de 9 cm por 16 cm usando uma solução 1:5 (v/v) de goma arábica em pó e água25,26.
NOTA: Evite anexar muitos ovos de anfitrião ao cartão, pois a superlotação torna impraticável para procedimentos subsequentes de transferência e dissecação. - Para evitar a eclosão dos ovos do hospedeiro, sujeitar os cartões de ovos do hospedeiro a 30 min de irradiação ultravioleta (UV) (Figura 1-i). Em seguida, corte o papel com ovos inativados em cartões de ovos medindo 1 cm de espessura e 8 cm de diâmetro, cada um contendo aproximadamente 300-500 ovos (Figura 1-ii)25,26,27.
- Introduzir uma coorte de 80-120 vespas T. denrolimi em um tubo de vidro medindo 2 cm de diâmetro e 8 cm de comprimento. Sele o tubo com algodão.
NOTA: Manter as vespas a uma temperatura de 25 ± 1 °C, com um ciclo claro/escuro de 16 h de luz e 8 h de escuridão e manter uma umidade relativa de aproximadamente 75%. - Apresentar um cartão de ovo hospedeiro às vespas para parasitização (Figura 1-ii). Permita que as vespas depositem seus ovos nos ovos hospedeiros por 6 h, após o que imediatamente remover as vespas.
NOTA: Evitar prolongar excessivamente o período de parasitização, pois isso pode levar à superlotação da prole de T. denrolimi dentro de um ovo hospedeiro, resultando em aumento da mortalidade da vespa da prole28,29.
2. Síntese de dsRNA
- Projetar conjuntos de primers contendo um promotor T7 para a síntese de RNA de fita dupla (dsRNA). Escolha um segmento de 300-400 pb do gene alvo (Ferhch) para a síntese de dsRNA.
- Adquirir conjuntos de primers sintetizados comercialmente para a produção de dsRNA para o gene alvo e dsGFP para uso como controle negativo.
- Extrair o conteúdo de RNA de 100 vespas T. denrolimi usando o kit referenciado seguindo o protocolo do fabricante9. Verificar a qualidade do conteúdo de RNA; prossiga se o valor de OD260/OD280 variar de 1,8 a 2,09.
- Purificar o conteúdo de RNA com 2 μL de tampão 5x (1 U/50 μL), 1 μL de DNAse (1 U/50 μL) e 6,5 μL de RNA (~100 ng/μL), 0,5 μL de H2O a 42 °C por 2 min.
- Realizar reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) para gerar um molde de cDNA com 10 μL de RNA purificado (~100 ng/μL), 4 μL de tampão 5x (1 U/50 μL), 1 μL de Enzyme Mix I (1 U/50 μL) e 4 μL de H2O. Realize RT-PCR usando as seguintes configurações: 37 °C durante 15 min, 85 °C por 5 s. Conservar o produto de cDNA a -4 °C até à utilização.
- Realizar reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar as sequências de dsRNA de acordo com a mistura mestre referenciada (10 μL de Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL de primer forward [0,4 μM], 0,8 μL de primer reverso [0,4 μM], 0,8 μL de molde de DNA [40 ng/μL] e 7,6 μL de H2O). Realizar PCR usando as seguintes configurações: 94 °C por 2 min; 35 ciclos com 94 °C por 30 s, 60 °C por 30 s, 72 °C por 30; 72 °C por 2 min.
- Avaliar a qualidade dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose a 2,0% 5,9 e confirmar a sequência alvo através do sequenciamento de Sanger.
- Purificar o produto da PCR utilizando o Kit de Extração em Gel conforme orientação do fabricante 9,23.
- Utilizar um sistema RNAi para sintetizar dsRNA para o gene alvo com 10 μL de tampão 2x (0,02 U/μL), 8 μL de molde de DNA (75 ng/μL) e 2 μL de mistura enzimática (1 U/50 μL) com as seguintes configurações: 37 °C por 30 min, 70 °C por 10 min e 25 °C por 20 min. Eluir o dsRNA sintetizado com 30 μL de Água Livre de Nuclease.
- Avaliar a qualidade do produto de dsRNA visualizando-o em gel de agarose a 1,0% 5,9. Diluir o dsRNA para 7.000 ng/μL. Verificar a qualidade do produto dsRNA; prossiga se o valor de OD260/OD280 variar de 1,8 a 2,09. Conservar o produto dsRNA a -20 °C até à utilização.
3. Transplante de pupas de T. denrolimi
- Cultivar os ovos do hospedeiro parasitado por aproximadamente 8 dias a 25 ± 1°C, mantendo um ciclo claro/8 h escuro de 16 h e umidade relativa de ~75%. Os ovos do hospedeiro parasitado escurecerão após5 dias 30 (Figura 1-iv,v).
- Transfira o cartão do ovo hospedeiro para um microscópio dissecante. Empregar um par de agulhas de tungstênio (Figura 1-vi) para remover meticulosamente o córion dos ovos hospedeiros (Figura 1-vii) e recuperar a pupa de dentro (Figura 1-viii)5,17,18.
NOTA: A ponta da agulha dissecante deve ser inferior a 0,05 mm. - Prepare uma placa limpa para o substrato. Despejar 10-15 mL de uma solução de ágar 15 g/L, permitindo esfriar naturalmente (Figura 2-i).
NOTA: Misturar a solução de ágar com 0,5 g de estreptomicina para inibir o crescimento de contaminantes in vitro. - Empregar um gravador desinfetado para condicionar vários sulcos medindo 0,2-0,3 mm de profundidade e 0,4-0,8 mm de largura (Figura 2-ii).
- Utilizar uma pequena escova (Figura 2-iii) para transplantar uma pupa do ovo hospedeiro dissecado para um dos sulcos do substrato ágar (Figura 2-iv).
- Repetir os passos 3.4 e 3.5, transplantando 100-300 pupas individualmente nos sulcos, uma a uma (Figura 2-v).
4. Micro-injeção de dsRNA em T. denrolimi pupa
- Utilizar extrator com agulha de vidro para tracionar capilar de vidro (Figura 3-i,ii). Ajuste o Heat para 280, o Velocity para 170, o Delay para 250 e o Pull para 30 em um extrator de agulha (Figura 3-iii). Preparar múltiplas agulhas de vidro capilar para microinjeção (Figura 3-iv,v).
- Biselar a ponta da agulha de vidro com placa abrasiva (Figura 3-vi).
NOTA: Certifique-se de que a ponta da agulha de injeção permanece afiada; caso contrário, pode resultar em mortalidade pupal ou impedir o fluxo de reagentes através da agulha (Figura 3-vii). - Carregar aproximadamente 2 μL da solução de injeção de dsRNA com 7.000 ng/μL na agulha de injeção preparada usando uma microbomba de injeção (Figura 3-vii).
- Transfira o substrato de ágar contendo centenas de pupas para a plataforma de um microscópio composto (Figura 3-viii).
- Insira cuidadosamente a agulha de injeção no abdome de uma pupa de T. denrolimi em um ângulo de ~30° em relação ao abdome sob a lente (Figura 3-ix).
- Injetar gradualmente ~5 nL da solução de injeção (passo 4.3) na pupa de T. denrolimi o mais suavemente possível.
NOTA: A pupa de T. denrolimi pode inchar ligeiramente à medida que a solução de dsRNA é injetada. Injetar uma quantidade excessiva de solução na pupa ou usar agulhas com aberturas excessivamente grandes pode resultar em morte prematura da pupa. Troque as agulhas quando ficarem entupidas depois de injetar várias a dezenas de pupas. - Repita as etapas 4.5 e 4.6, injetando dsRNA em 600 pupas uma a uma.
NOTA: Para uma análise confiável de RT-qPCR, o conteúdo de RNA deve ser isolado de pelo menos 100 pupas. Injetar pelo menos 600 pupas para três repetições no tratamento com dsRNA e três repetições no controle negativo para dsGFP 9.
5. Incubação de pupas de T. denrolimi
- Transfira o substrato contendo pupas injetadas para uma incubadora a 25 ± 1 °C com um ciclo claro/escuro de 16 h/8 h e ~75% UR.
- Incubar aproximadamente 700 pupas de T. denrolimi por tratamento durante 24 h ou 48 h. Extrair o conteúdo de RNA de um grupo de 100 pupas por réplica9.
OBS: Retirar as pupas encolhidas (pupas mortas) das amostras; caso contrário, pode resultar em erros na detecção da expressão gênica. - Incubar ~50 pupas de T. denrolimi por tratamento até que as vespas surjam (Figura 3-x). Registre a taxa de emergência e a taxa de deformidade.
6. Detecção da expressão gênica direcionada
- Projete o conjunto de primers para o gene alvo e genes de referência para RT-qPCR usando uma ferramenta de design.
NOTA: Certifique-se de que as sequências dos primers RT-qPCR não se sobreponham à região alvo do dsRNA. - Empregar o gene forkhead box O (FoxO) como gene de referência na análise de RT-qPCR; os primers de FoxO foram relatados anteriormente9.
- Obter conjuntos de primers sintetizados comercialmente. Realizar RT-qPCR com 10 μL de Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL de primer forward (0,4 μM), 0,8 μL de primer reverso (0,4 μM), 0,8 μL de template (10 ng/μL) e 7,6 μL de H2O. Realizar RT-qPCR usando as seguintes configurações: 95 °C por 30 s; 35 ciclos com 95 °C por 5 s, 57 °C por 30 s, 72 °C por 30; 95 °C por 10 s; 60 °C por 5 s e 95 °C por 5 s.
- Calcular o valor de expressão do gene alvo utilizando o método 2-ΔΔCt 9,25.
- Empregar o teste de Kruskal-Wallis para analisar a expressão do gene alvo sob a influência de diferentes tratamentos (dsFerhch, dsGFP, não injeção).
NOTA: Evite o uso de testes paramétricos (por exemplo, teste t) para comparações post-hoc, pois a heterocedasticidade e a não normalidade dos dados podem levar a conclusões errôneas25.
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Representative Results
A taxa de emergência de pupas de T. denrolimi injetadas com dsFerhch foi significativamente menor do que a daquelas injetadas com dsGFP ou sem injeção (Tabela 1). Entre as vespas emergidas, 51,85% das vespas T. denrolimi submetidas a dsFerhch desenvolveram pequenas asas deformadas. As vespas deformadas não foram observadas nas vespas injetadas com dsGFP ou sem qualquer injeção (Tabela 1). Além disso, o abdome de pupas de T. denrolimi injetadas com dsFerhch exibiu melanismo, que é o fenótipo do metabolismo anormal do ferro23. O melanismo não foi observado em pupas de T. denrolimi injetadas com dsGFP ou sem qualquer injeção (Figura 4).
A análise de RT-qPCR mostrou que a expressão de Ferhch em pupas de T. denrolimi , 24 h após a injeção de dsFerhch (0,6460 ± 0,0056), foi significativamente diminuída em comparação com aquelas injetadas com dsGFP (1,4514 ± 0,5402; P = 0,0415). No entanto, não diferiu significativamente da expressão em pupas sem qualquer injeção (1,0000 ± 0,1953; P = 0,8725). A expressão de Ferhch em pupas de T. denrolimi , 48 h após a injeção de dsFerhch (0,5170 ± 0,0575), foi significativamente diminuída em comparação com pupas injetadas com dsGFP (0,8515 ± 0,0233; P = 0,0182) e sem injeção (1,0548 ± 0,3006; P = 0,0113) (Figura 5).
Figura 1: Coleta e manutenção da cultura de Trichogramma denrolimi . (i) Expor os cartões de ovos hospedeiros à irradiação ultravioleta (UV). (ii) Corte o papel com ovos inativados em cartões de ovos. (iii) Apresentar um cartão de ovo hospedeiro às vespas para parasitização. (iv) Cultivar os ovos do hospedeiro parasitado por 8 dias. (v) Os ovos do hospedeiro parasitado escurecerão após 5 dias. (vi) Agulha dissecante com ponta de 0,04 mm. vii) Remover o córion dos ovos hospedeiros. (viii) pupa de T. denrolimi . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Transplante e incubação de pupas de Trichogramma denrolimi . i) O substrato de ágar. (ii) Empregar um gravador desinfetado para condicionar vários sulcos no substrato. (iii) Use uma pequena escova para (iv) transplantar as pupas do ovo hospedeiro dissecado em um sulco no substrato. (v) Transplantar 100-300 pupas individualmente nos sulcos, uma a uma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Procedimento de micro-injeção. i) Capilar de vidro. (ii) Puxador de agulha de vidro. (iii) Configurações para puxador de agulhas. (iv) Preparar múltiplas agulhas de vidro capilar para microinjeção. (v) A ponta da agulha de vidro capilar. (vi) Biselar a ponta da agulha de vidro com uma placa abrasiva. (vii) Carregar aproximadamente 2 μL da solução injetável de dsRNA. (viii) Microscópio composto. ix) Introduza a agulha de injeção no abdómen e injete a solução de injeção. (x) Emergência de vespas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Características morfológicas da pupa e vespa Trichogramma denrolimi . A pupa e a vespa injetadas com dsFerhch exibem melanismo com cor do corpo enegrecida. A vespa injetada com dsFerhch mostra um par de pequenas asas deformadas. O melanismo e as asas deformadas não são observados na pupa e vespa injetadas com dsGFP ou naquelas sem qualquer injeção. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Expressão do gene alvo Ferhch em relação ao FoxO em 24 h e 48 h pós-injeção deFerhch ou dsGFP , ou não injeção. As barras de erro indicam os erros padrão. Letras minúsculas diferentes indicam uma diferença significativa em P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Variáveis | dsFerhch | dsGFP | Não injeção | χ2 | P |
| Taxa de emergência | 54,00% (27/50) b | 78,00% (39/50) a | 90,00% (45/50) a | 17.46 | <.001 |
| Taxa de deformidade | 51,85% (14/27) A | 0% (0/39) B | 0% (0/45) B | 49.84 | <.001 |
Tabela 1: Surgimento e deformidade de Trichogramma denrolimi injetado por dsFerhch, dsGFP ou sem injeção. Diferentes letras minúsculas indicam diferenças significativas na taxa de emergência em P < 0,05. Letras maiúsculas diferentes indicam diferenças significativas na taxa de deformidade em P < 0,05. Os valores de χ2 e P listados na tabela são estimados pelo teste independente do χ2 e indicam o efeito total de três níveis de tratamento sobre a taxa de emergência e taxa de deformidade.
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Discussion
As vespas Trichogramma são reconhecidas como agentes eficazes de controle biológico, visando especificamente uma variedade de pragas de lepidópteros na agricultura e silvicultura1. Essas vespas diminutas passam por seus estágios imaturos dentro do ovo hospedeiro, característica que apresenta desafios na condução de experimentos com RNAi 5,18. Este estudo oferece um guia visual abrangente para a realização de experimentos de RNAi em T. denrolimi. Dadas as características biológicas compartilhadas entre as espécies de Trichogramma, o procedimento pode ser prontamente adaptado para estudos de RNAi ou micro-injeções em outras espécies de Trichogramma e espécies endoparasitárias com alguns ajustes.
O procedimento introduz várias abordagens inovadoras, facilitando micro-injeções eficientes de conteúdo de dsRNA, agilizando o processo de RT-qPCR para T. denrolimi e otimizando o transplante e incubação in vitro de pupas de T. denrolimi. De acordo com este estudo, a taxa de emergência de pupas transplantadas chegou a 90% sem qualquer injeção. Quando as pupas transplantadas foram submetidas à injeção deds GFP, a taxa de emergência dessas pupas foi de 78% (Tabela 1). Experimentos bem-sucedidos de RNAi em Trichogramma dependem significativamente de microinjeções precisas e da incubação cuidadosa de pupas in vitro. A suscetibilidade de pupas isoladas de Trichogramma a danos durante a injeção pode resultar de agulhas de microinjeção superdimensionadas, técnicas de injeção apressadas ou contaminação microbiana no substrato de ágar. O método visual detalhado aqui apresentado também oferece informações sobre a técnica de microinjeção em T. denrolimi, que não é apenas essencial para outras ferramentas de edição genética (por exemplo, sistema CRISPR-Cas9), mas também para a realização de vários experimentos fisiológicos (por exemplo, transinfecção artificial de simbiontes e liberação de inibidores ou ativadores de respostas fisiológicas)1,14,15,16.
Para a análise da RT-qPCR, aproximadamente 1.500 pupas foram injetadas neste estudo. Dado o pequeno tamanho de T. denrolimi, um mínimo de 100 pupas por réplica é necessário para garantir qualidade e quantidade de RNA suficientes para a análise de RT-qPCR9. Consequentemente, injetar dsRNA em centenas de pupas é imperativo. Além disso, melhorias no procedimento de isolamento de RNA (por exemplo, empregando um kit de extração de RNA específico, refinando programas de PCR) são necessárias para obter conteúdo de RNA elegível de um número reduzido de indivíduos de Trichogramma por replicação. Uma abordagem alternativa envolve a liberação de dsRNA através de embebição ou alimentação, o que pode ser mais conveniente para a obtenção de um número substancial de indivíduos submetidos a dsRNA. Além disso, é essencial notar que o procedimento atual de RNAi é aplicável apenas na fase pupal de T. denrolimi. Pesquisas futuras devem dar especial ênfase ao desenvolvimento de métodos eficientes de RNAi para as fases embrionária e larval 15,16.
Em resumo, este estudo delineou um método RNAi eficiente em T. denrolimi. Durante décadas, as funções gênicas dentro de todo o gênero Trichogramma foram raramente exploradas. A presente metodologia fornece um modelo robusto para investigar a regulação gênica durante atividades fisiológicas e de desenvolvimento em vespas Trichogramma. Pesquisas futuras devem enfatizar o desenvolvimento de ferramentas genéticas, como edição do genoma e interferência de RNA em vespas Trichogramma. A exploração em profundidade da biologia molecular de vespas Trichogramma oferece informações valiosas para melhorar a eficiência de criação massal e o desempenho em campo desses agentes de controle biológico para o controle de pragas 8,9.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelos Projetos da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32172476, 32102275), pelo Programa de Inovação em Ciência e Tecnologia Agrícola (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) e pelos Fundos Centrais Orientando o Desenvolvimento Científico e Tecnológico Local (XZ202301YD0042C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2x ES Taq MasterMix (Dye) | Cowin Biotech, China | CW0690H | To amplify the dsRNA sequences |
| 20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6) | Sangon Biotech, China | B540627-0500 | To dilute dsRNA |
| Agar strip | Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China | n/a | To make culture medium |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech, China | A610028 | To make culture medium |
| Bioer Constant temperature metal bath | BIOER, China | MB-102 | To synthesis dsRNA |
| Borosilicate glass capillary | WPI, USA | 1B100-4 | To pull capillary glass needle |
| Clean bench | Airtech, China | SW-CJ-1FD | To extract RNA |
| Double distilled water | Sangon Biotech, China | A500197-0500 | To dilute cDNA |
| Environmental Testing chamber | Panasonic, Japan | MLR-352H-PC | To culture T. denrolimi |
| Eppendorf Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5418R | To store RNA content |
| Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendrof, Germany | FemtoJet 4i | To inject T. denrolimi |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5810R | Centrifuge |
| Ethanol solution (75%, RNase-free) | Aladdin, China | M052131-500ml | To extract RNA |
| Gel Extraction Kit | Omega, USA | D25000-02 | To extract cDNA |
| GUM Arabic | Solarbio, China | CG5991-500g | To make egg card |
| Isopropyl alchohol | Aladdin, China | 80109218 | To extract RNA |
| Laser-Based Micropipette Puller | SUTTER, USA | P-2000 | To pull capillary glass needle |
| Microloader | Eppendrof, Germany | 20 µL | To load dsRNA |
| Multi-sample tissue grinder | LICHEN, China | LC-TG-24 | To grind T. denrolimi |
| Needle Grinder | SUTTER, USA | BV-10-E | To grind capillary glass needle |
| Nuclease-Free Water | Sangon Biotech, China | To dilute RNA | |
| OLYMPUS Microscope | OLYMPUS, Japan | XZX16 | To observe T. denrolimi |
| PCR machine | Bio-rad, USA | S-1000 | For DNA amplification |
| PowerPac Basic | Bio-rad, USA | PowerPacTM Basic | To detect the quality of dsRNA |
| Primer of dsGFP (Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA |
||
| Primer of dsGFP (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG |
||
| Primer of Ferhch for qPCR (Forward) | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
| Primer of Ferhch for qPCR (Reverse) | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
| Primer of Ferhch for RNAi (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC |
||
| Primer of Ferhch for RNAi(Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG |
||
| Primer of FoxO for qPCR (Forward) | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
| Primer of FoxO for qPCR (Reverse) | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
| PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) | TaKaRa, Japan | RR047A | |
| Quantitative Real-time PCR | Bio-rad, USA | CFX 96 Touch | To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) |
| Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
| T7 RiBoMAX Express RNAi System | Promega, USA | P1700 | To synthesis dsRNA in vitro |
TB Green Premix Ex TaqTM  (Til RnaseH Plus) |
TaKaRa, Japan | RR820A | To perform RT-qPCR |
| Trichloromethane | KESHI, China | GB/T682-2002 | To extract RNA |
| TRIzol Reagent | Ambion, USA | 15596018 | To extract total RNA content from samples |
| Ultra-low Temperature Freezer | Thermo, USA | Forma 911 |
References
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