Summary
本研究描述了通过结合显微计算机断层扫描 （micro-CT） 和造影剂在 离体 样本中获得新生小鼠大脑高分辨率图像的步骤。我们描述了基本的形态测量分析，以量化这些图像中的大脑大小和形状。
Abstract
神经图像是使用动物模型在实验中研究大脑形态的宝贵工具。磁共振成像（MRI）已成为软组织的标准方法，尽管其低空间分辨率对小动物造成了一些限制。在这里，我们描述了一种使用显微计算机断层扫描（micro-CT）获取小鼠新生儿大脑和颅骨的高分辨率三维（3D）信息的方案。该协议包括解剖样本、染色和扫描大脑以及获得整个器官和感兴趣区域 （ROI） 的形态测量值所需的步骤。图像分析包括结构的分割和点坐标的数字化。总之，这项工作表明，将micro-CT和Lugol溶液作为造影剂的组合是小动物围产期大脑成像的合适替代方案。这种成像工作流程在发育生物学、生物医学和其他科学中都有应用，这些科学对评估各种遗传和环境因素对大脑发育的影响感兴趣。
Introduction
显微计算机断层扫描 （micro-CT） 成像是不同研究领域的宝贵工具。在生物学中，由于X射线在矿化组织中的吸收，它特别适用于骨骼研究。由于这一特点，在显微CT的帮助下，已经解决了有关骨骼发育1、代谢2和进化3,4等主题的各种问题。2008 年，de Crespigny 等人 5 表明，使用碘作为造影剂可以获得成年小鼠和兔子大脑的显微 CT 图像。这项工作为这种成像技术开辟了新的应用，因为碘允许从软组织获取图像，否则这些图像对X射线不敏感。因此，将显微CT和碘造影剂相结合的总体目标是获得高分辨率图像，其中可以在中观或宏观解剖学水平上区分和识别软组织。
该技术在需要对小标本（如小鼠胚胎）进行详细的离体表型表征的研究方面具有显着的潜力，这些标本广泛用于实验设计6。碘造影剂与显微 CT 成像相结合已用于获得器官7 和标志性三维 （3D） 结构 8,9 的体积定量。近年来，染色样本的显微CT扫描已被应用于描述啮齿动物的大脑表型特征10，并提出了对该技术的不同改进。对于成人大脑，发现将48小时浸泡在碘中，并用水凝胶灌注的先前步骤，可产生高质量的图像11。Gignac等人12扩大了该技术的局限性，表明可以对用碘染色的大鼠大脑进行处理以执行常规组织学技术。同样，这些程序对胚胎和断奶前啮齿动物的大脑8,13,14,15显示出有希望的结果。
尽管神经科学在很大程度上应用了基于显微镜的技术来评估大脑发育的不同结构和功能方面，但这些研究更适合表征特定的细胞群或空间有限的结构。相反，显微CT成像可以描述整个结构并获取保留相关空间信息的3D模型，这是对显微技术的补充。磁共振成像（MRI）也是一种用于探索小动物结构特征的标准技术16,17,18。然而，使用造影剂的显微 CT 对于离体固定样本有两个主要优点：显微 CT 扫描仪成本低得多且易于操作，并且比 MRI12 具有更高的空间分辨率。
这项工作旨在描述在用碘基造影剂 Lugol 溶液染色后使用显微 CT 扫描从新生小鼠大脑获取高分辨率图像的过程。提出了一个全面的方案，从样本采集和组织固定等初步阶段开始，经过染色、显微 CT 图像采集和标准处理。图像处理包括对整个头部和大脑的 3D 体积进行分割，以及选择特定的解剖平面以数字化点坐标，然后可用于形态测量分析。虽然这里的重点是新生小鼠的大脑，但类似的策略可以应用于其他软组织。因此，这里介绍的方案足够灵活，只需稍作修改即可应用于其他类型的样品。
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Protocol
所有实验程序均遵循加拿大动物护理委员会的指导方针。
1. 样品采集和制备
- 制备 500 mL 4% 多聚甲醛 （PFA）。
- 在柜中的萃取助焊剂下，将 20 g PFA 粉末加入 1 L 玻璃烧杯中的 250 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。将带有磁铁的烧杯放在磁力搅拌板上。
- 加热时搅拌。使用温度计，不断检查溶液的温度，使其保持在60°C以下。
- 用塑料巴斯德移液管，向溶液中加入1M NaOH滴以溶解PFA。PFA粉末完全溶解后，在室温（RT）下冷却溶液。
- 用 1x PBS 将体积调节至 500 mL。用塑料巴斯德移液管加入1M HCl滴，将pH调节至7.2-7.3。
- 使用纸过滤器和玻璃漏斗，过滤 1 L 玻璃瓶中的溶液。
- 关闭玻璃瓶，将其从助焊剂柜中取出，并存放在-4°C的冰箱中。
- 收集大脑样本。
- 为了获得样本，在出生后的早晨，在0.5天大的小鼠新生儿（P 0.5）处死，使用手术剪刀将其斩首。
- 将剪刀放在新生儿的脖子上，同时握住身体，然后进行一次干净的剪裁。
- 将样品固定在PFA中。
- 用 40 mL 4% PFA 填充 50 mL 锥形管。
- 将每个头浸入含有PFA作为固定剂的管中。对于此操作，请使用 Paton 铲子或勺子。
- 将锥形管在-4°C下储存在冰箱中48小时，然后改为40mL含有0.1%叠氮化钠作为防腐剂的1x PBS。在-4°C下冷藏保存。
2. 样品染色
- 准备Lugol溶液（3.75%w / v）。
- 在柜子中的提取助焊剂下，在 1 L 玻璃烧杯中，将 10 g Kl 和 5 g I2 溶解在 400 mL 蒸馏水中，使用磁力搅拌器恒定混合。
- 将每个头浸入含有 40 mL Lugol 溶液的 50 mL 锥形管中。
- 对于体型约为1.3g的新生儿，将样品浸泡15-20小时，并使用轨道振荡器不断混合。
- 扫描前将样品放入含有 10 mL 1% 琼脂糖的 15 mL 锥形管中 30 分钟。
3. 显微CT扫描
注意：显微 CT 扫描需要特定设备。这种扫描仪有不同的选择，采集的细节取决于所用设备的特性。Hallgrímsson博士的实验室依靠一些微型CT扫描仪的替代品。在这里，该协议基于使用基本的桌面扫描仪，这是世界各地实验室使用的更易于访问的小动物成像机器之一。如果扫描目标是头骨，请跳过协议第 2 节中的步骤并继续第 3 节。扫描颅骨后，可以进行染色过程和大脑扫描，以获得大脑和颅骨的相同标本的图像。
- 将样品放入显微 CT 支架中。
- 将样品放入 50 mL 锥形管中。修复样品以避免在扫描仪会话期间移动。为此，可以使用一些聚氨酯材料来填充管子的空部分。
- 打开设备，将装有样品的试管放入微型 CT 支架中。
- 登录 micro-CT 控制面板并注册要扫描的样品。这将自动生成一个样本编号。除了数字之外，请填写“名称”字段。样本名称和编号都应记录在其他地方（例如，在电子表格中），以防需要再次检索原始数据。
- 启动扫描程序。输入样品名称或编号，然后选择一个 控制 文件，其中应包含扫描参数。
- 扫描样品。
- 在显微CT软件的屏幕中，设置以下参数：各向同性体素大小为0.012 mm，45 kVp，177 lA，积分时间为800,000 ms，每180°投影500次。
- 通过选择 “侦察视图”来设置扫描区域。参考图像出现后，按 参考线 设置区域。将绿色实线移动到样品的边缘，然后在拖动光标的同时按 住 Shift 键以将扫描区域扩展到样品的另一边缘。
- 选择 “确定 ”开始扫描。
- 评估并导出扫描。
- 打开显微CT扫描仪评估程序，然后单击 选择样品 和 测量。在 过滤器 字段中，键入样品名称，选择样品，然后选择测量文件。
- 该文件将作为切片加载，其数量取决于初始扫描窗口。单击 “全部加载 ”按钮，该按钮将加载每个切片并方便稍后在切片之间移动。
- 选择 “任务”>“评估 3D ”以初始化切片周围的裁剪框。将出现一个 3D 评估提示，其中包含许多字段，包括 任务/评估、VOI（感兴趣体积）、开始 X、Y、Z 和 维度 X、Y、Z。
- 将 “任务>评估 3D ”字段设置为适当的脚本，因为可以执行各种评估任务，例如重建、分割、形态测量（例如骨矿物质密度）以及文件转换或传输。 默认评估 脚本可用作指南。
- 选择脚本后，调整主图像上的 VOI 框。从第一个切片开始。确保盒子包含要评估的解剖结构。通过右键单击框边缘的白色小方块之一并使用鼠标中键调整 VOI 大小来移动 VOI。或者，以数字方式调整 “维度 ”字段。
- 使用图像下方的滚动条遍历样本，以确保所有解剖结构都已捕获到 VOI 框中。单击软件左上角附近的 XY、XZ 或 YZ 以更改方向。
- 选择 “开始评估”。根据任务评估脚本，这将生成一个 3D .aim 图像文件，其中包含相应的.txt头文件。此外，还可以在脚本中指定一个路径，用于将图像的文件传输协议 （FTP） 发送到特定位置。
4. 图像处理
- 在图像处理软件中打开图像。
注意： 可以使用各种软件进行图像处理。该协议包括商业软件中的基本步骤，该软件在该领域被广泛接受，并具有用于基本和高级处理的多功能工具。此外，重建的显微 CT 图像有不同的可接受格式。这方面通常取决于用于采集的设备及其软件。在这里，图像处理是用.bmp图像进行的。相同的过程可以应用于.tiff图像和其他类型。由于采集是在以 .aim 为默认格式的扫描仪中进行的，因此首先给出了从 .aim 到 .bmp 的转换。- 若要打开 .aim 文件，请选择 “文件”>“打开数据 ”，然后选择该文件。之后，将打开一个标题为“文件格式选择”的窗口。选择 “原始数据”。
- 将打开一个标题为“原始数据参数”的窗口。在此窗口中，按照为每个 .aim 文件生成的头.txt文件信息填写参数。对于 Data Type （数据类型），选择 16 位作为标头，并在图像数据从字节偏移量开始后的数字。此外，使用头文件.txt上的信息设置尺寸和体素大小。参数完成后，按 OK。
- 如果需要将 .aim 转换为 .bmp，请在 “项目视图”>“主面板”中右键单击 .aim 对象，然后选择 “转换”选项>“转换图像类型”。在 “属性”上，选择“ 8 位 ”作为 “输出类型”。选择 “应用”。
- 右键单击新的 8 位对象。选择 “另存为”。选择“ .bmp ”并保存。
- 若要打开.bmp文件，请选择 “文件”>“打开数据 ”，然后选择该文件。之后，将打开一个包含图像参数的窗口。确认参数，如果正确，则接受。
- 在 “项目视图”>“主面板”中，将创建一个具有.bmp文件名称的新对象。右键单击此对象，然后选择 “正射切片”选项。在 “属性”中，选择要查看的切片编号和方向平面。
- 获取完整头部的 3D 体积。
- 在 “项目视图”>“主面板”中，右键单击图像对象。选择“ 交互式阈值”选项>“创建”。在 “属性”中，更改 “最小 RGB” 和 “最大 RGB ”的值，直到选择与动物头部对应的图像部分。选择 “应用”。
- 在 “项目视图”>“主面板”中，将创建一个阈值对象。右键单击此对象，然后在 “属性”中选择 “等值面”。在 “属性”（Properties） 中，选择一个阈值以可视化曲面，然后单击 “应用”（Apply）。这个阈值需要根据经验选择，然后可能需要检查不同的值。
- 数字化点坐标
- 3D 点坐标可以基于切片或提取的曲面进行数字化。对于第一个选项，右键单击图像选项，然后选择切片。在“平移”中，在轴向平面中选择所需的切片。如果平面未正确放置，请单击“属性”中的“选项”>“旋转”以建立正确的方向。
- 要数字化地标，请在“项目视图”>“主面板”中单击鼠标右键，然后选择“创建对象>点和线>地标”。右键单击新的对象地标，然后选择地标视图。在“地标视图”中，修改“大小”中的点的大小。若要在“属性”中添加地标，请使用“在编辑模式下添加”选项。
注意：对于新生儿，之前发表了一组围绕大脑轴向和矢状曲线的标志和半标志14。 - 首先，选择穿过嗅球最喙点和皮层最尾点的轴向平面。
- 选择 对象地标 ，然后在 属性中选择 地标编辑器。使用箭头，单击要数字化的点的位置。
- 在建议的地标集中，24 个点在选定的轴向平面上数字化。将大脑最尾端中线的第一个数字化。
- 将均匀分布在曲线周围的五个点（半地标）数字化，直到中脑和皮层交叉处的下一个地标。
- 然后，将皮层周围的八个点（半地标）数字化。
- 将皮层和嗅球交叉处的新地标数字化。然后，将嗅球周围的四个点（半地标）数字化。
- 在中线嗅球的最顶端数字化一个新地标。然后，将两个嗅球之间的两个点（半地标）数字化。
- 在中线嗅球最尾部处数字化一个新地标。
- 对于矢状点，在大脑右侧的矢状旁平面处建立一个切片，那里是大脑尾部最突出的地方。
- 在拟议的地标集中，33 个点在选定的矢状旁平面上被数字化。将间脑和后脑交叉处的第一个数字化。然后，将大脑腹侧的九个点（半地标）数字化。
- 在嗅球的最顶端数字化一个新地标。然后，将嗅球周围的三个点（半地标）数字化。
- 将嗅球和皮层交叉点的新地标数字化。然后，将嗅球周围的三个点（半地标）数字化。
- 将嗅球和皮层交叉点的新地标数字化。然后，将皮层周围的七个点（半地标）数字化。
- 将大脑皮层和中脑交叉点的新地标数字化。然后，将皮层周围的七个点（半地标）数字化。
- 将大脑皮层和中脑交叉点的新地标数字化。然后，将中脑周围的六个点（半地标）数字化。
- 数字化中脑和小脑交叉点的新地标。然后，将小脑周围的两个点（半地标）数字化。
- 数字化小脑和后脑交叉处的新地标。
- 保存数字化点。右键单击 “对象地标 ”，然后选择“ 保存数据”选项。
- 分析点坐标。
注意：一旦一组试样的点坐标被数字化，就可以使用几何形态计量学工具进行基本分析，以获得尺寸（质心大小）和形状变量（形状或Procrustes坐标）。分析是在免费的开放软件环境中进行的，特别适用于统计分析。- 使用记事本，构建一个包含所有数字化标本坐标的文件。为此，请遵循 TPS 格式，如 https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm 中所述。
- 打开统计软件。 选择“文件”>“更改目录 ”以选择保存 .tps 文件的目录。
- 选择 “包”>“安装包”。选择一个 鹤镜。寻找 geomorph 并安装它。
- 通过在控制台中键入： library（geomorph） 和 library（Morpho） 来加载包。
- 通过在控制台中键入以下命令来加载数据集：dataset <- readland.tps（file=“NAME_OF_FILE.tps”， specID=“ID”）。
- 通过在控制台中键入以下命令来执行广义 Procrustes 分析：GPA<- gpagen（dataset）。
- 通过在控制台中键入以下内容来获取质心大小： CS<-GPA$Csize。
- 通过在控制台中键入以下内容来获取 Procrustes 坐标： ProcCoord<- GPA$coords。
- 通过在控制台中键入以下命令来绘制 Procrustes 坐标和平均形状：plotAllSpecimens（ProcCoord）。
- 投资回报率细分
注意：要分割大脑并获得 3D 重建，请手动识别每个切片中的脑组织。相同的程序可以应用于特定的 ROI，例如嗅球、皮层等。- 右键单击 “项目视图”>主面板 ，然后选择 “创建对象”>“标签字段”。
- 选择“标签字段”对象，按“属性”中的“分段编辑器”选项。
- 在 “材质”中，添加新材质，如果需要，将其重命名为“大脑”。
- 在 “选择”中，选择 “当前切片 ”选项，以分割每个切片中与大脑相对应的组织。
- 使用 “工具”中的选项，选择每个切片中的脑组织。对于这种情况， 魔杖 和 刷子 是最合适的。
- 在每个切片中进行选择后，按“在选择中添加”。
- 完成所有切片中的选择后，返回到“主面板”中的“项目视图”（Project View），右键单击“标签字段”（Label Field） 以选择“生成曲面”（Generate Surface），然后单击“应用”（Apply）。
- 获得曲面后，通过应用 “提取曲面”将其导出。
- 要获取分段结构的体积，请在 “主面板”>“项目视图”中，选择包含标签的对象，单击鼠标右键，然后选择 “测量 和 分析体积分数”>。然后，单击 “应用”。
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Representative Results
本文介绍了获得新生小鼠大脑高分辨率图像的基本方案。浸入 Lugol 溶液后扫描头部。尽管它们的体积很小，但可以区分主要的大脑解剖结构，如嗅球、皮层、中脑、小脑和后脑（图1）。
可以使用这些图像作为输入进行不同的分析。对两个不同解剖平面上的一组地标和半地标进行了数字化。如 图 2 所示，点沿大脑边界放置在所选平面上。数字化完成后，可以在.txt文件中读取点的坐标（图 3）。点数字化的目的是获得可进一步用于几何形态分析的原始坐标。所提出的方案侧重于单个样品，形态学分析适用于较大的样品，但使用同一组点获得的结果在其他地方提出14。
最后，对整个大脑进行手动分割的结果是大脑的 3D 模型（图 4）。在这些体积中，可以采用多种方法，从简单地估计它们的面积和体积到提取表面点，再到执行类似于此处介绍的曲线点的分析。
图 1：新生儿头部显微 CT 图像的代表性切片。 （A-C） 轴向、（D） 冠状面和 （E） 矢状旁平面。在矢状旁平面上可以区分的区域和结构：（a）嗅球，（b）皮层，（c）中脑，（d）小脑，（e）后脑。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：在拟议协议中数字化的地标和半地标。 （A）轴向平面和（B）矢状旁平面。数字表示地标。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：包含从软件导出的点坐标的文件示例。 标明了主要项目。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：手动分割后新生儿大脑的 3D 重建。 整个重建大脑的示例以两种视图呈现。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在这项工作中，介绍了一种使用显微CT和造影剂扫描小鼠新生儿脑组织的简明方案。此外，它还包括获得定量和定性输出的简单程序。在这些方法的基础上，可以进行进一步的替代或补充分析。
如协议所示，可以通过不同的方式分析显微CT图像。在之前的研究中，我们小组通过数字化点坐标和应用几何形态测量技术来估计小鼠围产期大脑的大小和形状变化 8,14。坐标的数字化对于使用简单的欧几里得距离估计获得线性测量也很有用。这与从大脑和 ROI 分割中获得的体积一起，是传统形态测量评估的宝贵输入。
尽管这里介绍的方案很容易应用于 离体 小样品，例如我们使用的样品，但它不适用于 体内 研究，因为固定，尤其是Lugol作为造影剂的溶液，是不可行的。显微CT成像 用于体内，通常用于硬组织检查19，但是在活新生儿中，通过血脑屏障到达大脑的造影剂的给药并不简单。因此，这里介绍的技术仍然是回答形态变异不同问题的有前途的工具。
由于开创性研究表明碘是脊椎动物胚胎的良好选择20，其应用迅速扩大，并且很明显，该技术的主要缺点之一是造影剂12产生的收缩。在使用这种方法的研究中，这是一个普遍存在的问题，用户在重现此处介绍的方案时应考虑它，因为预计会有一定程度的收缩。已经提出了多种策略来减少这种影响;Vickerton等人[21]研究了不同浓度的碘，并得出结论，收缩直接取决于浓度，而降低碘浓度在很大程度上有助于抑制这种效应导致的变形。另一个需要调整的点是适当的浸泡时间，这取决于结构的尺寸和硬度。经过一些测试，我们发现15-20小时足以对小鼠新生儿的脑组织进行染色并保留主要形态学特性。一些作者建议在染色前使用一些溶液，例如琼脂糖7 和水凝胶11,13，或应用缓冲的 Lugol 溶液，以防止酸化，从而防止收缩22。所有这些程序都可以添加到此处介绍的方案中，这是碘造影剂显微 CT 成像的一般和基本方法。
使用显微CT扫描仪对较大样本（如成年小鼠）的软组织进行成像有一些缺点。不建议使用浸泡程序进行染色，因为造影剂的分布可能是异质的。探索一些替代选择很重要，例如 通过 心脏灌注给药 Lugol 溶液。
总之，添加Lugol溶液的显微CT是小动物（特别是小鼠）围产期大脑成像的合适替代方案。这是一种获得高分辨率图像的简单方法，与组织学相辅相成，可以提供大脑形态变异的一致表征。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢刘伟的技术援助。这项工作由 ANPCyT PICT 2017-2497 和 PICT 2018-4113 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
References
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660 (2021).
- Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
- Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
- de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227 (2016).
- Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
- Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Gignac, P. M., O'Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
- Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184 (2022).
- Turnbull, D. H., Mori, S.
- Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615 (2018).
- Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
- Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol's solution. Scientific Reports. 11, 19781 (2021).
