Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die chirurgische Technik zur Implantation eines Elektrodenarrays auf den abdominalen Vagusnerv bei Ratten, zusammen mit Verfahren für chronische elektrophysiologische Tests und Stimulation unter Verwendung der implantierten Vorrichtung.
Abstract
Die abdominale Vagusnervstimulation (VNS) kann auf den subdiaphragmatischen Ast des Vagusnervs von Ratten angewendet werden. Aufgrund seiner anatomischen Lage hat es keine respiratorischen und kardialen Off-Target-Effekte, die üblicherweise mit zervikalem VNS in Verbindung gebracht werden. Das Fehlen von respiratorischen und kardialen Off-Target-Effekten bedeutet, dass die Intensität der Stimulation nicht verringert werden muss, um Nebenwirkungen zu reduzieren, die häufig bei zervikalem VNS auftreten. Nur wenige neuere Studien zeigen die entzündungshemmende Wirkung von abdominalem VNS in Rattenmodellen für entzündliche Darmerkrankungen, rheumatoide Arthritis und Glykämiereduktion in einem Rattenmodell für Typ-2-Diabetes. Die Ratte ist ein großartiges Modell, um das Potenzial dieser Technologie zu erforschen, da die Anatomie des Vagusnervs gut etabliert ist, die Größe des Nervs eine einfache Handhabung ermöglicht und viele Krankheitsmodelle verfügbar sind. Hier beschreiben wir die Methoden zur Reinigung und Sterilisation des abdominalen VNS-Elektrodenarrays und des chirurgischen Protokolls bei Ratten. Wir beschreiben auch die Technologie, die zur Bestätigung einer überschwelligen Stimulation erforderlich ist, indem evozierte zusammengesetzte Aktionspotentiale aufgezeichnet werden. Die abdominale VNS hat das Potenzial, eine selektive, wirksame Behandlung für eine Vielzahl von Erkrankungen, einschließlich entzündlicher Erkrankungen, zu bieten, und es wird erwartet, dass sich die Anwendung ähnlich wie die zervikale VNS ausweiten wird.
Introduction
Die Vagusnervstimulation (VNS), die an der zervikalen Stelle im Hals verabreicht wird, ist von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) für die Behandlung von refraktärer Epilepsie, refraktärer Depression und postischämischer Schlaganfallrehabilitationzugelassen 1 und von der Europäischen Kommission für Herzinsuffizienz in Europazugelassen 2. Die nicht-invasive zervikale VNS ist von der FDA für Migräne und Kopfschmerzen zugelassen1. Es wird erwartet, dass sich die Anwendung ausweiten wird, da jüngste klinische Studien die Wirksamkeit von VNS bei anderen Indikationen wie Morbus Crohn3, rheumatoider Arthritis 4,5 und beeinträchtigter Glukosetoleranz und Typ-2-Diabetes 6,7 zeigen. Obwohl vielversprechend, kann zervikale VNS Bradykardie und Apnoe verursachen, da die Nervenfasern, die die Lunge und das Herz innervieren, nicht zielgerichtet aktiviert werden 8,9,10. Nebenwirkungen wie Husten, Schmerzen, Stimmveränderungen, Kopfschmerzen und Anstieg des Apnoe-Hypopnoe-Index werden häufig bei Patienten berichtet, die zervikale VNS11,12 erhalten. Die Verringerung der Stimulationsstärke ist eine gängige Strategie zur Verringerung dieser Nebenwirkungen, jedoch kann eine reduzierte Ladung die Wirksamkeit der VNS-Therapie einschränken, da die therapeutischen Fasern nicht aktiviert werden11. Zur Unterstützung dieser Hypothese war die Ansprechrate von Patienten, die eine hochintensive Stimulation zur Behandlung von Epilepsie erhielten, höher als die von Patienten, die eine Stimulation niedriger Intensität erhielten13.
Die abdominale VNS wird am subdiaphragmatischen Vagusnerv oberhalb der Leber- und Zöliakieäste14 angelegt (Abbildung 1). Unsere vorherige Studie zeigte, dass VNS bei Ratten keine kardialen oder respiratorischen Nebenwirkungen verursacht, die mit zervikalem VNS10 verbunden sind. Frühere Studien zeigen auch entzündungshemmende Wirkungen von abdominalen VNS in einem Rattenmodell für entzündliche Darmerkrankungen und rheumatoide Arthritis10,15 sowie eine Verringerung der Glykämie in einem Rattenmodell für Typ-2-Diabetes16. Kürzlich wurde die abdominale VNS-Technologie für eine erste klinische Studie am Menschen zur Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen (NCT05469607) übersetzt.
Das periphere Nervenelektrodenarray, das zur Stimulation des abdominalen Vagusnervs (WO201909502017) verwendet wird, wurde speziell für den Einsatz bei Ratten entwickelt und besteht aus zwei bis drei Platinelektrodenpaaren im Abstand von 4,7 mm, die von einer medizinischen Silikonelastomermanschette, einer Nahtlasche zur Verankerung des Arrays an der Speiseröhre, einem Elektrodendraht und einem perkutanen Konnektor zur Befestigung an der Lendenwirbelsäule getragen werden (Abbildung 2). Der Bleidraht wird auf der linken Seite des Tieres unter die Haut getunnelt. Das Design mehrerer Elektrodenpaare ermöglicht die elektrische Stimulation des Nervs sowie die Aufzeichnung elektrisch evozierter zusammengesetzter Aktionspotentiale (ECAPs), die die korrekte Platzierung des Implantats auf dem Nerv und die überschwelligen Stimulationsintensitäten bestätigen. Abdominales VNS wird bei frei beweglichen Ratten für die Monate 10,15,16 gut vertragen. Dies ermöglicht die Bewertung seiner Wirksamkeit auf Krankheitsmodelle.
Dieses Manuskript beschreibt die Methoden für die Elektrodenarray-Sterilisation, die Implantation des abdominalen Vagusnervs und die chronische Stimulation und Aufzeichnung von ECAPs bei wachen Ratten zur Untersuchung der Wirksamkeit von abdominalen VNS in einer Vielzahl von Krankheitsmodellen. Diese Methoden wurden ursprünglich für die Untersuchung der Wirksamkeit von abdominalen VNS im Rattenmodell für entzündliche Darmerkrankungen10 entwickelt und wurden auch erfolgreich für ein Rattenmodell für rheumatoide Arthritis15 und Diabetes16 eingesetzt.
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Protocol
Alle Verfahren mit Tieren wurden von der Tierethikkommission des St. Vincent's Hospital (Melbourne) genehmigt und entsprachen dem australischen Kodex für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (National Health and Medical Research Council of Australia) und dem Gesetz zur Verhinderung von Tierquälerei (1986). Insgesamt wurden 24 weibliche Dark Agouti-Ratten (8-9 Wochen alt) für diese Studie verwendet. Die Versuchsgruppen bestanden aus: einer normalen Kohorte (n = 8), die keine Kollageninjektion oder VNS-Implantation erhielt; eine nicht stimulierte Krankheitskohorte (n = 8), die ein Implantat und eine Kollageninjektion erhielt (keine elektrophysiologischen Tests durchgeführt); und eine Kohorte stimulierter Krankheiten (n = 8), die ein Implantat, eine Kollageninjektion, elektrophysiologische Tests und eine VNS-Therapie erhielt. Die Implantationsoperation erfolgte 5 Tage vor der Kollageninjektion, und die Gewöhnung an die VNS-Therapie begann 4 Tage nach der Kollageninjektion und erfolgte über 7 Tage. Die VNS-Therapie wurde von Tag 11 bis einschließlich 17 nach Kollageninjektionangewendet 15. Für die Kohorte der stimulierten Krankheit wurden elektrophysiologische Tests unmittelbar nach der Implantation unter Narkose, am Tag der Kollageninjektion, 10 Tage nach der Kollageninjektion und am Tag des Abbruchs (17 Tage nach der Kollageninjektion) durchgeführt.
1. Beschallung und Sterilisation des Elektrodenarrays
- Stellen Sie den Ultraschallreiniger auf eine Frequenz von 80 kHz ein und füllen Sie den Ultraschalltank mit Leitungswasser. Tauchen Sie das Elektrodenarray in die Reinigungslösung in einen sauberen Kunststoffbehälter und legen Sie es in den Ultraschalltank.
HINWEIS: Die Reinigungslösung und die für jeden Schritt zu verwendende Beschallungszeit sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Verwenden Sie für jeden Schritt einen sauberen Behälter. - Legen Sie das beschallte Elektrodenarray mit einer sauberen Pinzette, die mit 0,5% flüssiger Reinigungslösung in destilliertem Wasser beschallt und in destilliertem Wasser gespült wurde, in einen Sterilisationsbeutel. Autoklavieren Sie das Elektrodenarray 45 Minuten lang bei einer maximalen Temperatur von 130 °C und lassen Sie es auf einer sauberen Bank trocknen.
2. Implantation des Elektrodenarrays am abdominalen Vagusnerv
HINWEIS: In dieser Studie haben wir weibliche dunkle Agouti-Ratten (im Alter von 8-9 Wochen)15 verwendet. Wir haben dieses Protokoll auch erfolgreich zur chronischen Implantation erwachsener männlicher Sprague-Dawley-Ratten (im Alter von 10-14 Wochen) eingesetzt10,16. Die Operation wird unter aseptischen Bedingungen durchgeführt, und alle Instrumente, Elektrodenträger und Verbrauchsmaterialien wie Gaze und Wattestäbchen werden durch Autoklavieren sterilisiert.
- Betäuben Sie die Ratte in einer Induktionskammer mit 3% Isofluran und 1 l/min Sauerstoff. Sobald kein Pedalreflex auf Zehenklemmen vorhanden ist, bewegen Sie die Ratte mit einem Thermostat auf dem Operationstisch auf die Heizmatte und legen Sie eine Isofluranmaske über die Nase.
- Überwachen Sie die Atemfrequenz und die Rektaltemperatur während der gesamten Operation und stellen Sie den Isofluranspiegel zwischen 1,5 % und 2,5 % ein, um die Atemfrequenz zwischen 40 und 62 Atemzügen pro Minute zu halten. Passen Sie bei Bedarf die Einstellung der Heizmatte an, um den rektalen Temperaturbereich zwischen 35,9 - 37,5 °C aufrechtzuerhalten.
- Analgesie-Prämedikation vor Beginn der Operation subkutan mit 1-ml-Spritzen mit 25-G-Nadeln (Carprofen 5 mg/kg und Buprenorphin 0,03 mg/kg subkutan) verabreichen.
- Rasieren Sie sich großzügig um die Inzisionsstelle herum, einschließlich des Bereichs entlang der ventralen Mittellinie vom Xyphoidfortsatz bis zum Ende des Brustkorbs, der Lendenwirbelsäule des Rückens entlang der dorsalen Mittellinie und der linken Körperseite zwischen Vorder- und Hintergliedmaße, um ein subkutanes Tunneln des Arrays zu ermöglichen.
- Reinigen Sie die Operationsstellen dreimal in kreisenden Bewegungen mit abwechselnden Runden Betadin und Alkohol und legen Sie ein OP-Tuch über das Tier. Verabreichen Sie Bupivacain (1-2 mg/kg) subkutan mit einer 1-ml-Spritze mit einer 25-g-Nadel an den dorsalen und ventralen Inzisionsstellen.
- Legen Sie das Tier in die Bauchlage und machen Sie einen 2 cm langen Schnitt auf dem Rücken, wo der perkutane Sockel mit einer Skalpellklinge verankert wird.
- Drehen Sie die Ratte in die Rückenlage und machen Sie mit einer Skalpellklinge einen 3 cm langen Schnitt auf der Haut entlang der Mittellinie direkt unter dem Xyphoidprozess. Halten Sie die Haut in der Nähe der Inzisionsstelle hoch und stauchen Sie mit einer Präparierschere die Hautschicht von der Muskelschicht um den Einschnitt herum stumpf ab.
- Um ein subkutanes Tunneln des Arrays vom Sockel bis zur Implantationsstelle zu ermöglichen, legen Sie das Tier auf die rechte Seite, führen Sie einen Hämostaten aus dem ventralen Schnitt ein und präparieren Sie stumpf in Richtung der dorsalen Inzisionsstelle. Schneiden Sie den Rand einer Nadelkappe ab und setzen Sie das Elektrodenarray ein, um es während des Transports zu schützen (Abbildung 1B). Tunneln Sie das Elektrodenarray mit den Händen (sterile Handschuhe tragen) unter der Haut in Richtung des ventralen Schnitts.
- Um Zugang zur Speiseröhre und zum Vagusnerv zu erhalten, legen Sie das Tier wieder in Rückenlage. Machen Sie einen 3 cm langen Schnitt in der Muskelschicht entlang der Mittellinie unterhalb des Xyphoidfortsatzes, der groß genug ist, um die gesamte Länge der Leber freizulegen. Vermeiden Sie bei diesem Schritt eine Schädigung der Leber.
- Machen Sie einen kleineren Schnitt (weniger als 1 cm) an der Muskelschicht seitlich (die linke Seite des Tieres) zum ventralen Hauptschnitt. Tunneln Sie das Elektrodenarray durch diesen kleinen Schnitt mit der in Schritt 2.8 verwendeten Nadelkappe, um das Array in die Bauchhöhle einzuführen.
HINWEIS: Dieser Schritt reduziert die Spannung, die auf die Hauptinzisionsstelle ausgeübt wird, und verringert das Risiko, dass die Nähte platzen. - Ziehen Sie die Haut- und Muskelschichten zurück, um die Bauchhöhle offen zu halten. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe feucht bleibt, indem Sie Wattestäbchen und in steriler Kochsalzlösung getränkte Gaze verwenden, um das Gewebe zu behandeln.
- Ziehen Sie die Leber vorsichtig zurück, indem Sie das Bindegewebe um sie herum mit einer Vannas-Schere durchtrennen und einen Retraktor über ein kleines Stück Gaze legen, das zum Schutz in Kochsalzlösung getränkt ist. Ziehen Sie den Magen vorsichtig zurück, um die Begradigung der Speiseröhre und des darüber liegenden Vagusnervs zu ermöglichen, indem Sie einen Retraktor zwischen Speiseröhre und Magen platzieren.
HINWEIS: Retraktoren werden durch Abrunden des spitzen Endes von Angelhaken hergestellt. - Identifizieren Sie nach Freilegung der ventralen Oberfläche der Speiseröhre den abdominalen Vagusnerv und seine Unteräste, einschließlich des Lebernervs, des Zöliakienervs und zweier Magenäste (Abbildung 1D).
- Schneiden Sie das Bindegewebe, das den abdominalen Vagusnerv mit der Speiseröhre verbindet, mit einer feinen Pinzette und einer Vannas-Schere und präparieren Sie die Länge des Nervs von knapp über dem Leber- und Zöliakieast in Richtung Zwerchfell. Achten Sie darauf, den Nerv nicht zu reißen, zu dehnen oder einzuklemmen. Platzieren Sie ein Elektrodenarray neben dem Nerv, um zu bestätigen, dass die Länge des Nervs vom Bindegewebe ausreichend entfernt ist, um in das Array zu passen.
- Sobald das Bindegewebe um den Nerv herum entfernt wurde, führen Sie die Seidennähte (7-0) auf der Elektrodenseite der Array-Manschette unter den Nerv hindurch. Öffnen Sie die Manschette des Arrays und platzieren Sie den Nerv vorsichtig in den Array-Kanal.
- Stellen Sie sicher, dass die gesamte Länge des Nervs innerhalb des Array-Kanals sitzt. Binden Sie die Nähte um die Manschette zusammen, um die Manschette sicher zu schließen und sicherzustellen, dass der Nerv nicht aus dem Kanal rutscht. Schneiden Sie die Nähte.
- Nähen Sie die Lasche des Arrays mit einer 7-0-Seidennaht auf die Speiseröhre, um das Array an Ort und Stelle zu sichern und ein Verdrehen zu verhindern. Vermeiden Sie es, die anderen Äste des Vagusnervs zu beschädigen oder die Nadel zu tief in die glatte Muskulatur der Speiseröhre einzuführen.
- Entfernen Sie vorsichtig die Retraktoren und stellen Sie sicher, dass die gesamte Gaze aus der Bauchhöhle entfernt wurde. Verabreichen Sie 1-2 ml warme sterile Kochsalzlösung mit einer 1-ml-Spritze in die Bauchhöhle und positionieren Sie die Leber wieder in die richtige Position.
- Schließen Sie die Muskelschicht mit 3-0 Seidennaht in der einfachen Laufnahttechnik und machen Sie sichere quadratische Knoten mit mindestens 3 Würfen an beiden Enden. Platzieren Sie die Nähte eng beieinander (ca. 3 mm Abstand), um Komplikationen wie Hernie/Vorwölbung des Xyphoidfortsatzes zu vermeiden.
- Verwenden Sie eine Naht, um den Einschnitt des Peritoneums zusammen mit dem Einschnitt der Muskelschicht zu schließen, um die Wahrscheinlichkeit einer Gewebeadhäsion zu verringern.
- Schließen Sie den Hautschnitt mit einem resorbierbaren Nahtmaterial (Vicryl 4-0). Verwenden Sie eine vergrabene Nahttechnik wie die vergrabene vertikale Matratzennaht oder die vergrabene Hautnaht, um zu verhindern, dass das Tier die Naht entfernt.
- Drehen Sie das Tier in die Bauchlage und verlängern Sie den dorsalen Schnitt mit einer Schere auf 4-5 cm und stumpf zwischen Muskel und Hautschicht weiter, damit die Verbindungsbasis des perkutanen Verbindungsstücks flach auf der Muskelschicht sitzen kann.
- Machen Sie mit Seide 3-0-Naht 6 bis 8 einfache unterbrochene Nähte um die Verbindungsbasis, um sie an der darunter liegenden Muskelschicht zu befestigen. Schließen Sie den Hautschnitt mit Silk 3-0 Naht unter Verwendung der horizontalen Matratzennahttechnik und sorgen Sie für sichere quadratische Knoten mit mindestens 3 Würfen.
HINWEIS: In diesem Schritt werden geflochtene Seidennähte aufgrund ihrer einfachen Handhabung und ihrer Fähigkeit, im Vergleich zu monofilen Nähten sicherere Knoten zu erzeugen, bevorzugt. - Nach Abschluss der Operation ist die Hartmann-Lösung subkutan (1 ml/100 g/h) zu verabreichen. Schalten Sie das Isofluran aus und lassen Sie das Tier auf einer Heizmatte unter Sauerstoffzufuhr (1,5 l/min) erholen. Sobald die Ratte bei Bewusstsein und vollständig mobil ist, bringen Sie die Ratte in ihren Heimatkäfig zurück, der auf ein Wärmekissen gelegt wird, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.
- Beobachten Sie genau, wie sich das Tier von Isofluran erholt, und stellen Sie sicher, dass das Tier Zugang zu Futter und Getränken hat. Verabreichen Sie in den nächsten zwei Tagen eine postoperative Analgesie (Carprofen 5 mg/kg, täglich) subkutan, um die Schmerzen zu lindern. Überwachen Sie das Tier mindestens 2x pro Tag und überprüfen Sie es auf Anzeichen von Stuhlgang, Qualität des Fells, Aktivitätsniveau und Vorhandensein von Schwellungen oder Ausfluss aus den Operationswunden.
- Nehmen Sie das Gewicht des Tieres auf und beginnen Sie in dem seltenen Fall, dass das Tier 10 % oder mehr verliert, mit einer intensiven Behandlung. Die Intensivbehandlung umfasst die subkutane Verabreichung von Flüssigkeiten (Hartmann-Lösung, 2x 10 ml) pro Tag, die Bereitstellung zusätzlicher Nahrung wie frisches Gemüse und Nahrungsergänzungsmittel sowie das Aufstellen der Hälfte des Käfigs auf ein Wärmekissen mit Thermostat für zusätzliche Wärme. Erhöhen Sie die Häufigkeit der Überwachung, bis sich das Tier erholt hat. Fahren Sie mit der Verabreichung von Analgesie (Carprofen 5 mg/kg, SQ, täglich) fort, falls erforderlich, basierend auf einer Grimace-Skala.
3. Elektrophysiologische Tests
HINWEIS: Die Aufzeichnung evozierter zusammengesetzter Aktionspotentiale (ECAPs) bestätigt die ordnungsgemäße Platzierung des Elektrodenarrays auf dem Vagusnerv. Darüber hinaus liefert die Aufzeichnung von ECAPs unter Verwendung des oben beschriebenen Elektrodenarrays eine wahrscheinliche Bestätigung der elektrischen Aktivierung vagaler C-Fasern und der überschwelligen VNS10,15.
- Messen Sie die gemeinsame Erdungsimpedanz von Elektroden, um ihre Integrität zu beurteilen und Unterbrechungen oder Kurzschlüsse von Drähten vor der Aufzeichnung von ECAPs zu erkennen. Funktionierende abdominale Vagusnervelektroden in vivo sollten Impedanzwerte zwischen 4 - 20 kΩ haben.
- Versuchstiere in Narkose, d.h. unmittelbar nach der Operation, oder wach und frei beweglich. Führen Sie mindestens 2-3 Tage nach der Operation einen Wachtest durch, damit die chirurgischen Hautwunden heilen und stabilisieren können. Stellen Sie die für die Impedanz- und elektrophysiologische Prüfung erforderliche Ausrüstung zusammen, die einen maßgeschneiderten Stimulator, ein Datenerfassungsgerät, einen isolierten Differenzverstärker und eine Datenerfassungs- und Analysesoftware umfasst, wie in der Materialtabelle aufgeführt.
- Wickeln Sie das Tier bei Bedarf in ein Handtuch, schließen Sie ein Kabel an den hinteren perkutanen Anschluss an und verbinden Sie das andere Ende des Kabels mit einem Stimulator. Um die gemeinsame Erdungsimpedanz von Elektroden zu testen, legen Sie zweiphasige Stromimpulse (100 μs pro Phase und Strom von 107 μA) zwischen der interessierenden Elektrode und allen anderen Elektroden auf dem Array an.
- Messen Sie die Spitzenspannung am Ende der ersten Phase der Spannungswellenform (V gesamt) und berechnen Sie die Gesamtimpedanz (Zgesamt) nach dem Ohmschen Gesetz (Z = Spannung/Strom).
- Schließen Sie ein Elektrodenpaar an den Stimulator und ein Elektrodenpaar an das Kontrollgerät an und wenden Sie eine bipolare Stimulation an, um ECAPs zu erzeugen, wobei die Referenzelektrode des VNS-Implantats, das unter der Haut platziert wird, als Referenz für die differentielle Aufzeichnung von ECAPs verwendet wird. Erstellen Sie zwei Sätze von Aufnahmen, die aus insgesamt 50 Wiederholungen gemittelt werden, mit der Datenerfassungs- und Analysesoftware.
- Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für Messungen.
Ströme: 0 bis 2 mA in Schritten von 0,1 mA;
Pulsbreite: 25 - 200 μs;
Interphasenabstand: 8 - 50 μs;
Stimulationsrate: 10 - 30 Impulse/s;
Abtastrate: 100 kHz;
Filter: Hochpass 200 Hz, Tiefpass 2000 Hz, Spannungsverstärkung 1 x 102. - Analysieren Sie mit der Datenanalysesoftware die ECAP-Antwort, indem Sie die Spitze-Spitze-Spannung der Wellenformen innerhalb des Analysefensters messen (4 - 10 ms nach dem Stimulus, angezeigt durch Schattierung in Abbildung 3A,B). Der ECAP-Schwellenwert ist definiert als die minimale Stimulusstromintensität, die in beiden Sätzen von durchschnittlichen elektrophysiologischen Aufzeichnungen eine Antwortamplitude von mindestens 0,1 μVSpitze-Spitze erzeugt. Eine gültige Antwort wird für mindestens zwei aktuelle Pegel oberhalb des Schwellenwerts wiederholt und für mindestens zwei aktuelle Pegel unterhalb des Schwellenwerts10,15 nicht vorhanden.
4. Chronisches abdominales VNS bei wachen Ratten
HINWEIS: Die abdominale VNS kann bei wachen Tieren angewendet werden, sobald die Operationswunde um den perkutanen Konnektor verheilt und stabilisiert ist. Um Stressreaktionen zu reduzieren und eine bessere Datenerfassung zu ermöglichen, werden die Tiere sieben Tage vor der Implantationsoperation und dem Beginn der VNS-Therapie eine Stunde täglich an die Handhabungs- und Stimulationsumgebung der Tester gewöhnt.
- Messen Sie die Impedanz jeder Elektrode wie in Schritt 3.4 beschrieben, bevor Sie VNS anwenden. Stellen Sie sicher, dass die Impedanz der Stimulationselektroden unter 20 kΩ liegt.
- Schließen Sie ein Kabel an den hinteren perkutanen Anschluss an und verbinden Sie das andere Ende des Kabels mit einem Stimulator, der für eine geeignete Stimulation programmiert ist (z. B. 27 Hz, 1,6 mA, 200 μs Pulsbreite mit 50 μs Interphasenabstand, 30 s EIN, 2,5 min aus15), und schalten Sie den Stimulator ein.
Anmerkungen: Obwohl Tiere oft beobachtet werden, dass sie während der Stimulation einschlafen, wenn sie entsprechend gewöhnt sind, verwenden Sie nach Möglichkeit ein Kabel mit schützendem Außenmaterial wie Stahlspulen, um zu verhindern, dass es gekaut wird. - Beobachten Sie das Tier zu Beginn jeder VNS-Therapiesitzung, um sicherzustellen, dass keine Nebenwirkungen wie übermäßige Fellpflege oder plötzliche Erhöhung/Abnahme des Aktivitätsniveaus synchron zum Zeitpunkt der Stimulation auftreten.
- Überwachen Sie alle 30 Minuten, um zu überprüfen, ob das Kabel verdreht oder getrennt wird. Um VNS chronisch anzuwenden (z. B. 3 Stunden pro Tag über 7 Tage15), wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.3 zu Beginn jeder Sitzung.
HINWEIS: Die Verwendung eines Kommutators kann die Wahrscheinlichkeit verringern, dass Kabel verdrillt werden, und erfordert möglicherweise eine weniger häufige Überwachung.
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Representative Results
Die Aufzeichnung evozierter zusammengesetzter Aktionspotentiale (ECAPs, Abbildung 3A,B) unmittelbar nach der Operation ist eine Technik, die verwendet werden kann, um die korrekte Platzierung des Nervs innerhalb des Array-Kanals zu bestätigen, und diese Stimulation ist wirksam bei der Aktivierung des Vagusnervs.
In Abbildung 3 wurde weiblichen dunklen Agouti-Ratten (8-9 Wochen alt) das VNS-Elektrodenarray implantiert. Bei Ratten, die nach dem Zufallsprinzip für die therapeutische Stimulation ausgewählt wurden, wurden ECAPs unmittelbar nach der Operation (Tag 0, Abbildung 3A) und am Ende der VNS-Therapiesitzung (Tag 23, Abbildung 3B) aufgezeichnet. Das Vorhandensein von ECAPs (Abbildung 3B) deutete darauf hin, dass die Stimulationsintensität über der neuronalen Schwelle lag und dass der Nerv erfolgreich aktiviert wurde. Tiere in der VNS-Behandlungsgruppe wurden ausgeschlossen, wenn keine ECAPs aufgezeichnet wurden, da es keine Garantie für eine erfolgreiche Stimulation gab15. Die Latenz der neuronalen Antwort (Abbildung 3A, B, durch grünen Pfeil gekennzeichnet) kann verwendet werden, um zu beurteilen, welche Klasse von Fasern aktiviert wurde.
In früheren Studien haben wir beobachtet, dass die meisten neuronalen Reaktionen typischerweise zwischen 4 ms und 10 msauftreten 10,15. Da der Abstand zwischen stimulierenden und aufzeichnenden Paaren 4,7 mm beträgt, beträgt die ungefähre Leitungsgeschwindigkeit dieses Reaktionsfensters 0,47 - 1,2 m/s, was mit der Leitungsgeschwindigkeit der C-Fasern18 übereinstimmt.
Es gibt einen Anstieg der neuronalen Schwelle zwischen Tag 0 (377 μA, Abbildung 3A) und Tag 23 (1335 μA, Abbildung 3B), der im Laufe der Zeit auftritt, wahrscheinlich aufgrund einer geringfügigen gutartigen Fibrose, die sich um die Gewebe-Elektroden-Grenzflächebildet 10,15.
Abbildung 3C zeigte den Versuchsaufbau und die Positionierung des hinteren Anschlusses, der für die Dauer des 3-wöchigen Testzeitraums stabil blieb15.
Abbildung 1: Stellen für zervikale VNS und abdominale VNS. (A) Zervikale VNS wird oberhalb der Äste zum Herzen und zu den Atemwegen und unterhalb dieser Äste aufgetragen. (B) Das Elektrodenarray wird in eine Nadelkappe (mit entferntem Rand) eingeführt, um es während des Tunnelns unter der Haut zu schützen. (C) Das abdominale VNS-Array der Ratte wird implantiert und mit Nähten (D) über den Zöliakie- und Leberästen unterhalb des Zwerchfells gesichert. Abkürzungen: VN = Vagusnerv, b. = Ast. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ratten-VNS-Array. (A) Ein Ratten-VNS-Array besteht aus einem perkutanen Stecker und einem Elektrodenarray, das durch ein Anschlusskabel verbunden ist. (B) Eine Lasche in der Nähe des Elektrodenarrays kann an die Speiseröhre genäht werden, um die Position des Arrays zu stabilisieren. Das Standard-Array für den abdominalen Vagusnerv der Ratte wird mit zwei Elektrodenpaaren (E1 und E2 sowie E3 und E4) geliefert. Beide Elektrodenpaare können entweder zur Stimulation oder zur Aufnahme verwendet werden. Der perkutane Verbinder wird im Holzbereich des Tieres montiert, und der Anschlussdraht wird auf der linken Seite des Tieres unter die Haut getunnelt. Die Referenzelektrode entlang des Elektrodendrahts wird nach der Implantation des Elektrodenarrays unter der Haut auf der linken Seite des Tieres platziert. Das Elektrodenarray wird am Vagusnerv entlang der Speiseröhre oberhalb des Magens und direkt unter dem Zwerchfell implantiert. (C) Die zusätzliche Länge des Bleikabels auf der linken Seite des Tieres unter der Haut sorgt für Zugentlastung. Abkürzungen: E = Elektrode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Typische elektrophysiologische Spuren, die vom abdominalen Vagusnerv während der chronischen Implantation und einer Ratte unter VNS-Therapie aufgezeichnet wurden. (A) Jede elektrophysiologische Spur besteht aus durchschnittlich 25 Wiederholungen. Die grün schattierten Kästchen zeigen die typische Latenz der C-Faser-Antwort im abdominalen Vagusnerv der Ratte zwischen 4 ms und 10 ms (unter Verwendung eines Elektrodenarrays mit einem Abstand von 4,7 mm zwischen stimulierenden und aufzeichnenden Elektrodenpaaren, Mitte zu Mitte). ECAPs sind mit grünen Pfeilspitzen gekennzeichnet. (B) Eine Ratte, die eine VNS-Therapie über den perkutanen Konnektor auf dem Rücken im Heimkäfig erhält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reinigungslösung | Beschallungszeit |
| 1. 0,5% Pyroneg in Reinstwasser | 15 Minuten |
| 2. Reinstwasser | 5 Minuten |
| 3. Reinstwasser | 5 Minuten |
| 4. 96% Ethanol | 10 Minuten |
| 5. Reinstwasser | 5 Minuten |
| 6. Reinstwasser | 5 Minuten |
Tabelle 1: Beschallungsschritte. Die Tabelle enthält Details zu der hier durchgeführten Beschallung.
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Discussion
Diese Methode der abdominalen VNS-Implantation und der chronischen Stimulation des Vagusnervs und der Aufzeichnung von ECAPs wurde bei Ratten nach der Implantation 5 Wochen lang erfolgreich angewendet und gut vertragen 10,15,16. Das Zurückziehen von Magen, Leber und Darm, um eine gute Sicht auf die Speiseröhre und den Vagusnerv zu erhalten, ist einer der wichtigsten Schritte bei der Operation. Sobald diese Organe zurückgezogen sind, wird der Vagusnerv zugänglich. Das Zurückziehen des Magens birgt die Gefahr, dass die Atmung beeinträchtigt wird, in diesem Fall wird der Retraktor gelockert. Darüber hinaus sollte beim Durchtrennen des Bindegewebes, das die Speiseröhre umgibt, um Zugang zum Vagusnerv zu erhalten, darauf geachtet werden, dass das Zwerchfell nicht beschädigt wird, was zu einer Störung des intrathorakalen Drucks, einer schweren Atemunterdrückung und dem Tod des Tieres während der Operation führen kann. Es wird empfohlen, das Bindegewebe, das die Speiseröhre umgibt, gerade so weit zu entfernen, dass das Elektrodenarray über den Leber- und Zöliakieästen passt.
Mögliche postoperative Komplikationen sind Gewebeadhäsion um die Speiseröhre, Hernie und postoperativer Ileus. Die Gewebeadhäsion kann durch großzügige Anwendung von steriler Kochsalzlösung in der Bauchhöhle während der Operation und vor dem Schließen der Bauchhöhle minimiert werden. Die Naht, die die Peritoneumschicht zusammen mit der Muskelschicht verschließt, sollte auch dazu beitragen, die inneren Organe zu schützen und die Gewebeadhäsion zu verringern. Da die Leber leicht gequetscht wird und eine Manipulation des Darms zu einem postoperativen Ileus führen kann, ist ein minimaler und schonender Umgang mit diesen Organen wichtig. Schließlich ist es insbesondere bei schwereren Tieren wichtig, dass beim Schließen der Bauchhöhle laufende Nahtfäden dicht beieinander platziert werden oder stattdessen unterbrochene Nähte verwendet werden, um Hernien und das Vorspringen des Xyphoidfortsatzes zu verhindern.
Als Standardversorgung nach der Operation sollten die Tiere nach der Operation regelmäßig auf Anzeichen von Stuhlgang, Gewichtsveränderung, Fell, Aktivitätsniveau und Schwellungen oder Ausfluss aus den Operationswunden untersucht werden. In seltenen Fällen kann es zu übermäßigem Ausfluss, Rötung und Schwellung um Operationswunden kommen, was auf eine Infektion hindeutet. In solchen Fällen werden Antibiotika wie Baytril (0,2 mg/ml, 3-5 Tage im Trinkwasser) verabreicht, bis die Infektion abgeklungen ist. Während sich normale Ratten im Allgemeinen gut von der Operation erholen, benötigen Ratten mit beeinträchtigten Gesundheitszuständen (d. h. Krankheitsmodellen) möglicherweise mehr Zeit, bevor Tests und Stimulation nach der Operation beginnen können. Eine angemessene postoperative Versorgung (wie in Schritt 2.26 zusammengefasst) für solche Tiere ist für das Wohlergehen der Tiere unerlässlich.
Eine der Einschränkungen dieses Protokolls besteht darin, dass das Design des Ratten-VNS-Elektrodenarrays zwar hervorragend für die Aufzeichnung einer langsameren C-Faser-Reaktion geeignet ist, der Abstand zwischen den Elektrodenpaaren (4,7 mm) jedoch möglicherweise nicht für die Erfassung der Aktivität einiger der schnelleren Fasertypen geeignet ist. Obwohl die Gesamtlänge des Arrays durch die verfügbare Länge des subdiaphragmatischen Vagusnervs über dem Leber- und Zöliakieast begrenzt ist, können diese VNS-Arrays mit zusätzlichen Elektrodenpaaren erworben werden. Solche Arrays können verwendet werden, um die Anwendung von blockierender Stimulation zu untersuchen, die die Richtung von VNS 16,19 manipulieren kann, was die mögliche Verwendung dieses Modells erweitert.
Die Aufzeichnung von ECAPs kann verwendet werden, um die Platzierung des Arrays um den Nerv, die Qualität der Elektrodenschnittstelle und die Fähigkeit des Geräts, Vagusfasern zu aktivieren, zu beurteilen. Der Vagus ist ein autonomer Nerv, der zu 97%-99% aus C-Fasernbesteht 18,20, wobei die restlichen 1%-3% der Fasern myelinisierte Fasern sind (Funktion unbekannt), wie durch transmissionselektronenmikroskopische Studien bestätigtwurde 20. Die Reaktionen in Abbildung 3 sind wahrscheinlich eher auf eine elektrisch evozierte Aktivität des Vagusnervs als auf eine myogene Aktivität zurückzuführen, da sie der Form und Gestalt des zusammengesetzten Aktionspotentials für einen peripheren Nerventsprechen 21,22. Darüber hinaus beträgt die typische Leitungsgeschwindigkeit der ECAPs des abdominalen Vagusnervs der Ratte 0,47 - 1,2 m/s, was mit der Leitungsgeschwindigkeit der C-Fasernübereinstimmt 18. In ersten Pilotstudien zur Geräteentwicklung wurden die Aufzeichnungen in Studien an anästhesierten Ratten validiert, indem der Vagusnerv zwischen der stimulierenden und der aufzeichnenden Elektrode durchtrennt wurde, was zur Eliminierung aller evozierten Reaktionen führte (Daten nicht gezeigt). Das Elektrodenarray wurde so konzipiert, dass der Vagusnerv in einem Platin-Silikon-Kanal sitzt und ihn effektiv elektrisch von umgebenden Strukturstrukturen (z. B. der Speiseröhre) isoliert. Stimulation und Aufzeichnung werden ebenfalls mit bipolaren Konfigurationen unter Verwendung benachbarter Elektroden durchgeführt, wodurch die Möglichkeiten für die Ausbreitung der Stimulation und die Kontamination der Aufzeichnung weiter minimiert werden. Wir haben durchweg über ähnliche Wellenformen nach elektrischer Stimulation des abdominalen Vagusnervs in anästhesierten und wachen Präparaten berichtet 10,15,16,19,23, einschließlich Studien, in denen physiologische Effekte der Stimulation die Aktivierung des Vagusnervs bestätigten 10,15,16 . Obwohl es unmöglich ist, eine Kontamination der Aufzeichnung durch myogene Aktivität auszuschließen, unterscheiden sich myogene Antworten in der Regel von neuronalen Antworten aufgrund ihres schnellen und großen Wachstumsamplitudenprofils24 im Gegensatz zu den abgestuften, kleineren Wachstumsprofilen, die in unseren Studienbeobachtet wurden 10,15 und in Abbildung 3A,B: Tag 0: aktueller Pegel 377 μA Latenz: 7,24 ms > Strompegel 1750 μA: 6,74 ms.
Während sich die Aktivierung des subdiaphragmatischen Vagusnervs, der fast ausschließlich aus C-Fasern20,25 besteht, als wirksam für die Behandlung präklinischer Modelle von entzündlichen Darmerkrankungen10, rheumatoider Arthritis15 und Diabetes16 erwiesen hat, sind die optimalen abdominalen VNS-Parameter zur Maximierung seiner therapeutischen Wirkung nicht vollständig erforscht14. Weitere Forschung zu diesem Thema wäre von großem Nutzen, da die Anwendung von abdominalen VNS zur Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen derzeit in einer ersten klinischen Studie am Menschen untersucht wird. Da die entzündungshemmende Wirkung der abdominalen VNS als systemisch angesehen wird26, besteht ein großes Potenzial, dass diese Therapie auch bei anderen entzündlichen Erkrankungen wie systemischem Lupus erythematodes27 und chronischer Nierenerkrankung wirksam ist28.
Unsere Rattenstudien zeigen, dass abdominales VNS einen einzigartigen Vorteil gegenüber zervikalem VNS hat, da es keine kardialen oder respiratorischen Off-Target-Effekte verursacht10. Die Stimulation mit höherer Intensität kann über längere Zeiträume angewendet werden, ohne die Atmung oder die Herzfrequenz des Tieres zu beeinträchtigen. Gepaart mit der Fähigkeit, die evozierte neuronale Reaktion zu überwachen, die überschwellige Stimulationsintensitäten bestätigt, bietet diese Methode ein großartiges Modell, um die Wirksamkeit von abdominalen VNS bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten zu untersuchen. Da die Anwendung von VNS weiter zunimmt, wird erwartet, dass auch die Anwendung dieser Methode von VNS zunehmen wird.
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Disclosures
Diese Untersuchung wurde durchgeführt, ohne dass kommerzielle oder finanzielle Beziehungen bestanden, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Acknowledgments
Die Entwicklung des VNS-Implantats für den Bauch von Ratten wurde von der Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) BTO unter der Schirmherrschaft von Dr. Doug Weber und Dr. Eric Van Gieson über das Space and Naval Warfare Systems Center (Vertrag Nr. N66001-15-2-4060) finanziert. Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom Bionics Institute Incubation Fund unterstützt. Das Bionics Institute dankt für die Unterstützung, die es von der Regierung von Victoria durch sein Operational Infrastructural Support Program erhält. Wir danken Herrn Owen Burns für das mechanische Design, Prof. John B. Furness für die anatomische Expertise, Prof. Robert K. Shepherd für die Expertise in den Bereichen periphere Schnittstelle, Neuromodulation und Aufzeichnung, Frau Philippa Kammerer und Frau Amy Morley für die Tierhaltung und -tests, Frau Fenella Muntz und Dr. Peta Grigsby für ihre Beratung zur postoperativen Tierpflege und Frau Jenny Zhou und dem Elektrodenherstellungsteam von NeoBionica für die Herstellung der VNS-Arrays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Briemarpak | SC3050 | |
| Baytril | Bayer | ||
| Betadine | Sanofi-Aventis Healthcare | ||
| Buprelieve (Buprenorphine) | Jurox | ||
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6210 | |
| DietGel Boost (dietary gel supplement) | ClearH2O | ||
| Dumont tweezer, style 5 | ProSciTech | T05-822 | |
| Dumont tweezer, style N7, self-closing | ProSciTech | EMS72864-D | |
| Elmasonic P sonicator | Elma | ||
| Hartmann's solution | Baxter | AHB2323 | |
| Hemostat | ProSciTech | TS1322-140 | |
| HPMC/PAA Moisturising Eye Gel | Alcon | ||
| Igor Pro-8 software | Wavemetrics, Inc | ||
| Isoflo (Isoflurane) | Zoetis | ||
| Isolated differential amplifier | World Precision Instruments | ISO-80 | |
| Liquid pyroneg | Diversey | HH12291 | cleaning solution |
| Marcaine (Bupivacaine) | Aspen | ||
| Plastic drape | Multigate | 22-203 | |
| Rat vagus nerve implant | Neo-Bionica | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis | ||
| Silk suture 3-0 | Ethicon | ||
| Silk suture 7-0 | Ethicon | ||
| SteriClave autoclave | Cominox | 24S | |
| Sterile disposable surgical gown | Zebravet | DSG-S | |
| Suicide Nickel hooks | Jarvis Walker | ||
| Ultrapure water | Merck Millipre | Milli-Q Direct | |
| Underpads | Zebravet | UP10SM | |
| Vannas scissors | ProSciTech | EMS72933-01 | |
| Vicryl suture 4-0 | Ethicon |
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