Summary
Denna studie beskriver stegen för att få högupplösta bilder av neonatala mushjärnor genom att kombinera mikrodatortomografi (mikro-CT) och ett kontrastmedel i ex vivo-prover . Vi beskriver grundläggande morfometriska analyser för att kvantifiera hjärnans storlek och form i dessa bilder.
Abstract
Neurobilder är ett värdefullt verktyg för att studera hjärnans morfologi i experiment med djurmodeller. Magnetisk resonanstomografi (MRT) har blivit standardmetoden för mjukvävnader, även om dess låga rumsliga upplösning innebär vissa begränsningar för små djur. Här beskriver vi ett protokoll för att få högupplöst tredimensionell (3D) information om hjärnor och skallar hos nyfödda möss med hjälp av mikrodatortomografi (mikro-CT). Protokollet innehåller de steg som behövs för att dissekera proverna, färga och skanna hjärnan och få morfometriska mätningar av hela organet och intresseområden (ROI). Bildanalys inkluderar segmentering av strukturer och digitalisering av punktkoordinater. Sammanfattningsvis visar detta arbete att kombinationen av mikro-CT och Lugols lösning som kontrastmedel är ett lämpligt alternativ för att avbilda den perinatala hjärnan hos smådjur. Detta arbetsflöde för avbildning har tillämpningar inom utvecklingsbiologi, biomedicin och andra vetenskaper som är intresserade av att bedöma effekten av olika genetiska och miljömässiga faktorer på hjärnans utveckling.
Introduction
Mikrodatortomografi (mikro-CT) är ett värdefullt verktyg för olika forskningsområden. Inom biologin är den särskilt lämplig för benforskning på grund av röntgenabsorption i mineraliserade vävnader. På grund av denna funktion har olika frågor om bland annat benutveckling1, metabolism2 och evolution 3,4 närmats med hjälp av mikro-CT. År 2008 visade de Crespigny et al.5 att mikro-CT-bilder av vuxna mus- och kaninhjärnor kunde erhållas med jod som kontrastmedel. Detta arbete öppnade en ny tillämpning för denna avbildningsteknik, eftersom jod gjorde det möjligt att ta bilder från mjuka vävnader som annars skulle vara okänsliga för röntgenstrålar. Det allmänna målet med att kombinera mikro-CT och ett jodbaserat kontrastmedel är därför att få högupplösta bilder, där mjuka vävnader kan urskiljas och identifieras på meso- eller makroanatomisk nivå.
Denna teknik har anmärkningsvärd potential för studier som kräver detaljerad ex vivo fenotypisk karakterisering av små prover, såsom musembryon, som ofta används i experimentell design6. Jodkontrast i kombination med mikro-CT-avbildning har använts för att erhålla volymetriska kvantifieringar av organ7 och landmärken tredimensionella (3D) strukturer 8,9. Under de senaste åren har mikro-CT-skanning av färgade prover tillämpats för att beskriva hjärnans fenotypiska egenskaper hos gnagare10, och olika förbättringar av tekniken har föreslagits. För vuxna hjärnor visade sig ett protokoll på 48 timmars nedsänkning i jod, med ett tidigare steg av perfusion med en hydrogel, producera bilder av hög kvalitet11. Gignac et al.12 utvidgade gränserna för denna teknik genom att visa att råtthjärnor färgade med jod kunde bearbetas för att utföra rutinmässiga histologiska tekniker. På samma sätt visar dessa procedurer lovande resultat för embryonala och avvänjda gnagarhjärnor 8,13,14,15.
Även om neurovetenskapen till stor del har tillämpat mikroskopbaserade tekniker för att bedöma olika strukturella och funktionella aspekter av hjärnans utveckling, är sådana studier mer lämpade för att karakterisera specifika cellpopulationer eller rumsligt begränsade strukturer. Omvänt möjliggör mikro-CT-avbildning beskrivning av hela strukturer och förvärv av 3D-modeller som bevarar relevant rumslig information, vilket är ett komplement till mikroskopiska tekniker. Magnetisk resonanstomografi (MRT) är också en standardteknik som används för att utforska de strukturella egenskaperna hos små djur 16,17,18. Mikro-CT, med användning av ett kontrastmedel, har dock två huvudsakliga fördelar för ex vivo-fixerade prover: mikro-CT-skannrar är i stort sett billigare och lätta att använda och tillåter en högre rumslig upplösning än MRI12.
Detta arbete syftar till att beskriva proceduren för att erhålla högupplösta bilder från neonatala mushjärnor med hjälp av mikro-CT-skanning efter färgning med Lugols lösning, ett jodbaserat kontrastmedel. Ett omfattande protokoll presenteras, som börjar med preliminära stadier som provtagning och fixering av vävnader, och går igenom färgning, mikro-CT-bildtagning och standardbearbetning. Bildbehandling inkluderar segmentering av en 3D-volym av hela huvudet, såväl som av hjärnan, och val av specifika anatomiska plan för att digitalisera punktkoordinater som sedan kan användas i morfometriska analyser. Även om fokus här ligger på den neonatala mushjärnan, kan liknande strategier tillämpas på andra mjuka vävnader. Således är protokollet som presenteras här tillräckligt flexibelt för att kunna tillämpas, med subtila modifieringar, på andra typer av prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer följde riktlinjerna från Canadian Council on Animal Care.
1. Provtagning och beredning
- Förbered 500 ml 4 % paraformaldehyd (PFA).
- Under ett extraktionsflussmedel i ett skåp, tillsätt 20 g PFA-pulver till 250 ml 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i en 1 L glasbägare. Placera bägaren med en magnet på en magnetisk omrörarplatta.
- Rör om under uppvärmning. Kontrollera ständigt lösningens temperatur med en termometer för att hålla den under 60 °C.
- Med en Pasteur-pipett av plast, tillsätt droppar av 1 M NaOH till lösningen för att lösa upp PFA. När PFA-pulvret har lösts upp helt, kyl lösningen vid rumstemperatur (RT).
- Justera volymen till 500 ml med 1x PBS. Justera pH-värdet till 7,2-7,3 genom att tillsätta droppar på 1 M HCl med en Pasteur-pipett av plast.
- Filtrera lösningen i en 1 L glasflaska med hjälp av ett pappersfilter och en glastratt.
- Stäng glasflaskan, ta ut den ur flussmedelsskåpet och förvara i kylskåp vid -4 °C.
- Samla in hjärnprover.
- För att få prover offrar man nyfödda möss morgonen efter födseln, vid 0,5 dagars ålder (P 0,5), med hjälp av en kirurgisk sax för att halshugga dem.
- Placera saxen i nacken på det nyfödda barnet medan du håller i kroppen och gör ett enkelt och rent snitt.
- Fixera proverna i PFA.
- Fyll ett 50 ml koniskt rör med 40 ml 4 % PFA.
- Sänk ner varje huvud i röret som innehåller PFA som fixeringsmedel. Använd en Paton-spatel eller en sked för denna åtgärd.
- Förvara de koniska rören i kylskåp vid -4 °C i 48 timmar och byt sedan till 40 ml 1x PBS med 0,1 % natriumazid som konserveringsmedel. Förvaras i kylskåp vid -4 °C.
2. Färgning av prov
- Bered Lugols lösning (3,75 % vikt/volym).
- Lös upp 10 g Kl och 5 g I400 ml destillerat vatten under extraktionsflussmedel i ett skåp, i en 1 L glasbägare, med konstant blandning med hjälp av en magnetomrörare.
- Sänk ner varje huvud i ett 50 ml koniskt rör som innehåller 40 ml Lugols lösning.
- För nyfödda med en ungefärlig kroppsstorlek på 1,3 g, låt proverna vara nedsänkta i 15-20 timmar med konstant blandning med hjälp av en orbital shaker.
- Placera proverna i ett 15 ml koniskt rör som innehåller 10 ml 1 % agaros i 30 minuter före skanning.
3. Mikro-CT-skanning
OBS: Micro-CT-skanning kräver specifik utrustning. Det finns olika alternativ för denna typ av skanner, och detaljer om förvärv beror på egenskaperna hos den använda utrustningen. Dr. Hallgrímssons laboratorium räknar med några alternativ till mikro-CT-skannrar. Här är protokollet baserat på användningen av en grundläggande skrivbordsskanner, som är bland de mer tillgängliga avbildningsmaskinerna för smådjur som används av laboratorier runt om i världen. Om skanningsmålet är skallen, hoppa över stegen i avsnitt 2 i protokollet och fortsätt till avsnitt 3. Efter skanning av skallen kunde färgningsprocessen och skanningen av hjärnan utföras för att få bilder från samma prover av både hjärnan och skallen.
- Placera provet i mikro-CT-hållaren.
- Placera provet i ett 50 ml koniskt rör. Fixa sample för att undvika rörelser under skannersessionen. För detta ändamål kan lite polyuretanmaterial användas för att fylla de tomma delarna av röret.
- Öppna utrustningen och placera röret med provet i mikro-CT-hållaren.
- Logga in på micro-CT-kontrollpanelen och registrera sample som ska skannas. Detta genererar automatiskt ett exempelnummer. Förutom numret, fyll i fältet "Namn". Både provets namn och nummer bör registreras någon annanstans (t.ex. i ett kalkylblad) om rådata behöver hämtas igen.
- Starta skanningsprogrammet. Ange provets namn eller nummer och välj en kontrollfil som ska innehålla skanningsparametrarna.
- Skanna provet.
- På skärmen i micro-CT-programvaran ställer du in följande parametrar: isotropisk voxelstorlek på 0,012 mm, 45 kVp, 177 lA, 800 000 ms integrationstid och 500 projektioner per 180°.
- Ställ in skanningsområdet genom att välja Scout View. När referensbilden visas trycker du på Referenslinje för att ställa in regionen. Flytta den heldragna gröna linjen till provets kant och håll sedan ned Skift samtidigt som du drar markören för att utöka skanningsområdet till provets andra kant.
- Välj OK för att starta genomsökningen.
- Utvärdera och exportera genomsökningen.
- Öppna utvärderingsprogrammet för mikro-CT-skanner och klicka på Välj prov och mätning. I fältet Filter skriver du provnamnet, väljer exemplet och väljer måttfilen.
- Filen läses in som skivor, vars antal beror på det första skanningsfönstret. Klicka på knappen Ladda alla , som laddar varje segment och underlättar förflyttning mellan segment senare.
- Välj Uppgifter > Evaluation 3D för att initiera en beskärningsruta runt sektorerna. En 3D-utvärderingsprompt visas med ett antal fält, inklusive Uppgift/Utvärdering, VOI (Volume of Interest), Start X, Y, Z och Dimension X, Y, Z.
- Ställ in fältet Uppgift > Utvärdering 3D till lämpligt skript, eftersom en mängd olika utvärderingsuppgifter kan utföras, t.ex. rekonstruktion, segmentering, morfometri (t.ex. bentäthet) och filkonverteringar eller överföringar. Standardutvärderingsskriptet kan användas som vägledning.
- När du har valt skriptet justerar du VOI-rutan på huvudbilden. Börja på den första skivan. Se till att lådan innehåller den anatomi som ska utvärderas. Flytta VOI genom att högerklicka på en av de små vita fyrkanterna mot rutans kant och ändra storlek på VOI med hjälp av den mellersta musknappen. Du kan också justera dimensionsfälten numeriskt.
- Gå igenom sample med hjälp av rullningslisten under bilden för att säkerställa att alla anatomier har fångats i VOI-boxen. Klicka på XY, XZ eller YZ längst upp till vänster i programvaran för att ändra orienteringen.
- Välj Starta utvärdering. Beroende på uppgiftsutvärderingsskriptet kommer detta att generera en 3D .aim-bildfil med en motsvarande .txt-huvudfil. Dessutom kan en sökväg anges i skriptet för att FTP (File Transfer Protocol) avbildningen ska skickas till en viss plats.
4. Bildbehandling
- Öppna bilderna i bildbehandlingsprogrammet.
OBS: Bildbehandling kan utföras med hjälp av olika programvaror. Detta protokoll innehåller de grundläggande stegen i en kommersiell programvara, som är allmänt accepterad inom området och har mångsidiga verktyg för grundläggande och avancerad bearbetning. Dessutom finns det olika acceptabla format för rekonstruerade mikro-CT-bilder. Denna aspekt beror vanligtvis på den utrustning som används för förvärv och dess programvara. Här utförs bildbehandling med .bmp bilder. Samma procedur kan användas för .tiff bilder och andra typer. Eftersom insamlingen utförs i en skanner med .aim som standardformat presenteras först en konvertering från .aim till .bmp.- Om du vill öppna .aim-filer väljer du Arkiv > Öppna data och väljer filen. Därefter öppnas ett fönster med titeln Val av filformat. Välj Rådata.
- Ett fönster med titeln Rådataparametrar öppnas. I det här fönstret fyller du i parametrarna efter informationen i rubriken .txt filen som genereras för varje .aim-fil. För Datatyp väljer du 16-bitars för rubrik komplett med numret efter Bilddata börjar vid byteförskjutning. Ställ också in dimensionerna och voxelstorleken med hjälp av informationen i rubriken .txt filen. När parametrarna är klara trycker du på OK.
- Om konvertering från .aim till .bmp behövs, i huvudpanelen > projektvyn, högerklicka på .aim-objektet och välj alternativet Konvertera > konvertera bildtyp. På Egenskaper väljer du 8-bitars som utdatatyp. Välj Använd.
- Högerklicka på det nya 8-bitarsobjektet. Välj Spara som. Välj .bmp och spara.
- Om du vill öppna .bmp filen väljer du Arkiv > Öppna data och väljer filen. Därefter öppnas ett fönster med bildens parametrar. Bekräfta parametrarna och godkänn om de är korrekta.
- I huvudpanelen > projektvyn skapas ett nytt objekt med namnet på de .bmp filerna. Högerklicka på detta objekt och välj alternativet Ortho Slice. I Egenskaper väljer du segmentnummer och orienteringsplan som ska visas.
- Skaffa 3D-volymer av hela huvudet.
- I huvudpanelen > projektvyn högerklickar du på bildobjektet. Välj alternativet Interaktivt tröskelvärde > Skapa. I Egenskaper ändrar du värdena för Minsta RGB och Maximal RGB tills den del av bilden som motsvarar djurets huvud är markerad. Välj Använd.
- I huvudpanelen > projektvyn skapas ett tröskelobjekt. Högerklicka på det här objektet och välj Isosurface i Egenskaper. I Egenskaper väljer du ett tröskelvärde för att visualisera ytan och klickar på Använd. Detta tröskelvärde måste väljas empiriskt, sedan kan olika värden behöva undersökas.
- Digitalisering av punktkoordinater
- 3D-punktkoordinater kan digitaliseras både baserat på skivor eller extraherade ytor. För det första alternativet högerklickar du i bildalternativet och väljer Segment. I Översätt väljer du önskat segment i det axiella planet. Om planet inte är korrekt placerat klickar du på Alternativ > Rotera i Egenskaper för att ange rätt orientering.
- Om du vill digitalisera landmärken högerklickar du i huvudpanelen > projektvyn och väljer Skapa objekt > punkter och linjer > landmärken. Högerklicka på de nya objektlandmärkena och välj Landmärkesvy. I Landmärkesvy ändrar du storleken på punkten i Storlek. För att lägga till landmärken i Egenskaper, använd alternativet Lägg till i redigeringsläge.
OBS: För nyfödda har en uppsättning landmärken och halvlandmärken runt hjärnans axiella och sagittala kurvor tidigare publicerats14. - Välj först det axiella plan som korsar den mest rostrala punkten på luktbulberna och den mest kaudala punkten på cortex.
- Markera objektets landmärken och välj Landmärkesredigerare i Egenskaper. Använd pilen för att klicka på den plats där punkten ska digitaliseras.
- I den föreslagna uppsättningen landmärken digitaliseras 24 punkter i det valda axiella planet. Digitalisera den första i den mest kaudala punkten i hjärnan vid mittlinjen.
- Digitalisera fem punkter jämnt fördelade runt kurvan (halvlandmärken) till nästa landmärke i skärningspunkten mellan mellanhjärnan och hjärnbarken.
- Digitalisera sedan åtta punkter (halvlandmärken) runt cortex.
- Digitalisera ett nytt landmärke i skärningspunkten mellan hjärnbarken och luktbulberna. Digitalisera sedan fyra punkter (halvlandmärken) runt luktbulberna.
- Digitalisera ett nytt landmärke vid luktbulbernas mest rostrala punkt vid mittlinjen. Digitalisera sedan två punkter (halvlandmärken) mellan de båda luktlamporna.
- Digitalisera ett nytt landmärke vid den mest kaudala punkten av luktbulberna vid mittlinjen.
- För sagittala punkter, etablera en skiva i höger sida av hjärnan på ett parasagittalt plan där hjärnan är mest kaudalt framträdande.
- I den föreslagna uppsättningen landmärken digitaliseras 33 punkter i det valda parasagittalplanet. Digitalisera den första i skärningspunkten mellan diencefalon och bakhjärnan. Digitalisera sedan nio punkter (halvlandmärken) i hjärnans ventrala gräns.
- Digitalisera ett nytt landmärke vid luktbulbens mest rostrala punkt. Digitalisera sedan tre punkter (halvlandmärken) runt luktbulberna.
- Digitalisera ett nytt landmärke i skärningspunkten mellan luktbulben och cortex. Digitalisera sedan tre punkter (halvlandmärken) runt luktbulberna.
- Digitalisera ett nytt landmärke i skärningspunkten mellan luktbulben och cortex. Digitalisera sedan sju punkter (halvlandmärken) runt cortex.
- Digitalisera ett nytt landmärke i skärningspunkten mellan hjärnbarken och mellanhjärnan. Digitalisera sedan sju punkter (halvlandmärken) runt cortex.
- Digitalisera ett nytt landmärke i skärningspunkten mellan hjärnbarken och mellanhjärnan. Digitalisera sedan sex punkter (halvlandmärken) runt mellanhjärnan.
- Digitalisera ett nytt landmärke i skärningspunkten mellan mellanhjärnan och lillhjärnan. Digitalisera sedan två punkter (halvlandmärken) runt lillhjärnan.
- Digitalisera ett nytt landmärke i skärningspunkten mellan lillhjärnan och bakhjärnan.
- Spara de digitaliserade punkterna. Högerklicka på objektets landmärken och välj alternativet Spara data.
- Analysera punktkoordinaterna.
OBS: När punktkoordinaterna har digitaliserats för en uppsättning prover kan grundläggande analyser utföras med hjälp av geometriska morfometriska verktyg för att få fram storlek (centroidstorlek) och formvariabler (form- eller Prokrustes-koordinater). Analyserna utförs i en fri öppen programvarumiljö, som är särskilt lämplig för statistiska analyser.- Använd ett anteckningsblock för att bygga en fil som innehåller koordinaterna för alla digitaliserade exemplar. För detta ändamål följer du TPS-formatet, enligt beskrivningen i https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm.
- Öppna statistikprogrammet. Välj Arkiv > Ändra katalog för att välja den katalog där .tps-filen sparas.
- Välj Paket > Installera paket. Välj en Cran Mirror. Leta efter geomorph och installera den.
- Läs in paket genom att skriva i konsolen: library(geomorph) och library(Morpho).
- Läs in datauppsättningen genom att skriva i konsolen: dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID").
- Utför generaliserad Prokrustes-analys genom att skriva i konsolen: GPA<- gpagen(dataset).
- Hämta centroidstorleken genom att skriva i konsolen: CS<-GPA$Csize.
- Hämta Prokrustes-koordinater genom att skriva i konsolen: ProcCoord<- GPA$coords.
- Plotta Prokrustes-koordinaterna och medelformen genom att skriva i konsolen: plotAllSpecimens(ProcCoord).
- Segmentering av ROI
OBS: För att segmentera hjärnan och få en 3D-rekonstruktion, identifiera manuellt hjärnvävnaderna i varje skiva. Samma procedur kan tillämpas på specifika ROI:er, såsom luktbulber, cortex, etc.- Högerklicka på Huvudpanelen > Projektvy och välj Skapa objekt > etikettfält.
- Markera objektet Etikettfält och tryck på alternativet Segmenteringsredigerare i Egenskaper.
- I Material lägger du till ett nytt material och, om du vill, byter du namn på det till Hjärna.
- I Markering väljer du alternativet Aktuell sektor för att segmentera vävnaden som motsvarar hjärnan i varje segment.
- Använd alternativen i Verktyg och välj hjärnvävnaden i varje skiva. I det här fallet är trollstaven och borsten de mest lämpliga.
- När markeringen är gjord i varje segment trycker du på Lägg till i markering.
- När markeringen i alla segment är klar går du tillbaka till projektvyn i huvudpanelen och högerklickar på Etikettfält för att välja Generera yta och klickar sedan på Använd.
- När ytan har erhållits, exportera den genom att applicera Extract Surface.
- Om du vill hämta volymen för de segmenterade strukturerna markerar du det objekt som innehåller etiketten i huvudpanelen > projektvyn, högerklickar och väljer Mät och analysera > volymfraktion. Klicka sedan på Använd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenteras ett grundläggande protokoll för att få högupplösta bilder av neonatala mushjärnor. Huvuden skannades efter nedsänkning i Lugols lösning. Trots sin ringa storlek kan de viktigaste anatomiska strukturerna i hjärnan, såsom luktbulberna, cortex, mitthjärnan, lillhjärnan och bakhjärnan, urskiljas (Figur 1).
Olika analyser kan utföras med hjälp av dessa bilder som indata. En uppsättning landmärken och halvlandmärken i två olika anatomiska plan digitaliserades. Som kan observeras i figur 2 är punkter placerade längs hela hjärnans gräns på de valda planen. När digitaliseringen är klar kan koordinaterna för punkterna avläsas i en .txt fil (figur 3). Syftet med punktdigitalisering var att få fram råa koordinater som kan användas vidare i geometriska morfometriska analyser. Det presenterade protokollet är fokuserat på ett enda prov, och morfometriska analyser är lämpliga för större prover, men resultaten som erhålls med samma uppsättning punkter presenteras på andra ställen14.
Slutligen är resultatet av manuell segmentering av hela hjärnan en 3D-modell av hjärnan (Figur 4). I dessa volymer kan olika tillvägagångssätt användas, från att helt enkelt uppskatta deras area och volym till att extrahera ytpunkter, till att utföra analyser som liknar den som presenteras här för kurvpunkter.
Figur 1: Representativa snitt av en mikro-CT-bild av ett nyfödds huvud. (A-C) Axiella, (D) koronala och (E) parasagittala plan presenteras. Regioner och strukturer som kan urskiljas i det parasagittala planet: (a) luktbulber, (b) cortex, (c) mellanhjärnan, (d) lillhjärnan, (e) bakhjärnan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Landmärken och halvlandmärken digitaliserade i det föreslagna protokollet. (A) Axiella och (B) parasagittala plan presenteras. Siffror anger landmärken. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exempel på en fil som innehåller punktkoordinater som exporterats från programvaran. De viktigaste punkterna anges. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: 3D-rekonstruktion av ett nybarns hjärna efter manuell segmentering. Ett exempel på en hel rekonstruerad hjärna presenteras i två vyer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete introduceras ett kortfattat protokoll för att skanna neonatala hjärnvävnader från möss med hjälp av mikro-CT med ett kontrastmedel. Dessutom innehåller den enkla förfaranden för att få kvantitativa och kvalitativa resultat. Med utgångspunkt i dessa metoder kan ytterligare alternativa eller kompletterande analyser utföras.
Som framgår av protokollet kan mikro-CT-bilder analyseras på olika sätt. I tidigare studier har vår grupp uppskattat storleks- och formvariationen i perinatala hjärnor hos möss genom att digitalisera koordinater för punkter och tillämpa geometriska morfometriska tekniker 8,14. Digitaliseringen av koordinater är också användbar för att få linjära mätningar, med hjälp av en enkel euklidisk avståndsuppskattning. Detta, tillsammans med de volymer som härrör från hjärn- och ROI-segmenteringar, är värdefulla indata för traditionell morfometrisk bedömning.
Även om det protokoll som presenteras här är lätt att tillämpa på små prover ex vivo , som de vi använde, är det inte tillämpligt för in vivo-studier , eftersom fixering, och särskilt Lugols lösning som kontrastmedel, inte är genomförbar. Mikro-CT-avbildning används in vivo, vanligtvis för hårdvävnadsundersökning19, men administrering av kontrastmedel som når hjärnan och passerar den hematoencefaliska barriären hos levande nyfödda är inte enkel. Tekniken som presenteras här är alltså fortfarande ett lovande verktyg för att besvara olika frågor om morfologisk variation.
Sedan banbrytande studier visade att jod är ett bra val för ryggradsdjursembryon20, har dess tillämpning expanderat snabbt, och det blev uppenbart att en av de största nackdelarna med denna teknik är den krympning som produceras av kontrastmedlet12. Det är ett allestädes närvarande problem i studier som använder detta tillvägagångssätt, och användare bör överväga det när de reproducerar protokollet som presenteras här, eftersom en viss mängd krympning förväntas. Olika strategier har föreslagits för att minska denna effekt. Vickerton et al.21 undersökte olika koncentrationer av jod och drog slutsatsen att krympning beror direkt på koncentrationen, och att minskning av den till stor del hjälper till att begränsa deformationen på grund av denna effekt. En annan punkt att justera är rätt nedsänkningstid, som beror på strukturernas storlek och hårdhet. Efter några tester fann vi att 15-20 timmar är en tillräcklig period för att färga hjärnvävnaden hos nyfödda möss och bevara de viktigaste morfologiska egenskaperna. Vissa författare har föreslagit användning av vissa lösningar före färgning, såsom agaros7 och hydrogel11,13, eller applicering av en buffrad Lugols lösning som förhindrar försurning och följaktligen krympning22. Alla dessa procedurer kan läggas till i protokollet som presenteras här, vilket är ett allmänt och grundläggande tillvägagångssätt för mikro-CT-avbildning med jodkontrast.
Användningen av mikro-CT-skannrar för att avbilda mjukvävnader i större prover, såsom vuxna möss, har vissa nackdelar. En nedsänkningsprocedur för färgning rekommenderas inte eftersom fördelningen av kontrastmedlet förmodligen kommer att vara heterogen. Det kommer att vara viktigt att utforska några alternativa alternativ, som att administrera Lugols lösning via hjärtperfusion.
Sammanfattningsvis är mikro-CT med tillsats av Lugols lösning ett lämpligt alternativ för avbildning av perinatala hjärnor hos små djur, särskilt möss. Det är ett enkelt sätt att få högupplösta bilder som, kompletterat med histologi, kan ge en konsekvent karakterisering av hjärnans morfologiska variation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några motstridiga intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Wei Liu för hans tekniska hjälp. Detta arbete är finansierat av ANPCyT PICT 2017-2497 och PICT 2018-4113.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
References
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660 (2021).
- Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
- Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
- de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227 (2016).
- Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
- Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Gignac, P. M., O'Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
- Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184 (2022).
- Turnbull, D. H., Mori, S.
- Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615 (2018).
- Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
- Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol's solution. Scientific Reports. 11, 19781 (2021).
