Summary
Bu makale, optik koherens elastografi (OCE) tekniğinin biyofilm elastik özelliklerini hızlı ve tahribatsız bir şekilde karakterize etmedeki etkinliğini vurgulamaktadır. Doğru ölçümler için kritik OCE uygulama prosedürlerini açıklıyoruz ve iki granüler biyofilm için Young modül değerlerini sunuyoruz.
Abstract
Biyofilmler, kendi ürettiği hücre dışı polimerik maddelerle (EPS) kaplı, iyi organize edilmiş bir mikrobiyal hücre ağı içeren karmaşık biyomalzemelerdir. Bu makale, biyofilmlerin elastik karakterizasyonu için uyarlanmış optik koherens elastografi (OCE) ölçümlerinin uygulanmasının ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. OCE, kısmen saydam yumuşak malzemelerin mikro yapısının, morfolojisinin ve viskoelastik özelliklerinin yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle yerel olarak haritalanmasını sağlayan tahribatsız bir optik tekniktir. Bu tekniğin doğru uygulanması için gerekli prosedürleri detaylandıran kapsamlı bir kılavuzun yanı sıra, toplanan ölçümlerden granüler biyofilmlerin toplu Young modülünü tahmin etmek için bir metodoloji sunuyoruz. Bunlar sistem kurulumu, veri toplama ve son işlemden oluşur. Tartışmada, OCE'de kullanılan sensörlerin altında yatan fiziği inceliyoruz ve OCE ölçümlerinin uzamsal ve zamansal ölçekleriyle ilgili temel sınırlamaları keşfediyoruz. Çevresel biyofilmlerin elastik ölçümlerini kolaylaştırmak için OCE tekniğini ilerletmek için gelecekteki potansiyel yönlerle sonuçlandırıyoruz.
Introduction
Atık su arıtımında ve su kaynaklarının geri kazanılmasında, mikropların organik madde, nitrojen ve fosfat gibi istenmeyen kirleticileri sudan kolayca çıkarılabilen stabilize formlara dönüştürmesini sağlamak için bağlı büyüme reaktörlerindeki faydalı biyofilmler giderek daha fazla kullanılmaktadır1. Bu sistemlerde biyofilmin ortaya çıkan işlevi, yani biyokimyasal dönüşümler, içinde bulunan mikropların çeşitliliği ve bu mikropların aldığı besinlerle yakından ilişkilidir2. Buna göre, devam eden biyofilm büyümesi, tutarlı reaktör işlevselliğini sürdürmek için bir zorluk oluşturabilir, çünkü yeni biyofilm büyümesi biyofilmin genel metabolik süreçlerini, kütle transfer özelliklerini ve topluluk bileşimini değiştirebilir. Biyofilm ortamını mümkün olduğunca stabilize etmek, bu tür değişikliklere karşı koruma sağlayabilir3. Bu, tutarlı bir besin akışının sağlanmasını ve biyofilmin yapısının sabit bir kalınlıkla sabit tutulmasınıiçerir 4. Biyofilmin sertliğini ve fiziksel yapısını izlemek, araştırmacıların biyofilmin genel sağlığı ve işleyişi hakkında fikir edinmelerini sağlayacaktır.
Biyofilmler viskoelastik özellikler sergiler 5,6,7. Bu viskoelastik yapı, dış mekanik kuvvetlere yanıt olarak anlık ve yavaş, zamana bağlı bir deformasyonun bir kombinasyonu ile sonuçlanır. Biyofilmlerin benzersiz bir yönü, önemli deformasyona maruz kaldıklarında viskoz sıvılar gibi tepki vermeleridir. Tersine, küçük deformasyona maruz kaldıklarında, tepkileri katılarlakarşılaştırılabilir 5. Ayrıca, bu küçük deformasyon bölgesi içinde, biyofilmlerin doğrusal bir kuvvet-yer değiştirme ilişkisisergilediği bir deformasyon aralığı vardır 5,6,7. Bu doğrusal aralıktaki deformasyonlar, biyofilm mekanik özelliklerini değerlendirmek için idealdir, çünkü bunlar tekrarlanabilir ölçümler sağlar. Bu aralıktaki elastik tepkiyi birkaç teknik ölçebilir. Optik koherens elastografi (OCE), bu doğrusal aralıktaki (10-4-10-5 mertebesinde suşlar) biyofilmleri analiz etmek için uyarlanan yeni bir tekniktir8,9.
OCE'nin şimdiye kadarki en köklü uygulaması, tekniğin yalnızca yüzeysel optik erişim gerektiren biyolojik dokuları karakterize etmek için uygulandığı biyomedikal alandadır. Örneğin, Li ve ark. cilt dokusunun elastik özelliklerini karakterize etmek için OCE'yi kullandı10. Diğer yazarlar, domuz ve insan kornea dokularının anizotropik elastik özelliklerini ve göz içi basıncından nasıl etkilendiklerini karakterize ettiler 11,12,13,14,15,16. Biyofilmleri incelemek için OCE yönteminin bazı avantajları, tahribatsız olması ve orta ölçekli uzamsal çözünürlük sağlaması, herhangi bir numune hazırlığı gerektirmemesi ve yöntemin kendisinin hızlı olmasıdır; Fiziksel yapı ve elastik özelliklerin (örneğin, gözeneklilik, yüzey pürüzlülüğü ve morfoloji) ortak kayıtlı ölçümlerini sağlar8,9,17,18.
OCE yöntemi, faza duyarlı optik koherens tomografi (OCT) kullanarak bir numunede yayılan elastik dalgaların yerel yer değiştirmesini ölçer. OCT, numune yer değiştirmesindeki yerel değişiklikleri bir optik spektrometre ile kaydedilen bir yoğunluk değişikliğine dönüştüren düşük tutarlı bir optik interferometredir. OCT tekniği, biyofilm araştırmalarında mezoscale yapının, üç boyutta gözeneklilik dağılımının ve biyofilm deformasyonunun karakterizasyonu için de kullanılmıştır 17,19,20,21. Ek olarak, Picioreanu ve ark. OCT kesit deformasyon görüntülerinin akışkan-yapı etkileşimi ters modellemesini kullanarak biyofilm mekanik özelliklerini tahmin etti22.
Öte yandan, OCE ölçümleri, ters elastodinamik dalga modellemesi ile birleştiğinde, numunedeki elastik dalgaların dalga hızını verir, bu da numunenin elastik ve viskoelastik özelliklerinin karakterizasyonunu sağlar. Grubumuz, biyofilm elastik ve viskoelastik özelliklerin kantitatif ölçümü için OCE tekniğiniuyarladı 8,9,18 ve tekniği agaroz jel plaka numunelerinde kayma reometrisi ölçümlerine karşı doğruladı 18. OCE yaklaşımı, ölçülen elastik dalga hızı numunenin elastik özellikleri ile ilişkili olduğundan, biyofilm özelliklerinin kesin ve güvenilir tahminlerini sağlar. Ayrıca, elastik dalga genliğinin uzamsal bozunması, malzemedeki viskoz etkilerden dolayı viskoelastik özelliklerle doğrudan ilişkilendirilebilir. Dönen bir dairesel reaktörde (RAR) kuponlar üzerinde büyütülen karışık kültür bakteri biyofilmlerinin ve karmaşık geometrilere sahip granüler biyofilmlerin viskoelastik özelliklerinin OCE ölçümlerini elastodinamik dalga modelleri18 kullanarak rapor ettik.
OCE tekniği ayrıca viskoelastik karakterizasyon için kullanılan geleneksel reometri18'egüçlü bir alternatiftir. Reometri yöntemleri, düzlemsel geometriye sahip numuneler için en uygunudur. Bu nedenle, keyfi şekillere ve yüzey morfolojilerine sahip olan granüler biyofilmler, bir reometre 8,23 üzerinde doğru bir şekilde karakterize edilemez. Ek olarak, OCE'den farklı olarak, reometri yöntemlerinin, örneğin akış hücrelerindebiyofilm büyümesi sırasında gerçek zamanlı ölçümlere uyarlanması zor olabilir 24,25.
Bu yazıda, yüzey dalgalarının frekanstan bağımsız dalga hızının OCE ölçümlerinin, karmaşık modellere ihtiyaç duymadan biyofilm elastik özelliklerini karakterize etmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz. Bu gelişme, OCE yaklaşımını, biyofilm mekanik özelliklerini incelemek için daha geniş biyofilm topluluğu için daha erişilebilir hale getirecektir.
Şekil 1 , bu çalışmada kullanılan OCT sisteminin şematik bir gösterimini göstermektedir. Sistem, ticari bir spektral alan faza duyarlı OCT sistemi, bir gecikme üreteci, bir fonksiyon üreteci ve bir piezoelektrik dönüştürücü dahil olmak üzere çeşitli enstrümanlar içerir. OCT sistemi, merkez dalga boyu 930 nm olan geniş bantlı bir ışık kaynağı kullanarak interferometri prensibine göre çalışır. Numunedeki karmaşık yapısal detaylarla ilişkilendirilen toplanan ışık yoğunluğu, son işlem ünitesinde analiz edilir ve daha sonra numunenin enine kesit görüntüsüne dönüştürülür - genellikle OCT görüntüsü olarak adlandırılır. OCT görüntüleme derinliği, kırılma indisindeki lokal varyasyondan kaynaklanan numunedeki optik saçılmanın şiddetine bağlıdır ve biyolojik dokularda ve biyofilmlerde 1-3 mm ile sınırlıdır. Numunedeki optik faz ve girişim yoğunluğu hareketle modüle edildiğinden, OCT yerel numune yer değiştirmesini tespit etmek için kullanılabilir. Numunedeki elastik dalgaların kararlı durum yer değiştirme alanını izlemek için OCE yönteminde OCT'nin yer değiştirme hassasiyetinden yararlanıyoruz. Spesifik olarak, fonksiyon üreteci, piezoelektrik dönüştürücüyü çalıştırmak için sinüzoidal bir voltaj verir. Dönüştürücü, sırayla, salınımlı bir zaman geçmişi ile gerilir ve büzülür. Dönüştürücünün salınımlı yer değiştirmesi, dönüştürücünün tepesindeki 3D baskılı bir kama ucu aracılığıyla numune yüzeyine sinüzoidal bir kuvvet verir ve numunede harmonik elastik dalgaların oluşmasına yol açar. Kama ucu, aktüatör numune yüzeyinden geri çekildikten sonra numunenin bozulmadan kalması için numune ile hafif temas sağlar. Numunedeki yerel yer değiştirmeyi kaydetmek için, numunedeki her pikselde sabit bir zaman gecikmesiyle ayrılmış bitişik derinlik taramaları elde edilir. Her piksel noktasındaki ardışık taramalar arasındaki optik faz farkı, aynı noktadaki yerel dikey yer değiştirme ile orantılıdır. OCT sistemindeki dönüştürücünün yer değiştirmesi ile tarama optikleri arasındaki senkronizasyon, fonksiyon üretecinden kaynaklanan ve gecikme üretecinde geciktirilen bir tetikleme darbesi ile sağlanır. Bu senkronizasyon adımı, numunedeki yerel optik faz dağılımının tutarlı kesit görüntülerinin elde edilmesini kolaylaştırır. Bu görüntüler, numunedeki yerel dikey harmonik yer değiştirme ile doğru orantılıdır ve OCE görüntüsü olarak bilinir. OCE görüntüleri, frekansın bir fonksiyonu olarak elastik dalga boyunu ve dalga hızını elde etmek için farklı dönüştürücü çalıştırma frekanslarında elde edilir. Ölçülen dalga hızları, numunenin elastik özelliklerini belirlemek için elastodinamik bir model ile analiz edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sistem kurulumu
- Ticari OCT sistemini (ana ünite, stand, görüntüleme kafası ve bilgisayar), dalga formu üreteci, dönüştürücü, gecikme/darbe üreteci, BNC bağlantılı bir anahtar, BNC kabloları ve adaptörleri, optik direkler ve kelepçeleri içeren sistem bileşenlerini toplayın.
- İşlev oluşturucudan gelen senkronizasyon sinyalini bir anahtara bağlayın. Anahtarın diğer bağlantı noktasını gecikme üretecine bağlayın.
- Fonksiyon üretecinin çıkışını dönüştürücü uçlarına bağlayın.
- Gecikme üretecinin çıkışlarını OCT ana ünitesinin arkasındaki tetikleme kanalına bağlayın. Gecikme üretecinden gelen çıkış sinyali, OCT sistemindeki tarama optiklerinin hareketini başlatmak için bir tetikleme darbesidir.
- Sistem bileşenlerini (OCT ana birimi, bilgisayar, işlev üreteci ve gecikme üreteci) açın ve OCT yazılımını başlatın.
- Gecikme üretecini, OCT ana ünitesine bir transistör-transistör mantık tetikleme sinyali gönderecek şekilde yapılandırın. Tetik sinyali gereksinimleri için OCT sistem kılavuzuna bakın.
- Dönüştürücüyü OCT merceğinin altına yerleştirin. Dönüştürücü, elastik dalgalar için bir hat kaynağı görevi gören uçlarından birine yapıştırılmış 3D baskılı bir kama ucuna sahiptir.
2. Görüntü edinme
- OCT yazılımında, Doppler Alım Modunu seçin ve harici tetikleyiciyi etkinleştirin.
- Granül biyofilmi merceğin altına bir numune tutucuya yerleştirin ve bir çeviri aşaması kullanarak dönüştürücünün ucuna doğru hareket ettirin. Dönüştürücünün numune ile hafifçe temas ettiğinden emin olun.ampŞekil 2'de gösterildiği gibi yüzey. Farklı nominal çaplara (4,3 mm ve 3,3 mm) sahip iki granül biyofilm (granül çamur olarak da bilinir) kullandık. Bu seçim, biyofilm boyutunun mekanik özellikleri üzerindeki etkisini araştırmak için yapılmıştır. Bunlar ticari olarak elde edildi.
NOT: Bu çalışmada kullanılan numune tutucu, birden fazla yarım küre girintiye sahip 3D baskılı bir plastik plakadan oluşmaktadır. Bu tutucu, yerel koşullar altında ölçümlere izin vermez. Bu nedenle, numunenin kurumasını önlemek için ölçümler sırasında doğal ortamdan su getirdik. - Örnek monitör penceresinde İlgilenilen Satırın Başlangıç ve Bitiş Noktaları'nı (dalga yayılma yolu) tıklatarak tarama bölgesini belirtin. Bu çizgiyi dönüştürücü ucuna göre ortalayın ve ucun kenarına dik olduğundan emin olun.
- OCE görüntülerinin sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için tarama bölgesi boyunca piksel sayısını ve örneğin derinliğini belirtin ve kaydedilecek B taramalarının (2D kesitsel görüntüler) sayısını artırın. Sunulan sonuçlar, tarama yolu boyunca 1523 piksel ve derinlik boyunca 1024 piksel kullanılarak elde edildi. Toplam 50 B taraması yapıldı.
- Tara düğmesine tıklayın ve anahtarı AÇIN. OCT ve OCE görüntüleri ekranda görünmelidir. Tetikleme zaman aşımı süresi ve tarama hazırlık süresi içinde anahtarı etkinleştirin.
- Referans yoğunluğunun optimum aralıkta olduğundan emin olun ve numuneyi OCT mikroskop objektifinin odak bölgesi içinde konumlandırın. Düzgün odaklanmış bir numunenin üst kenarı görüntünün üst kısmına yakın olmalıdır.
- Sol taraftaki renk çubuğunun yüksek değerini artırarak ve sağ taraftaki renk çubuğunun alt değerini azaltarak, ekran araç çubuğundaki OCE görüntüsündeki faz konturunu ayarlayın. Bu, saçak kontrastını artıracaktır.
- Ön paneldeki Sinüs düğmesine basarak fonksiyon üretecini tek frekanslı bir sinüzoidal voltaj üretecek şekilde yapılandırın ve ölçümler için başlangıç uyarma frekansını belirtin. Bu çalışmadaki ölçümler 4 kHz'de başlar ve 9.6 kHz'de biter. Çıkış tuşuna basarak Çıkış konektörünü etkinleştirin.
- Ölçüm için kabul edilebilir bir voltaj ayarlayın. Bu değer, saçak görünürlüğünü en üst düzeye çıkarmalı, ancak aynı zamanda faz kaydırmayı da önlemelidir. Bu çalışmadaki biyofilmler ve ölçümlerin frekans aralığı için, 5 ila 10 V arasındaki bir voltaj tipik olarak iyi kontrastlı bir faz haritası ile sonuçlanır.
- Kaydet düğmesine tıklayarak OCT ve OCE görüntülerini alın.
- Elastik dalga alanının farklı dalga boylarına (veya saçak periyotlarına) sahip kesit görüntülerini elde etmek için ölçümleri farklı frekanslarda tekrarlayın.
3. Görüntü Analizi
- Piksellerin fiziksel boyutunu elde edin. x cinsinden fiziksel piksel boyutu, x yönündeki görüş alanının x yönündeki görüntü boyutuna bölünmesi ve ardından iki kat çarpılmasıyla elde edilir. z'deki fiziksel piksel boyutu, z yönündeki görüş alanının z yönündeki görüntü boyutuna bölünmesiyle elde edilir. Görüş alanı ve görüntü boyutu değerleri, ThorImageOCT paketindeki MATLAB SDK'da sağlanan OCTFileOpen fonksiyonu ile erişilebilen görüntü bilgileriyle yapı dizisinde saklanır.
- Sırasıyla OCTFileGetIntensity ve OCTFileGetPhase fonksiyonlarını kullanarak OCT ve OCE matrislerini elde edin ve kaydedilen karelerin ortalamasını alın. Bu işlevler, ThorImageOCT paketindeki MATLAB SDK'sında sağlanır.
- Görüntüyü ikilileştirerek ve her sütun için yukarıdan aşağıya beyaz pikselleri algılayarak örneğin üst kenarının piksel konumlarını elde edin.
- improfile işlevini kullanarak OCE görüntüsünün bu kenar boyunca faz dağılımını çıkarın ve kümülatif yay uzunluğunu gerçek boyutlarda hesaplayın. x ve z yönlerindeki ardışık noktalar arasındaki ölçeklendirilmiş farklar normunun kümülatif toplamını alarak yay uzunluğunu hesaplayın.
- Plomb fonksiyonunu kullanarak kümülatif yay uzunluğuna göre ölçülen OCT faz dağılımının (yani OCE görüntülerinden) uzamsal hızlı Fourier dönüşümünü hesaplayın.
- Spektrumdaki zirvenin yerini belirleyin. Bu konum, dalganın uzamsal frekansını temsil eder. Dönüştürücü uyarma frekansı (Hz birimleri) ve uzamsal frekans (ters uzunluk birimi) oranından dalga hızını (veya faz hızını) hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, ticari olarak elde edilen granüler biyofilmler (granüler çamur olarak da bilinir) kullandık. Granüller, kendi kendine toplanma yoluyla oluşan küresel biyofilmlerdir, yani üzerinde büyümek için bir taşıyıcı veya yüzey gerektirmezler26. Şekil 3A , granüler bir biyofilmdeki yerel kırılma indisinin uzamsal varyasyonu nedeniyle ortaya çıkan temsili bir kesitsel OCT görüntüsünü göstermektedir. Biyofilmin nominal çapı 3 mm'dir. Numunenin yüzeyine yakın olan gözenekler ve boşluklar dahil olmak üzere bazı iç özellikler görüntüde görülmektedir. Numunenin derinliği boyunca artan optik saçılma, OCT ışık kaynağının numunenin merkezine ulaşmasını engeller, böylece merkezi bölgeyi herhangi bir fark edilebilir bilgiden yoksun hale getirir. Şekil 3B , 5.1 kHz'lik bir dönüştürücü uyarma frekansı için numunenin enine kesitsel OCE görüntüsünü göstermektedir. Görüntüdeki yerel kontrast, numunede yayılan elastik dalga tarafından indüklenen yerel dikey yer değiştirme ile ilişkilidir. Yayılma yolu boyunca saçakların fiziksel aralığı, elastik yüzey dalgasının dalga boyuna karşılık gelir. Yüzey dalgası numune yüzeyinin yakınında yayılır ve dalga boyuna yakın bir penetrasyon derinliğine sahiptir. Yüzey dalgası yer değiştirmesinin uzamsal kapsamı, numunedeki OCT ışık kaynağının sınırlı optik penetrasyonu nedeniyle görüntüde görülmez. Elastik dalga yayılma yolu boyunca optik faz dağılımı (Şekil 4A), yüzey dalgasının uzamsal frekansını belirlemek için kullanılır. Uzamsal frekans, hızlı Fourier Dönüşümü (FFT; Şekil 4B) verilerin ve FFT spektrumunun büyüklüğünün en büyük olduğu frekansın seçilmesi.
OCE görüntüsünde optimum kontrast sergileyen bir saçak deseni üretmek için yeterli büyüklükte bir fonksiyon üreteci voltajı seçmek çok önemlidir. Bununla birlikte, Şekil 5A'da gösterildiği gibi OCE görüntüsünde faz kaymasına neden olabileceğinden aşırı büyük voltajlardan kaçınılmalıdır. Faz sarma, ölçümdeki optik faz farkının -π ile π arasındaki aralıkla sınırlı olması nedeniyle ortaya çıkar. Faz bu sınırlardan birini aştığında, karşı sınıra katlanarak süreksiz bir faz dağılımı oluşturur. Sonuç olarak, zorluklar yaratan ve potansiyel yanlışlıklara yol açabilen faz açma ihtiyacı ortaya çıkar. Doğru dalga ölçümleri için dikkate alınması gereken bir diğer faktör, OCE görüntüsünde bulunan saçakların sayısıdır. Şekil 5B'de gösterilen düşük dönüştürücü frekanslarında, granülün küçük boyutu nedeniyle yüzey dalgasının tam bir salınım döngüsü tam olarak yakalanamayabilir ve FFT spektrumu, uzamsal frekans (veya ters dalga boyu) için hatalı tahminler verebilir. Uzamsal frekans tahminindeki bir başka hata kaynağı, OCT görüntüsünde yüzey dalgaları ve toplu kesme dalgaları gibi uzamsal olarak örtüşen elastik dalga modlarının varlığıdır. Bu dalga modları, analiz edilmesi zor olabilecek karmaşık girişim kalıpları oluşturarak karışır. Yüzey dalgalarının ötesinde çeşitli dalga modlarının varlığı, spesifik numuneye, uyarma frekansına ve genliğe bağlı olarak dönüştürücünün yakınında parazit etkileri oluşturabilir. Şekil 6 , 5.5 kHz'lik bir uyarma frekansı ile elde edilen ve yerel uyarma noktasına yakın bir toplu kesme dalgasının yüzey dalgası alanına müdahale ettiği bir OCE görüntüsünün bir örneğidir. Şekil 7A , Şekil 4A'da gözlemlenen ve dalga modlarının kombinasyonuna atfedilen bozunan sinüs dalgası modelinden ayrılan bir faz dağılımını göstermektedir. Sonuç olarak, ortaya çıkan FFT, Şekil 7B'de gösterildiği gibi daha geniş bir tepe noktası sergiler. Aynı fenomen, boşluklar veya elastik/viskoelastik özelliklerde belirgin varyasyonlar olan bölgeler gibi kusurların yakınında da meydana gelebilir. Bu alanlarda, yerel yer değiştirme alanı, gelen veya yüzey dalgasının girişimi ve kusurdan saçılan dalgalar nedeniyle değiştirilir.
Farklı nominal çaplara (4.3 mm ve 3.3 mm) sahip iki granül biyofilm için 4.0 ile 9.6 kHz arasındaki frekanslarda yüzey dalgası için dalga hızını hesapladık. Dalga hızı grafiklerine dağılım eğrileri denir. Kullanılan ayarlar için her bir dağılım ölçümü yaklaşık 15 dakika sürmüştür. Seçilen frekans aralığında, OCE görüntülerinde sinüzoidal yer değiştirme profilinin çoklu döngüleri bulunur ve bu da kayda değer faz kontrastının yanı sıra uzamsal frekansın hassas bir şekilde belirlenmesini sağlar. Şekil 8 , elde edilen dağılım eğrilerini göstermektedir. Bu eğriler, her numune içindeki üç konum için ortalama dağılım eğrilerini temsil eder. Yüzey dalgası hızları, ilişki yoluyla numunenin kayma modülü ile ilgili olan Rayleigh dalga hızı, cR adı verilen sabit bir değere yaklaşır,
cR = ((0.862 + 1.14ν)/ (1 + ν)) x (G/r)1/2
burada, G kayma modülü, r kütle yoğunluğu ve ν Poisson oranı 27,28'dir. Elastik dalganın penetrasyon derinliği numunenin çapından daha kısa olduğu için sabittir. Esasen, elastik dalga, Young modülü28'in karesi ile doğru orantılı bir dalga hızıyla numunenin yüzeyine yakın hareket eder. Bununla birlikte, ölçüm gürültüsü nedeniyle, dalga hızı bu frekans aralığında tamamen sabit değildir. Daha küçük örnek için 6.0 ile 9.6 kHz arasındaki ve daha büyük örnek için 4.0 ile 9.6 kHz arasındaki frekanslar için dalga hızlarının ortalamasını alıyoruz. Bu ortalama dalga hızı daha sonra numunenin Young modülünü tahmin etmek için kullanılır.
Yüksek su içeriği nedeniyle numunenin sıkıştırılamaz olduğunu varsayıyoruz. Bu nedenle, ν = 0.5. Bu nedenle, cR, sıkıştırılamaz bir katı için E = 3G ile doğrudan ilişkilidir, burada E,27,28 örneğinin Young modülüdür. Şekil 8'deki kesikli çizgiler, farklı numuneler için Rayleigh dalga hızlarını temsil eder. Esas olarak su içeren ve 1000 kg/m3 yoğunluk veren bir biyofilm bileşimi varsayıyoruz. Sonuç olarak, granüler biyofilmlerin hesaplanan Young modülü, nominal çapları 4.3 mm ve 3.3 mm olan granüler biyofilmler için sırasıyla 85 kPa ve 205 kPa'dır. Bu ölçüm, tekniğin biyofilmler arasındaki mekanik özellik farklılıklarını ayırt etme yeteneğini doğrular.
Şekil 1: Optik koherens elastografi kurulumu. Burada kullanılan sistemin şeması şekilde gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Monte edilmiş örnek. Granül biyofilm, dönüştürücü onunla nazikçe temas ederken numune tutucuya yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Granüler biyofilmin OCT ve OCT görüntüleri. (A) OCT görüntüsü. (B) İyi kenar kontrastı gösteren 5.1 kHz'de yayılan bir yüzey dalgası için OCE görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Faz dağılımı ve FFT. Şekil 3B'de gösterilen görüntü için, (A) numunenin üst kenarı boyunca faz farkı dağılımı ve (B) dar bir tepe noktası gösteren faz farkı dağılımının FFT'si. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Granüler biyofilmin OCT ve OCT görüntüleri. (A) Faz sarımını gösteren 5.1 kHz'de yayılan bir yüzey dalgası için OCE görüntüsü. (B) Tam bir döngü olmadan 1.3 kHz'de yayılan bir yüzey dalgası için OCE görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Modların bir kombinasyonunu gösteren OCE görüntüsü. Bu görüntü, numunenin farklı bir konumundandır ve 5.5 kHz'de yayılan bir dalga için modların kombinasyonunu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Faz dağılımı ve FFT. Şekil 6'da gösterilen görüntü için, (A) numunenin üst kenarı boyunca faz farkı dağılımı ve (B) daha geniş bir tepe noktası gösteren faz farkı dağılımının FFT'si. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Dağılım eğrileri. Farklı boyutlara sahip iki numunedeki dalga hızı, standart sapma çubukları ile farklı frekanslarda gösterilir. Eğrilerin düz kısmı için karşılık gelen Rayleigh dalga hızı üstte çizilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCT sisteminde ulaşılabilir görüntüleme derinliği, kaynağın dalga boyuna bağlı olarak ışık kaynağından gelen ışığın penetrasyon derecesi ile belirlenir. Ayrıca, dalga boyu eksenel çözünürlüğü belirler. Daha uzun dalga boyları numuneye daha derinden nüfuz edebilir, ancak daha kısa dalga boylarına kıyasla daha düşük eksenel çözünürlük pahasına. Öte yandan enine çözünürlük, hem sistemin sayısal açıklığına hem de dalga boyuna bağlıdır ve daha kısa dalga boyları daha yüksek çözünürlük sağlar. Sayısal açıklığın artırılması, alan derinliğinisınırlayarak bir değiş tokuş sağlar 29. Uzamsal çözünürlük, yeterli bir sinyal-gürültü oranıyla tespit edilebilen en kısa elastik dalga boyu ile sınırlıdır. Mevcut OCE metodolojisi 0,5 mm 9,30 ile sınırlıdır. Bu teknik, numunenin boyutuyla sınırlı olsa da, çeşitli biyofilm türlerine uygulanabilir olmalıdır. Biyofilmin şekli, granüler veya düz, tekniği engellemez. Numunenin şeffaflığı da penetrasyon derinliğinin belirlenmesinde rol oynar. Yüksek şeffaflığa sahip malzemeler, ışığın tüm numuneden geçmesini sağlayarak onu gözlemle algılanamaz hale getirirken, opak numuneler ışık penetrasyonunu engelleyerek iç yapıları hakkında minimum ayrıntı verir 9,28. Bu çalışma bağlamında, milimetre aralığında bir penetrasyon derinliği yeterlidir.
Bu ölçümler için bir başka olası sorun, boyutun elastik dalga döngülerinin sayısını sınırlamadığı daha büyük numunelerde, OCT mikroskobunun görüş alanının (FOV) ölçülen döngü sayısının sınırlayıcı faktörü olabileceğidir. Buradaki ölçümler için FOV 9 mm x 9 mm ile sınırlıdır; bu nedenle, 9 mm'den uzun elastik dalga boyları bu OCT mikroskobunda çözülemez. Daha geniş bir görüş alanına sahip bir mercek kullanmak, daha büyük örneklerin görüntülenmesini sağlayacak ve bu düşük frekanslarda daha fazla saçak elde edecektir. Zorluklar daha yüksek frekanslarda da ortaya çıkar. Bu çalışmadaki örnekler için, 10 kHz'in ötesinde, dalga, faz farkı dağılımının büyüklüğünü azaltan ve uzamsal frekansın belirlenmesini zorlaştıran önemli bir zayıflama yaşar. Bu endişe, fonksiyon üretecinin voltajının artırılması ve böylece dönüştürücünün yer değiştirmesinin artırılmasıyla azaltılabilir. Bununla birlikte, yer değiştirmeyi artırmak, sonunda faz sarma9'da sona ereceğinden, belirli bir noktaya kadar yararlıdır. Alternatif olarak, daha yüksek güce sahip bir ışık kaynağı uygulayarak sistemin hassasiyetini artırmak, daha büyük yer değiştirmelerin neden olduğu faz sarılmasını önleyebilir ve daha küçük uyarımlara dinamik yanıtın algılanmasını kolaylaştırabilir. Daha yüksek bir hassasiyet, temassız yükleme avantajı sunan ancak yüksek zayıflamadan daha derinden etkilenen akustik OCE yöntemlerinin uygulanmasını kolaylaştırır31.
Biyofilmler üzerinde bu ölçümleri yaparken, numuneleri nemli tutmak çok önemlidir. Kurutma, sertlikte istenmeyen bir artışa yol açar ve bu, numunenin özelliklerini kendi doğal ortamında değerlendirmeye odaklanıldığı için önemsizdir. Aydınlatma kaynaklı kurutmayı incelemedik. Bununla birlikte, ölçüm boyunca doğal ortamdan gelen suyun periyodik olarak eklendiğini ve bu süre zarfında numune morfolojisinin OCT görüntüleri aracılığıyla izlendiğini ve morfolojide fark edilebilir bir değişiklik gözlenmediğini belirtiyoruz. Ek olarak, dönüştürücüyü konumlandırırken ve OCE görüntülerini yakalarken, OCT görüntüsünde fark edilen özellikleri hesaba katmak önemlidir. Dalga yayılma yolu boyunca heterojenlikler dalga alanını bozma potansiyeline sahiptir ve bu nedenle kaçınılmalıdır9. Ayrıca, numune üzerindeki aşırı basınç, mekanik özelliklerini potansiyel olarak değiştirmenin yanı sıra, dalga alanının bozulmasına da yol açabileceğinden, biyofilm ile nazik temasın sürdürülmesi çok önemlidir. Son olarak, harmonik dalganın uzamsal frekansının ölçümden doğru bir şekilde belirlenmesini sağlamak için tarama bölgesi dalga cephelerine dik olmalıdır.
Bazı frekanslar için, her iki örnekte de doğal heterojenliklerine, bu belirli frekanstaki dalga alanına ve yayılma yollarının morfolojisine atfedilebilecek dalga hızlarında önemli değişiklikler gözlendi. Daha önce, kesitli bir granüler biyofilm boyunca ölçülen dalga hızı profilinin, heterojen mikro yapı9 nedeniyle tekdüze olmadığını göstermiştik. Sonuç olarak, bu tekniği granüler biyofilmler üzerinde kullanırken, ortalama bir temsil elde etmek için numune boyunca birden fazla yerde ölçüm yapmak zorunludur.
Dağılım eğrileri ile ilgili önemli bir gözlem, farklı örneklem büyüklükleri için farklı davranışlar sergilemeleridir. Daha büyük numune söz konusu olduğunda, eğri ölçülen aralık boyunca nispeten sabit kalır. Bununla birlikte, daha küçük numune için, özellikle aralığın alt kısmında, artan frekansla dalga hızında yukarı doğru bir eğilim vardır. Bu fenomen, daha düşük frekanslarda viskoelastik etkilerin varlığına ve elastik dalga kılavuzu modlarının oluşturulmasına bağlanabilir. Bu etkileri önceki çalışmamızda daha karmaşık ters modeller 8,9,18 kullanarak açıkladık.
Aerobik granüler sistemlerde, biyokütlenin reaktörün yüksekliği boyunca eşit olarak dağılmadığına dikkat etmek önemlidir. Havalandırmasız aşamalarda, daha büyük granüller reaktörün dibine yerleşme eğilimindedir. Bu eşit olmayan dağılım, farklı boyutlardaki agregaların değişen miktarlarda alt tabakaya erişmesine neden olur. Sonuç olarak, farklı boyutlardaki agregalar farklı topluluk kompozisyonu sergiler. Ek olarak, fazla çamur seçici olarak uzaklaştırıldığından, daha büyük granüller reaktörde daha uzun süre tutulma eğilimindeyken, daha küçük olanlar daha kolay çıkarılır32. Young modülündeki göze çarpan fark, biyofilm bileşimi, yaş ve mekanik özellikler arasında potansiyel bir bağlantı olduğunu göstermektedir.
Özetle, Optik Koherens Elastografi (OCE) yöntemi, biyofilmlerde elastik dalga hızını değerlendirmek için hızlı ve tahribatsız bir yol sunar. Bu yöntem, reolojik ölçümlerin kısıtlamalarının üstesinden gelir ve alternatif elastografi tekniklerine kıyasla gelişmiş özellikler sergiler 8,18. Ayrıca, uygulanabilirliği, hidrojeller33, kornea34 ve deri35 gibi örnekler de dahil olmak üzere, uygun optik penetrasyon derinliğine ve sistem tarafından çözülebilecek kadar büyük boyuta sahip herhangi bir kısmen saydam numuneyi kapsayacak şekilde granüler biyofilmlerin ötesine uzanır. Yöntemin gelecekteki ilerlemeleri birkaç önemli yönü kapsar. İlk olarak, harmonik elastik dalgaların frekansını yüzlerce kHz aralığına çıkarmak, birkaç mikrometrelik dalga boylarına izin verecek ve böylece benzer bir ölçekte uzamsal çözünürlük elde edecektir. İkinci olarak, optik algılama sisteminin sinyal-gürültü oranı, OCT sisteminin optik gücünü 2 mW'tan (akım) 20 mW'a çıkararak geliştirilecektir. Son olarak, temaslı harmonik aktüatörü temassız bir akustik radyasyon basınç kaynağı ile değiştireceğiz. Bu ekleme, non-invaziv ve tahribatsız çalışmayı kolaylaştıracak ve biyofilm örneklerinin kendi doğal ortamlarında sorgulanmasına izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Yazarlar, bu çalışmada incelenen granüler biyofilmleri sağladığı için Aqua-Aerobic Systems, Inc.'e (Rockford, IL, ABD) teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Ulusal Bilim Vakfı'nın #210047 ve #193729 Ödülü ile desteğini kabul ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed sample holder | |||
| 3D printed wedge tip | 3 mm width | ||
| BNC cables | Any brand | ||
| Delay generator | Stanford Research Systems | DG535 | DG535 Digital delay/ Pulse Generator |
| Function generator | Agilent Technologies | 33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator | |
| Granular biofilm | Aqua-Aerobic Systems | Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.) | |
| MATLAB | MathWorks | Release 2022a (MATLAB 9.12) | |
| Piezoelectric transducer | Thorlabs | PK2JUP1 | Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement |
| SD-OCT System | Thorlabs | Ganymede II, LSM03 scan lens | |
| ThorImageOCT | Thorlabs | Version: 5.5.5 |
References
- Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476 (2022).
- Pholchan, M. K., Baptista, J. deC., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
- Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
- Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935 (2023).
- Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
- Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
- Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
- Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
- Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394 (2021).
- Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
- Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366 (2020).
- Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635 (2019).
- Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
- Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
- Pitre, J. J. Jr, et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
- Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
- Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
- Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
- Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
- Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020 (2017).
- Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
- Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
- Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032 (2022).
- Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M.
- Graff, K. F. Wave motion in elastic solids. , Dover Publications. (1991).
- Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
- Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
- Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
- Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography - OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
- Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
- Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822 (2022).
- Kirby, M. A., et al.
- Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).
