Summary
Questo articolo evidenzia l'efficacia della tecnica dell'elastografia a coerenza ottica (OCE) nel caratterizzare rapidamente e in modo non distruttivo le proprietà elastiche del biofilm. Chiariamo le procedure critiche di implementazione OCE per misurazioni accurate e presentiamo i valori del modulo di Young per due biofilm granulari.
Abstract
I biofilm sono biomateriali complessi che comprendono una rete ben organizzata di cellule microbiche racchiuse in sostanze polimeriche extracellulari (EPS) autoprodotte. Questo articolo presenta un resoconto dettagliato dell'implementazione di misure di elastografia a coerenza ottica (OCE) su misura per la caratterizzazione elastica dei biofilm. L'OCE è una tecnica ottica non distruttiva che consente la mappatura locale della microstruttura, della morfologia e delle proprietà viscoelastiche di materiali morbidi parzialmente trasparenti con un'elevata risoluzione spaziale e temporale. Forniamo una guida completa che descrive in dettaglio le procedure essenziali per la corretta implementazione di questa tecnica, insieme a una metodologia per stimare il modulo di Young dei biofilm granulari dalle misurazioni raccolte. Questi consistono nella configurazione del sistema, nell'acquisizione dei dati e nella post-elaborazione. Nella discussione, approfondiamo la fisica sottostante dei sensori utilizzati in OCE ed esploriamo i limiti fondamentali per quanto riguarda le scale spaziali e temporali delle misurazioni OCE. Concludiamo con le potenziali direzioni future per l'avanzamento della tecnica OCE per facilitare le misurazioni elastiche dei biofilm ambientali.
Introduction
Nel trattamento delle acque reflue e nel recupero delle risorse idriche, i biofilm benefici nei reattori di crescita collegati sono sempre più utilizzati per consentire ai microbi di convertire gli inquinanti indesiderati, come la materia organica, l'azoto e il fosfato, in forme stabilizzate che possono essere facilmente rimosse dall'acqua1. In questi sistemi, la funzione emergente del biofilm, vale a dire le trasformazioni biochimiche, è strettamente associata alla diversità dei microbi che risiedono in esso e ai nutrienti che questimicrobi ricevono. Di conseguenza, la crescita continua del biofilm può rappresentare una sfida per il mantenimento di una funzionalità coerente del reattore perché la nuova crescita del biofilm può alterare i processi metabolici complessivi del biofilm, le caratteristiche di trasferimento di massa e la composizione della comunità. Stabilizzare il più possibile l'ambiente del biofilm può proteggere da tali cambiamenti3. Ciò include garantire un flusso costante di nutrienti e mantenere stabile la struttura del biofilm con uno spessore costante4. Il monitoraggio della rigidità e della struttura fisica del biofilm consentirebbe ai ricercatori di ottenere informazioni sulla salute generale e sul funzionamento del biofilm.
I biofilm presentano proprietà viscoelastiche 5,6,7. Questa natura viscoelastica si traduce in una combinazione di una deformazione istantanea e lenta, dipendente dal tempo, in risposta a forze meccaniche esterne. Un aspetto unico dei biofilm è che, quando sono sottoposti a una deformazione sostanziale, rispondono come liquidi viscosi. Al contrario, se sottoposti a deformazioni minori, la loro risposta è paragonabile a quella dei solidi5. Inoltre, all'interno di questa regione di piccola deformazione, c'è un intervallo di deformazione sotto il quale i biofilm mostrano una relazione lineare forza-spostamento 5,6,7. Le deformazioni all'interno di questo intervallo lineare sono ottimali per valutare le caratteristiche meccaniche del biofilm perché producono misure riproducibili. Diverse tecniche possono quantificare la risposta elastica all'interno di questo intervallo. L'elastografia a coerenza ottica (OCE) è una tecnica emergente che viene adattata per l'analisi di biofilm in questo intervallo lineare (ceppi dell'ordine di 10-4-10-5)8,9.
L'applicazione più consolidata di OCE finora è in campo biomedico, dove la tecnica è stata applicata per caratterizzare tessuti biologici che richiedono solo un accesso ottico superficiale. Ad esempio, Li et al. hanno utilizzato l'OCE per caratterizzare le proprietà elastiche del tessuto cutaneo10. Altri autori hanno caratterizzato le proprietà elastiche anisotrope dei tessuti corneali suini e umani e come sono influenzati dalla pressione intraoculare 11,12,13,14,15,16. Alcuni vantaggi del metodo OCE per lo studio dei biofilm sono che non è distruttivo e fornisce una risoluzione spaziale a mesoscala, non richiede alcuna preparazione del campione e il metodo stesso è rapido; Fornisce misurazioni co-registrate della struttura fisica e delle proprietà elastiche (ad esempio, porosità, rugosità superficiale e morfologia)8,9,17,18.
Il metodo OCE misura lo spostamento locale delle onde elastiche che si propagano in un campione utilizzando la tomografia a coerenza ottica (OCT) sensibile alla fase. L'OCT è un interferometro ottico a bassa coerenza che trasforma i cambiamenti locali nello spostamento del campione in un cambiamento di intensità che viene registrato con uno spettrometro ottico. La tecnica OCT è stata utilizzata anche nella ricerca sul biofilm per la caratterizzazione della struttura a mesoscala, della distribuzione della porosità in tre dimensioni e della deformazione del biofilm 17,19,20,21. Inoltre, Picioreanu et al. hanno stimato le proprietà meccaniche del biofilm utilizzando la modellazione inversa dell'interazione fluido-struttura di immagini di deformazione della sezione trasversale OCT22.
D'altra parte, le misure OCE, accoppiate con la modellazione di onde elastodinamiche inverse, forniscono la velocità delle onde elastiche nel campione, che consente la caratterizzazione delle proprietà elastiche e viscoelastiche del campione. Il nostro gruppo ha adattato la tecnica OCE per la misurazione quantitativa delle proprietà elastiche e viscoelastiche del biofilm 8,9,18 e ha convalidato la tecnica rispetto alle misurazioni della reometria a taglio in campioni di piastre di gel di agarosio18. L'approccio OCE fornisce stime precise e affidabili delle proprietà del biofilm poiché la velocità dell'onda elastica misurata è correlata alle proprietà elastiche del campione. Inoltre, il decadimento spaziale dell'ampiezza dell'onda elastica può essere direttamente correlato con le proprietà viscoelastiche dovute agli effetti viscosi nel materiale. Abbiamo riportato misure OCE delle proprietà viscoelastiche di biofilm batterici in coltura mista coltivati su coupon in un reattore anulare rotante (RAR) e biofilm granulari con geometrie complesse utilizzando modelli di onde elastodinamiche18.
La tecnica OCE è anche una potente alternativa alla reometria tradizionale18che viene utilizzata per la caratterizzazione viscoelastica. I metodi reometrici sono più adatti per i campioni con geometria planare. Pertanto, i biofilm granulari, che hanno forme e morfologie superficiali arbitrarie, non possono essere caratterizzati con precisione su un reometro 8,23. Inoltre, a differenza dell'OCE, i metodi reometrici possono essere difficili da adattare per le misurazioni in tempo reale, ad esempio durante la crescita del biofilm nelle celle di flusso24,25.
In questo articolo, mostriamo che le misure OCE della velocità d'onda indipendente dalla frequenza delle onde superficiali possono essere utilizzate per caratterizzare le proprietà elastiche del biofilm senza la necessità di modelli complicati. Questo sviluppo renderà l'approccio OCE più accessibile alla più ampia comunità del biofilm per lo studio delle proprietà meccaniche del biofilm.
La Figura 1 mostra un'illustrazione schematica del sistema OCT utilizzato in questo studio. Il sistema incorpora diversi strumenti, tra cui un sistema OCT commerciale sensibile alla fase nel dominio spettrale, un generatore di ritardo, un generatore di funzioni e un trasduttore piezoelettrico. Il sistema OCT funziona secondo il principio dell'interferometria impiegando una sorgente luminosa a banda larga con una lunghezza d'onda centrale di 930 nm. L'intensità luminosa raccolta, correlata agli intricati dettagli strutturali del campione, viene analizzata nell'unità di post-elaborazione e quindi convertita in un'immagine in sezione trasversale del campione, comunemente indicata come immagine OCT. La profondità di imaging OCT dipende dalla gravità dello scattering ottico nel campione che deriva dalla variazione locale dell'indice di rifrazione ed è limitata a 1-3 mm nei tessuti biologici e nei biofilm. Poiché la fase ottica nel campione e l'intensità dell'interferenza sono modulate dal movimento, l'OCT può essere utilizzato per rilevare lo spostamento locale del campione. Sfruttiamo la sensibilità allo spostamento dell'OCT nel metodo OCE per tracciare il campo di spostamento in stato stazionario delle onde elastiche nel campione. In particolare, il generatore di funzioni emette una tensione sinusoidale per pilotare il trasduttore piezoelettrico. Il trasduttore, a sua volta, si allunga e si contrae con una cronologia temporale oscillatoria. Lo spostamento oscillatorio del trasduttore impartisce una forza sinusoidale sulla superficie del campione attraverso una punta a cuneo stampata in 3D all'apice del trasduttore, portando alla generazione di onde elastiche armoniche nel campione. La punta a cuneo entra in leggero contatto con il campione, in modo che il campione rimanga intatto dopo che l'attuatore è stato ritirato dalla superficie del campione. Per registrare lo spostamento locale nel campione, vengono acquisite scansioni di profondità adiacenti separate da un ritardo temporale fisso in corrispondenza di ciascun pixel del campione. La differenza di fase ottica tra scansioni consecutive in ogni punto pixel è proporzionale allo spostamento verticale locale nello stesso punto. La sincronizzazione tra lo spostamento del trasduttore e l'ottica di scansione nel sistema OCT si ottiene attraverso un impulso di trigger che ha origine dal generatore di funzioni ed è ritardato nel generatore di ritardo. Questa fase di sincronizzazione facilita l'acquisizione di immagini coerenti della distribuzione di fase ottica locale nel campione. Queste immagini sono direttamente proporzionali allo spostamento armonico verticale locale nel campione e sono note come immagine OCE. Le immagini OCE vengono acquisite a diverse frequenze di attuazione del trasduttore per ottenere la lunghezza d'onda elastica e la velocità dell'onda in funzione della frequenza. Le velocità delle onde misurate vengono analizzate con un modello elastodinamico per determinare le proprietà elastiche del campione.
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Protocol
1. Configurazione del sistema
- Riunisci i componenti del sistema che includono il sistema OCT commerciale (unità di base, supporto, testina di imaging e computer), generatore di forme d'onda, trasduttore, generatore di ritardi/impulsi, un interruttore con connessioni BNC, cavi e adattatori BNC, perni ottici e morsetti.
- Collegare il segnale di sincronizzazione dal generatore di funzioni a un interruttore. Collegare l'altra porta dello switch al generatore di ritardo.
- Collegare l'uscita del generatore di funzioni ai cavi del trasduttore.
- Collegare le uscite del generatore di ritardo al canale di trigger sul retro dell'unità base OCT. Il segnale di uscita dal generatore di ritardo è un impulso di trigger per avviare il movimento dell'ottica di scansione nel sistema OCT.
- Accendere i componenti del sistema (unità di base dello Strumento di personalizzazione di Office, computer, generatore di funzioni e generatore di ritardo) e avviare il software dello Strumento di personalizzazione di Office.
- Configurare il generatore di ritardo per inviare un segnale di trigger logico transistor-transistor all'unità di base OCT. Fare riferimento al manuale del sistema OCT per i requisiti del segnale di trigger.
- Posizionare il trasduttore sotto la lente OCT. Il trasduttore ha una punta a cuneo stampata in 3D incollata su una delle sue estremità che funge da sorgente di linea per le onde elastiche.
2. Acquisizione delle immagini
- Sul software OCT, selezionare la modalità di acquisizione Doppler e abilitare il trigger esterno.
- Posizionare il biofilm granulare sotto la lente in un portacampioni e spostarlo verso la punta del trasduttore utilizzando uno stadio di traslazione. Assicurarsi che il trasduttore entri in contatto delicato con la superficie del campione, come mostrato nella Figura 2. Abbiamo utilizzato due biofilm granulari (noti anche come fanghi granulari) con diametri nominali diversi (4,3 mm e 3,3 mm). Questa selezione è stata fatta per studiare l'impatto delle dimensioni del biofilm sulle sue proprietà meccaniche. Questi sono stati ottenuti commercialmente.
NOTA: Il portacampioni impiegato in questo studio è costituito da una piastra di plastica stampata in 3D con rientranze emisferiche multiple. Questo supporto non consente misurazioni in condizioni native. Pertanto, abbiamo introdotto acqua dall'ambiente naturale durante le misurazioni per evitare che il campione si asciugasse. - Specificare l'area di scansione facendo clic su Inizio e Fine della linea di interesse (percorso di propagazione dell'onda) nella finestra del monitor di esempio. Centrare questa linea rispetto alla punta del trasduttore e assicurarsi che sia perpendicolare al bordo della punta.
- Specificare il numero di pixel lungo l'area di scansione e la profondità del campione e aumentare il numero di B-scan (immagini in sezione trasversale 2D) da registrare per migliorare il rapporto segnale/rumore delle immagini OCE. I risultati presentati sono stati ottenuti utilizzando 1523 pixel lungo il percorso di scansione e 1024 pixel lungo la profondità. Sono stati effettuati un totale di 50 B-scan.
- Fare clic sul pulsante Scansione e attivare l'interruttore. Le immagini OCT e OCE dovrebbero apparire sullo schermo. Attivare l'interruttore entro il tempo di timeout di attivazione e il tempo di preparazione della scansione.
- Assicurarsi che l'intensità di riferimento rientri nell'intervallo ottimale e posizionare il campione all'interno della regione focale dell'obiettivo del microscopio OCT. Un campione correttamente messo a fuoco dovrebbe avere il bordo superiore vicino alla parte superiore dell'immagine.
- Regolare il contorno di fase nell'immagine OCE sulla barra degli strumenti di visualizzazione aumentando il valore più alto della barra dei colori sul lato sinistro e diminuendo il valore più basso della barra dei colori sul lato destro. Ciò aumenterà il contrasto delle frange.
- Configurare il generatore di funzioni per produrre una tensione sinusoidale a frequenza singola premendo il pulsante Sinusoidale nel pannello frontale e specificare la frequenza di eccitazione iniziale per le misurazioni. Le misurazioni in questo studio iniziano a 4 kHz e terminano a 9,6 kHz. Abilitare il connettore di uscita premendo il tasto Uscita.
- Impostare una tensione accettabile per la misurazione. Questo valore dovrebbe massimizzare la visibilità delle frange, ma anche evitare l'avvolgimento di fase. Per i biofilm in questo studio e l'intervallo di frequenza delle misurazioni, una tensione compresa tra 5 e 10 V si traduce in genere in una mappa di fase con un buon contrasto.
- Acquisire le immagini OCT e OCE facendo clic sul pulsante Registra .
- Ripetere le misurazioni a frequenze diverse per ottenere immagini in sezione trasversale del campo d'onda elastico con diverse lunghezze d'onda (o periodi di frangia).
3. Analisi dell'immagine
- Ottenere la dimensione fisica dei pixel. La dimensione fisica dei pixel in x si ottiene dividendo il campo visivo nella direzione x per la dimensione dell'immagine nella direzione x e quindi moltiplicando per un fattore due. La dimensione fisica dei pixel in z si ottiene dividendo il campo visivo in direzione z per la dimensione dell'immagine in direzione z. I valori del campo visivo e della dimensione dell'immagine sono memorizzati nell'array della struttura con le informazioni sull'immagine a cui è possibile accedere con la funzione OCTFileOpen fornita nell'SDK MATLAB nel pacchetto ThorImageOCT.
- Ottenere le matrici OCT e OCE usando rispettivamente le funzioni OCTFileGetIntensity e OCTFileGetPhase e fare la media dei fotogrammi registrati. Queste funzioni sono fornite nell'SDK MATLAB nel pacchetto ThorImageOCT.
- Ottenere le posizioni dei pixel del bordo superiore del campione binarizzando l'immagine e rilevando i pixel bianchi dall'alto verso il basso per ogni colonna.
- Estrarre la distribuzione di fase dell'immagine OCE lungo questo bordo utilizzando la funzione improfile e calcolare la lunghezza cumulativa dell'arco in dimensioni reali. Calcola la lunghezza dell'arco prendendo la somma cumulativa della norma delle differenze in scala tra punti consecutivi nelle direzioni x e z.
- Calcolare la trasformata di Fourier veloce spaziale della distribuzione di fase OCT misurata (cioè dalle immagini OCE) rispetto alla lunghezza cumulativa dell'arco utilizzando la funzione plomb.
- Determinare la posizione del picco nello spettro. Questa posizione rappresenta la frequenza spaziale dell'onda. Calcolare la velocità dell'onda (o velocità di fase) dal rapporto tra la frequenza di eccitazione del trasduttore (unità di Hz) e la frequenza spaziale (unità di lunghezza inversa).
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Representative Results
In questo studio, abbiamo utilizzato biofilm granulari (noti anche come fanghi granulari), che sono stati ottenuti commercialmente. I granuli sono biofilm sferici che si formano attraverso l'autoaggregazione, il che significa che non richiedono un supporto o una superficie su cui crescere26. La Figura 3A mostra un'immagine OCT rappresentativa in sezione trasversale che si verifica a causa della variazione spaziale dell'indice di rifrazione locale in un biofilm granulare. Il biofilm ha un diametro nominale di 3 mm. Alcune delle caratteristiche interne, tra cui pori e vuoti che sono vicini alla superficie del campione, sono visibili nell'immagine. L'aumento della diffusione ottica lungo la profondità del campione impedisce alla sorgente di luce OCT di raggiungere il centro del campione, rendendo così la regione centrale priva di qualsiasi informazione distinguibile. La Figura 3B mostra l'immagine OCE in sezione trasversale del campione per una frequenza di eccitazione del trasduttore di 5,1 kHz. Il contrasto locale nell'immagine è correlato con lo spostamento verticale locale indotto dall'onda elastica che si propaga nel campione. La spaziatura fisica delle frange lungo il percorso di propagazione corrisponde alla lunghezza d'onda dell'onda superficiale elastica. L'onda superficiale si propaga vicino alla superficie del campione e ha una profondità di penetrazione vicina alla lunghezza d'onda. L'estensione spaziale dello spostamento dell'onda superficiale non è visibile nell'immagine a causa della limitata penetrazione ottica della sorgente luminosa OCT nel campione. La distribuzione ottica di fase lungo il percorso di propagazione dell'onda elastica (Figura 4A) viene utilizzata per determinare la frequenza spaziale dell'onda superficiale. La frequenza spaziale si ottiene prendendo la trasformata di Fourier veloce (FFT; Figura 4B) dei dati e selezionando la frequenza alla quale l'ampiezza dello spettro FFT è maggiore.
È fondamentale selezionare una tensione del generatore di funzioni di entità sufficiente per produrre un modello di frangia che mostri un contrasto ottimale nell'immagine OCE. Tuttavia, è necessario evitare tensioni eccessivamente elevate in quanto ciò può causare l'avvolgimento di fase nell'immagine OCE, come illustrato nella Figura 5A. L'avvolgimento di fase si verifica perché la differenza di fase ottica nella misurazione è limitata all'intervallo tra -π e π. Quando la fase supera uno di questi limiti, viene ripiegata al limite opposto, creando una distribuzione di fase discontinua. Di conseguenza, sorge la necessità di scartare la fase, che pone sfide e può introdurre potenziali imprecisioni. Un altro fattore da considerare per misurazioni accurate delle onde è il numero di frange presenti all'interno dell'immagine OCE. A basse frequenze del trasduttore, rappresentate nella Figura 5B, un ciclo completo di oscillazione dell'onda superficiale potrebbe non essere completamente catturato a causa delle piccole dimensioni del granulo e lo spettro FFT potrebbe produrre stime errate per la frequenza spaziale (o lunghezza d'onda inversa). Un'altra fonte di errore nella stima della frequenza spaziale è la presenza di modi di onde elastiche spazialmente sovrapposte, come le onde di superficie e le onde trasversali di massa, nell'immagine OCT. Queste modalità d'onda si mescolano, creando complicati modelli di interferenza che possono essere difficili da analizzare. La presenza di vari modi d'onda oltre alle onde superficiali può introdurre effetti di interferenza vicino al trasduttore, a seconda del campione specifico, della frequenza di eccitazione e dell'ampiezza. La Figura 6 è un esempio di un'immagine OCE ottenuta con una frequenza di eccitazione di 5,5 kHz, in cui un'onda trasversale di massa vicino al punto di eccitazione locale interferisce con il campo d'onda superficiale. La Figura 7A illustra una distribuzione di fase che diverge dal modello di onda sinusoidale in decadimento osservato nella Figura 4A, attribuito alla combinazione di modi d'onda. Di conseguenza, la FFT risultante mostra un picco più ampio, come illustrato nella Figura 7B. Lo stesso fenomeno può verificarsi in prossimità di difetti come vuoti o regioni con marcate variazioni delle proprietà elastiche/viscoelastiche. In queste aree, il campo di spostamento locale viene modificato a causa dell'interferenza dell'onda incidente o superficiale e delle onde diffuse dal difetto.
Abbiamo calcolato la velocità dell'onda per l'onda superficiale a frequenze comprese tra 4,0 e 9,6 kHz per due biofilm granulari con diametri nominali diversi (4,3 mm e 3,3 mm). I grafici della velocità dell'onda sono chiamati curve di dispersione. Per le impostazioni utilizzate, ogni misurazione della dispersione ha richiesto circa 15 minuti. All'interno dell'intervallo di frequenza selezionato, nelle immagini OCE sono presenti più cicli del profilo di spostamento sinusoidale, consentendo una determinazione precisa della frequenza spaziale insieme a un notevole contrasto di fase. La Figura 8 illustra le curve di dispersione ottenute. Queste curve rappresentano le curve di dispersione media per tre posizioni all'interno di ciascun campione. Le velocità delle onde superficiali si avvicinano a un valore costante, chiamato velocità dell'onda di Rayleigh, cR, che è correlato al modulo di taglio del campione attraverso la relazione,
cR = ((0.862 + 1.14ν)/ (1 + ν)) x (G/r)1/2
dove, G è il modulo di taglio, r è la densità di massa e ν è il rapporto di Poisson27,28. È costante perché la profondità di penetrazione dell'onda elastica è inferiore al diametro del campione. Essenzialmente, l'onda elastica viaggia vicino alla superficie del campione con una velocità d'onda che è direttamente proporzionale al quadrato del modulodi Young 28. Tuttavia, a causa del rumore di misurazione, la velocità dell'onda non è del tutto costante in questa gamma di frequenze. Prendiamo la media delle velocità d'onda per frequenze comprese tra 6,0 e 9,6 kHz per il campione più piccolo e tra 4,0 e 9,6 kHz per il campione più grande. Questa velocità media dell'onda viene quindi impiegata per stimare il modulo di Young del campione.
Partiamo dal presupposto che il campione sia incomprimibile a causa del suo alto contenuto d'acqua. Di conseguenza, ν = 0,5. Quindi, cR è direttamente correlato a E = 3G per un solido incomprimibile, dove E è il modulo di Young del campione27,28. Le linee tratteggiate nella Figura 8 rappresentano le velocità delle onde di Rayleigh per i diversi campioni. Ipotizziamo una composizione di biofilm costituita principalmente da acqua, con una densità di 1000 kg/m3. Di conseguenza, il modulo di Young calcolato dei biofilm granulari è di 85 kPa e 205 kPa per i biofilm granulari con diametri nominali rispettivamente di 4,3 mm e 3,3 mm. Questa misurazione conferma la capacità della tecnica di discernere le differenze di proprietà meccaniche tra i biofilm.
Figura 1: Configurazione dell'elastografia a coerenza ottica. Lo schema del sistema qui utilizzato è mostrato in figura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Campione montato. Il biofilm granulare è posizionato sul portacampione mentre il trasduttore entra delicatamente in contatto con esso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini OCT e OCT di biofilm granulare. (A) Immagine OCT. (B) Immagine OCE per un'onda superficiale che si propaga a 5,1 kHz che mostra un buon contrasto di frangia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Distribuzione di fase e FFT. Per l'immagine mostrata nella Figura 3B, (A) distribuzione della differenza di fase lungo il bordo superiore del campione e (B) FFT della distribuzione della differenza di fase che mostra un picco stretto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagini OCT e OCT di biofilm granulare. (A) Immagine OCE per un'onda superficiale che si propaga a 5,1 kHz che mostra l'avvolgimento di fase. (B) Immagine OCE per un'onda superficiale che si propaga a 1,3 kHz senza un ciclo completo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immagine OCE che mostra una combinazione di modalità. Questa immagine proviene da una posizione diversa del campione e illustra la combinazione di modi per un'onda che si propaga a 5,5 kHz. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Distribuzione di fase e FFT. Per l'immagine mostrata nella Figura 6, (A) distribuzione della differenza di fase lungo il bordo superiore del campione e (B) FFT della distribuzione della differenza di fase che mostra un picco più ampio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Curve di dispersione. La velocità dell'onda in due campioni di dimensioni diverse è mostrata a frequenze diverse con barre di deviazione standard. La corrispondente velocità dell'onda di Rayleigh per la parte piatta delle curve è tracciata in alto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La profondità di imaging raggiungibile nel sistema OCT è determinata dal grado di penetrazione della luce dalla sorgente luminosa, che dipende dalla lunghezza d'onda della sorgente. Inoltre, la lunghezza d'onda determina la risoluzione assiale. Le lunghezze d'onda più lunghe possono penetrare più in profondità nel campione, ma a scapito di una risoluzione assiale ridotta rispetto alle lunghezze d'onda più corte. La risoluzione trasversale, d'altra parte, dipende sia dall'apertura numerica del sistema che dalla lunghezza d'onda, con lunghezze d'onda più corte che offrono una risoluzione più elevata. L'aumento dell'apertura numerica introduce un compromesso limitando la profondità di campo29. La risoluzione spaziale è limitata alla lunghezza d'onda elastica più corta che può essere rilevata con un rapporto segnale/rumore sufficiente. L'attuale metodologia OCE è limitata a 0,5 mm 9,30. Sebbene questa tecnica sia limitata dalle dimensioni del campione, dovrebbe essere applicabile a vari tipi di biofilm. La forma del biofilm, granulare o piatto, non inibisce la tecnica. Anche la trasparenza del campione gioca un ruolo nel determinare la profondità di penetrazione. I materiali con un'elevata trasparenza consentono alla luce di passare attraverso tutto il campione, rendendolo impercettibile all'osservazione, mentre i campioni opachi impediscono la penetrazione della luce, fornendo dettagli minimi sulla loro struttura interna 9,28. Nel contesto di questo studio, è sufficiente una profondità di penetrazione nell'ordine dei millimetri.
Un altro possibile problema per queste misurazioni è che in campioni più grandi, in cui le dimensioni non limitano il numero di cicli di onde elastiche, il campo visivo (FOV) del microscopio OCT può essere il fattore limitante del numero di cicli misurati. Per le misurazioni qui, il FOV è limitato a 9 mm per 9 mm; pertanto, le lunghezze d'onda elastiche superiori a 9 mm non possono essere risolte in questo microscopio OCT. L'utilizzo di una lente con un campo visivo più ampio consentirebbe l'imaging di campioni più grandi, producendo più frange a queste frequenze più basse. Le sfide sorgono anche alle frequenze più alte. Per i campioni di questo studio, oltre i 10 kHz, l'onda subisce un'attenuazione significativa, diminuendo l'entità della distribuzione della differenza di fase e complicando la determinazione della frequenza spaziale. Questo problema può essere attenuato aumentando la tensione del generatore di funzioni, aumentando così lo spostamento del trasduttore. Tuttavia, l'aumento dello spostamento è utile solo fino a un certo punto, poiché alla fine finirà per avvolgere la fase9. In alternativa, migliorare la sensibilità del sistema implementando una sorgente luminosa con una potenza maggiore può contrastare l'avvolgimento di fase causato da spostamenti maggiori e facilitare il rilevamento della risposta dinamica a eccitazioni più piccole. Una maggiore sensibilità facilita l'implementazione di metodi OCE acustici che offrono il vantaggio del carico senza contatto, ma sono più profondamente influenzati dall'elevata attenuazione31.
Quando si effettuano queste misurazioni su biofilm, è fondamentale mantenere i campioni idratati. L'essiccazione porta a un aumento indesiderato della rigidità, che è irrilevante poiché l'attenzione è rivolta alla valutazione delle proprietà del campione nel suo ambiente nativo. Non abbiamo studiato l'essiccazione indotta dall'illuminazione. Tuttavia, osserviamo che l'acqua dell'ambiente naturale è stata aggiunta periodicamente durante la misurazione e, durante questo periodo, la morfologia del campione è stata monitorata attraverso le immagini OCT e non sono stati osservati cambiamenti distinguibili nella morfologia. Inoltre, quando si posiziona il trasduttore e si acquisiscono immagini OCE, è essenziale tenere conto delle caratteristiche individuate nell'immagine OCT. Le eterogeneità lungo il percorso di propagazione dell'onda hanno il potenziale di distorcere il campo d'onda e dovrebbero quindi essere evitate9. Inoltre, mantenere un contatto delicato con il biofilm è fondamentale, in quanto un'eccessiva pressione sul campione, oltre a modificarne potenzialmente le caratteristiche meccaniche, potrebbe anche portare a una distorsione del campo d'onda. Infine, la regione di scansione deve essere perpendicolare ai fronti d'onda per garantire che la frequenza spaziale dell'onda armonica sia determinata con precisione dalla misurazione.
Per alcune frequenze, sono state osservate variazioni significative nella velocità delle onde in entrambi i campioni, che possono essere attribuite alle loro eterogeneità intrinseche, al campo d'onda a quella specifica frequenza e alla morfologia dei percorsi di propagazione. In precedenza abbiamo dimostrato che il profilo di velocità dell'onda misurato attraverso un biofilm granulare sezionato non è uniforme a causa della microstruttura eterogenea9. Di conseguenza, quando si impiega questa tecnica su biofilm granulari, è imperativo condurre misurazioni in più punti del campione per derivare una rappresentazione mediata.
Un'osservazione importante per quanto riguarda le curve di dispersione è che mostrano comportamenti distinti per le diverse dimensioni del campione. Nel caso del campione più grande, la curva rimane relativamente costante in tutto l'intervallo misurato. Tuttavia, per il campione più piccolo, c'è una tendenza all'aumento della velocità dell'onda con l'aumentare della frequenza, in particolare nella parte inferiore dell'intervallo. Questo fenomeno può essere attribuito alla presenza di effetti viscoelastici a frequenze più basse e alla generazione di modi di guida d'onda elastica. Abbiamo tenuto conto di questi effetti nel nostro lavoro precedente utilizzando modelli inversi più sofisticati 8,9,18.
È importante notare che nei sistemi granulari aerobici, la biomassa non è distribuita uniformemente su tutta l'altezza del reattore. Durante le fasi di non aerazione, i granuli più grandi tendono a depositarsi sul fondo del reattore. Questa distribuzione irregolare fa sì che aggregati di dimensioni diverse abbiano accesso a quantità variabili di substrato. Di conseguenza, aggregati di dimensioni diverse mostrano una composizione comunitaria distinta. Inoltre, poiché i fanghi in eccesso vengono rimossi selettivamente, i granuli più grandi tendono ad essere trattenuti nel reattore per periodi più lunghi, mentre quelli più piccoli vengono rimossi più facilmente32. La notevole differenza nel modulo di Young suggerisce una potenziale connessione tra la composizione del biofilm, l'età e le proprietà meccaniche.
In sintesi, il metodo dell'elastografia a coerenza ottica (OCE) offre un mezzo rapido e non distruttivo per valutare la velocità delle onde elastiche nei biofilm. Questo metodo supera i vincoli delle misurazioni reologiche e presenta caratteristiche migliorate rispetto alle tecniche di elastografia alternative 8,18. Inoltre, la sua applicabilità si estende oltre i biofilm granulari per comprendere qualsiasi campione parzialmente trasparente con un'adeguata profondità di penetrazione ottica e dimensioni sufficientemente grandi da essere risolte dal sistema, inclusi esempi come idrogel33, cornea34 e pelle35. I futuri progressi del metodo comprendono diversi aspetti chiave. In primo luogo, l'aumento della frequenza delle onde elastiche armoniche nell'intervallo delle centinaia di kHz consentirà lunghezze d'onda di pochi micrometri, ottenendo così una risoluzione spaziale su una scala simile. In secondo luogo, il rapporto segnale/rumore del sistema di rilevamento ottico sarà migliorato aumentando la potenza ottica del sistema OCT da 2 mW (corrente) a 20 mW. Infine, sostituiremo l'attuatore armonico a contatto con una sorgente di pressione di radiazione acustica senza contatto. Questa aggiunta faciliterà il funzionamento non invasivo e non distruttivo e consentirà di interrogare i campioni di biofilm nei loro ambienti nativi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Aqua-Aerobic Systems, Inc. (Rockford, IL, USA) per aver fornito i biofilm granulari studiati in questo lavoro. Gli autori riconoscono anche il sostegno della National Science Foundation tramite i premi #210047 e #193729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed sample holder | |||
| 3D printed wedge tip | 3 mm width | ||
| BNC cables | Any brand | ||
| Delay generator | Stanford Research Systems | DG535 | DG535 Digital delay/ Pulse Generator |
| Function generator | Agilent Technologies | 33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator | |
| Granular biofilm | Aqua-Aerobic Systems | Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.) | |
| MATLAB | MathWorks | Release 2022a (MATLAB 9.12) | |
| Piezoelectric transducer | Thorlabs | PK2JUP1 | Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement |
| SD-OCT System | Thorlabs | Ganymede II, LSM03 scan lens | |
| ThorImageOCT | Thorlabs | Version: 5.5.5 |
References
- Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476 (2022).
- Pholchan, M. K., Baptista, J. deC., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
- Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
- Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935 (2023).
- Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
- Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
- Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
- Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
- Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394 (2021).
- Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
- Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366 (2020).
- Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635 (2019).
- Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
- Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
- Pitre, J. J. Jr, et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
- Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
- Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
- Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
- Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
- Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020 (2017).
- Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
- Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
- Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032 (2022).
- Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M.
- Graff, K. F. Wave motion in elastic solids. , Dover Publications. (1991).
- Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
- Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
- Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
- Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography - OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
- Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
- Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822 (2022).
- Kirby, M. A., et al.
- Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).
