Summary
Denne protokol beskriver den kirurgiske teknik til implantering af et elektrodearray på abdominalvagusnerven hos rotter sammen med metoder til kronisk elektrofysiologitest og stimulering ved hjælp af den implanterede enhed.
Abstract
Abdominal vagusnervestimulering (VNS) kan anvendes på den subdiaphragmatiske gren af vagusnerven hos rotter. På grund af sin anatomiske placering har den ingen respiratoriske og hjertemæssige virkninger, der ofte er forbundet med cervikal VNS. Manglen på respiratoriske og hjertemæssige virkninger uden for målet betyder, at intensiteten af stimulering ikke behøver at blive sænket for at reducere bivirkninger, der almindeligvis opleves under cervikal VNS. Få nyere undersøgelser viser de antiinflammatoriske virkninger af abdominal VNS i rottemodeller af inflammatorisk tarmsygdom, reumatoid arthritis og glykæmi reduktion i en rottemodel af type 2-diabetes. Rotte er en fantastisk model til at udforske potentialet i denne teknologi på grund af vagusnervens veletablerede anatomi, nervens store størrelse, der muliggør nem håndtering og tilgængeligheden af mange sygdomsmodeller. Her beskriver vi metoderne til rengøring og sterilisering af abdominal VNS-elektrodearray og kirurgisk protokol hos rotter. Vi beskriver også den teknologi, der kræves til bekræftelse af suprathreshold stimulering ved at registrere fremkaldte sammensatte aktionspotentialer. Abdominal VNS har potentialet til at tilbyde selektiv, effektiv behandling af en række tilstande, herunder inflammatoriske sygdomme, og applikationen forventes at udvide sig på samme måde som cervikal VNS.
Introduction
Vagusnervestimulering (VNS) leveret på livmoderhalsstedet i nakken er USA's Food and Drug Administration (FDA) -godkendte behandling af ildfast epilepsi, ildfast depression og post-iskæmisk slagtilfælderehabilitering 1 og Europa-Kommissionen godkendt til hjertesvigt i Europa2. Ikke-invasiv cervikal VNS er FDA-godkendt til migræne og hovedpine1. Dens anvendelse forventes at udvides, med nylige kliniske forsøg, der viser effekten af VNS i andre indikationer såsom Crohns sygdom3, reumatoid arthritis 4,5 og nedsat glukosetolerance og type 2-diabetes 6,7. Selvom det er lovende, kan cervikal VNS forårsage bradykardi og apnø på grund af aktivering uden for målet af nervefibrene, der inderverer lungerne og hjertet 8,9,10. Bivirkninger såsom hoste, smerter, stemmeændring, hovedpine og stigning i apnø-hypopnø-indeks er almindeligt rapporteret hos patienter, der får cervikal VNS11,12. Reduktion i stimuleringsstyrke er en almindelig strategi for at reducere disse bivirkninger, men reduceret ladning kan begrænse effekten af VNS-terapi ved ikke at aktivere terapeutiske fibre11. Til støtte for denne hypotese var responderraten for patienter, der fik højintensitetsstimulering til behandling af epilepsi, højere end for patienter, der fik stimulering med lav intensitet13.
Abdominal VNS påføres på den subdiaphragmatiske vagusnerve over lever- og cøliakigrene14 (figur 1). Vores tidligere undersøgelse viste, at abdominal VNS hos rotter ikke forårsager hjerte- eller åndedrætsbivirkninger forbundet med cervikal VNS10. Tidligere undersøgelser viser også antiinflammatoriske virkninger af abdominal VNS i en rottemodel af inflammatorisk tarmsygdom og reumatoid arthritis10,15 samt reduktion i glykæmi i en rottemodel af type 2-diabetes16. For nylig er abdominal VNS-teknologien blevet oversat til et første klinisk forsøg på mennesker til behandling af inflammatorisk tarmsygdom (NCT05469607).
Det perifere nerveelektrodearray, der bruges til at levere stimulering til abdominal vagusnerven (WO201909502017), er specialudviklet til brug hos rotter og består af to til tre platinelektrodepar placeret 4,7 mm fra hinanden, understøttet af en medicinsk silikone elastomermanchet, en sutureringsfane til at forankre arrayet til spiserøret, en blytråd og et perkutant stik, der skal monteres på lændehvirvelområdet (figur 2). Blytråden er tunneleret under huden på venstre side af dyret. Design af flere elektrodepar muliggør elektrisk stimulering af nerven samt registrering af elektrisk fremkaldte sammensatte aktionspotentialer (ECAP'er), hvilket bekræfter korrekt placering af implantatet på nerven og suprathreshold stimuleringsintensiteter. Abdominal VNS tolereres godt hos frit bevægelige rotter i måneder 10,15,16. Dette giver mulighed for vurdering af dets effektivitet på sygdomsmodeller.
Dette manuskript beskriver metoderne til elektrodearraysterilisering, abdominal vagusnerveimplantationskirurgi og kronisk stimulering og registrering af ECAP'er i vågne rotter til undersøgelse af effekten af abdominal VNS i en række sygdomsmodeller. Disse metoder blev oprindeligt udviklet til at studere effekten af abdominal VNS i rottemodellen for inflammatorisk tarmsygdom10 og er også med succes blevet brugt til en rottemodel af reumatoid arthritis15 og diabetes16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverede dyr, blev godkendt af Animal Ethics Committee of St. Vincent's Hospital (Melbourne) og overholdt den australske kodeks for pleje og brug af dyr til videnskabelige formål (National Health and Medical Research Council of Australia) og loven om forebyggelse af grusomhed mod dyr (1986). I alt blev 24 Dark Agouti hunrotter (8-9 uger gamle) anvendt til denne undersøgelse. De eksperimentelle grupper bestod af: en normal kohorte (n = 8), der ikke modtog kollageninjektion eller VNS-implantat; en ustimuleret sygdomskohorte (n = 8), der modtog et implantat og en kollageninjektion (ingen elektrofysiologiske tests udført); og en stimuleret sygdomskohorte (n = 8), der modtog et implantat, en kollageninjektion, elektrofysiologisk test og VNS-terapi. Implantationskirurgi fandt sted 5 dage før kollageninjektion, og tilvænning til VNS-behandling startede 4 dage efter kollageninjektion og forekom over 7 dage. VNS-behandling blev anvendt fra dag 11 til 17 (inklusive) efter kollageninjektion15. For den stimulerede sygdomskohorte blev elektrofysiologisk test udført umiddelbart efter implantationsoperationen under anæstesi, på dagen for kollageninjektion, 10 dage efter kollageninjektion og dagen for ophør (17 dage efter kollageninjektion).
1. Sonikering og sterilisering af elektrodearray
- Indstil ultralydsrenseren til en frekvens på 80 kHz og fyld ultralydstanken med ledningsvand. Nedsænk elektrodearrayet i rengøringsopløsningen i en ren plastbeholder og læg den i ultralydstanken.
BEMÆRK: Rengøringsopløsningen og sonikeringstiden, der skal bruges til hvert trin, er opsummeret i tabel 1. Brug en ren beholder til hvert trin. - Placer det sonikerede elektrodearray i en steriliseringspose ved hjælp af rene tang sonikeret med 0,5% flydende rengøringsopløsning i destilleret vand og skyllet i destilleret vand. Autoklave elektrodearrayet i 45 minutter med en maksimal temperatur på 130 °C, og lad det tørre på en ren bænk.
2. Implantation af elektrodearray på abdominal vagusnerven
BEMÆRK: I dette studie har vi brugt mørke agouti-hunrotter (8-9 uger)15. Vi har også med succes brugt denne protokol til kronisk implantering af voksne hanrotter af Sprague-Dawley (10-14 uger)10,16. Kirurgi udføres under aseptiske forhold, og alle instrumenter, elektrodearray og forbrugsvarer såsom gaze og bomuldsspidser steriliseres ved autoklavering.
- Bedøv rotten i et induktionskammer med 3% isofluran og 1 l/min ilt. Når der ikke er nogen pedalrefleks til tåklemning, skal du flytte rotten til varmemåtten med en termostat på operationsbordet og placere en isofluranmaske over næsen.
- Overvåg respirationsfrekvensen og rektaltemperaturen under hele operationen, og juster isofluranniveauet mellem 1,5% og 2,5% for at opretholde respirationsfrekvensen mellem 40 og 62 vejrtrækninger pr. Min. Juster varmemåttens indstilling, hvis det er nødvendigt, for at holde det rektale temperaturområde mellem 35,9 - 37,5 °C.
- Administrer analgesi præmedicinering subkutant ved hjælp af 1 ml sprøjter med 25G nåle (carprofen 5 mg/kg og buprenorphin 0,03 mg/kg subkutant) før operationens start.
- Barber generøst omkring snitstedet, herunder området langs den ventrale midterlinje fra xyphoid-processen til enden af ribbenburet, lændehvirvelaspektet af ryggen langs den dorsale midterlinje og venstre side af kroppen mellem forbenet og bagbenet for at tillade subkutan tunneling af arrayet.
- Rens de kirurgiske steder i en cirkulær bevægelse tre gange med skiftevis runder betadin og alkohol og læg et kirurgisk drapering over dyret. Administrer bupivacain (1-2 mg/kg) subkutant ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en 25G kanyle på de dorsale og ventrale snitsteder.
- Placer dyret i ventral liggende og lav et 2 cm langt snit på bagsiden, hvor den perkutane piedestal vil blive forankret ved hjælp af et skalpelblad.
- Drej rotten til dorsal liggende og lav et 3 cm snit på huden langs midterlinjen lige under xyphoid-processen ved hjælp af et skalpelblad. Hold huden op nær snitstedet, og brug dissekering saks til at dissekere hudlaget fra muskellaget omkring snittet.
- For at tillade subkutan tunneling af arrayet fra piedestal til implantationssted skal du placere dyret på sin højre side, indsætte en hemostat fra det ventrale snit og stump dissekere mod det dorsale snitsted. Skær kanten af en nålehætte af, og indsæt elektrodearrayet for at beskytte det under transport (figur 1B). Brug hænderne (brug sterile handsker) til at tunnelere elektrodearrayet under huden mod det ventrale snit.
- For at få adgang til spiserøret og vagusnerven skal du lægge dyret i dorsal liggende igen. Lav et 3 cm snit på muskellaget langs midterlinjen under xyphoid-processen, stort nok til at udsætte hele leverens længde. Undgå at beskadige leveren under dette trin.
- Lav et mindre snit (mindre end 1 cm) på muskellaget lateralt (venstre side af dyret) til det vigtigste ventrale snit. Tunnel elektrodearrayet gennem dette lille snit ved hjælp af nålehætten, der blev brugt i trin 2.8, til at indsætte arrayet i bughulen.
BEMÆRK: Dette trin reducerer spændingen på hovedsnitstedet og reducerer risikoen for, at suturer brister. - Træk huden og muskellagene tilbage for at holde bughulen åben. Sørg for at holde vævene fugtige ved hjælp af bomuldsspidser og gaze gennemblødt i sterilt saltvand til at håndtere vævet.
- Træk forsigtigt leveren tilbage ved at skære bindevævet omkring den ved hjælp af Vannas saks og placere en retraktor over et lille stykke gasbind gennemblødt i saltvand for beskyttelse. Træk forsigtigt maven tilbage for at tillade udretning af spiserøret og overliggende vagusnerve ved at placere en retraktor mellem spiserøret og maven.
BEMÆRK: Retraktorer laves ved at afrunde den spidse ende af fiskekroge. - Efter eksponering af spiserørets ventrale overflade skal du identificere abdominal vagusnerven og dens undergrene, herunder levernerven, cøliaki og to gastriske grene (figur 1D).
- Skær bindevævet, der fastgør mavevagusnerven til spiserøret ved hjælp af fine tang og Vannas-saks og disseker nervens længde fra lige over lever- og cøliakigrenene mod membranen. Sørg for ikke at rive, strække eller klemme nerven. Placer et elektrodearray ved siden af nerven for at bekræfte, at tilstrækkelig længde af nerven er adskilt fra bindevævet til at passe til arrayet.
- Når bindevæv var blevet ryddet rundt om nerven, skal du passere silkesuturerne (7-0) på elektrodesiden af arraymanchetten under nerven. Åbn manchetten på arrayet, og placer nerven forsigtigt i array-kanalen.
- Sørg for, at hele længden af nerven sidder inde i arraykanalen. Bind suturerne omkring manchetten sammen for sikkert at lukke manchetten for at sikre, at nerven ikke glider ud af kanalen. Trim suturerne.
- Brug 7-0 silkesutur til at sutur fanen på spiserøret for at sikre arrayet på plads og forhindre det i at vride sig. Undgå at beskadige de andre grene af vagusnerven eller indsætte nålen for dybt ind i spiserørets glatte muskel.
- Fjern forsigtigt retraktorer og sørg for, at alt gasbind er fjernet fra bughulen. Administrer 1-2 ml varmt sterilt saltvand ved hjælp af en 1 ml sprøjte i bughulen og omplacer leveren til den korrekte position.
- Luk muskellaget med 3-0 silkesutur ved hjælp af den enkle løbesuturteknik, og lav sikre firkantede knuder med mindst 3 kast i begge ender. Mellemrum sting tæt sammen (ca. 3 mm fra hinanden) for at forhindre komplikationer såsom brok / fremspring af xyphoid-processen.
- Brug sutur til at lukke snittet i bughinden sammen med snittet i muskellaget for at reducere risikoen for vævsadhæsion.
- Brug et absorberbart suturmateriale (Vicryl 4-0) til at lukke hudsnittet. Brug en nedgravet sutureringsteknik såsom den løbende nedgravede lodrette madrassutur eller den løbende nedgravede dermale sutur for at forhindre dyret i at fjerne suturen.
- Drej dyret til ventral liggende, og brug en saks, forlæng dorsalsnittet til 4-5 cm, og stump disseker mellem musklen og hudlaget yderligere, så forbindelsesbasen på det perkutane stik kan sidde fladt på muskellaget.
- Brug silke 3-0 sutur til at lave 6 til 8 enkle afbrudte suturer omkring forbindelsesbasen for at fastgøre den til muskellaget nedenunder. Luk hudsnittet med silke 3-0 sutur ved hjælp af den vandrette madrassuturteknik, og sørg for sikre firkantede knuder med mindst 3 kast.
BEMÆRK: I dette trin foretrækkes flettede silkesuturer for deres lette håndtering og deres evne til at skabe mere sikre knuder sammenlignet med monofilamentsuturer. - Efter operationens afslutning administreres Hartmanns opløsning subkutant (1 ml/100 g/time). Sluk for isofluranen, og lad dyret komme sig på en varmemåtte, mens det kører ilt (1,5 l/min). Når rotten er ved bevidsthed og fuldt mobil, skal du returnere rotten til sit hjemmebur, placeret på en varmepude, indtil den er helt genoprettet efter bedøvelse.
- Overhold nøje dyrets genopretning fra isofluran og sørg for, at dyret har adgang til mad og drikke. I løbet af de næste to dage skal du sørge for subkutan administration af postkirurgisk analgesi (carprofen 5 mg / kg dagligt) for at lindre smerter. Overvåg dyret mindst 2x om dagen og kontroller for tegn på afføring, pelsens kvalitet, aktivitetsniveau og tilstedeværelse af hævelse eller udflåd fra operationssårene.
- Dyrets rekordvægt, og i sjældne tilfælde taber dyret 10% eller mere, start intensiv behandling. Intensiv behandling omfatter subkutan administration af væsker (Hartmanns opløsning, 2x 10 ml) hver dag, tilførsel af ekstra mad såsom friske grøntsager og kosttilskud og placering af halvdelen af buret på en varmepude med termostat for ekstra varme. Forøg hyppigheden af overvågning, indtil dyret kommer sig. Fortsæt med administration af analgesi (carprofen 5 mg/kg, SQ, dagligt), hvis det er nødvendigt baseret på en Grimace skala.
3. Elektrofysiologisk testning
BEMÆRK: Registrering af fremkaldte sammensatte aktionspotentialer (ECAP'er) bekræfter passende placering af elektrodearrayet på vagusnerven. Derudover giver optagelse af ECAP'er ved hjælp af elektrodearrayet beskrevet ovenfor sandsynlig bekræftelse af elektrisk aktivering af vagale C-fibre og suprathreshold VNS10,15.
- Måling af elektrodernes fælles grundimpedans for at vurdere deres integritet og detektere eventuelle åbne eller kortslutninger af ledninger inden registrering af ECAP'er. Fungerende abdominal vagusnerveelektroder in vivo skal have impedansværdier mellem 4 - 20 kΩ.
- Test dyr under bedøvelse, dvs. umiddelbart efter operationen, eller vågen og frit bevægende. Udfør vågen test mindst 2-3 dage efter operationen for at give mulighed for, at de kirurgiske hudsår heler og stabiliseres. Saml det nødvendige udstyr til impedans og elektrofysiologisk testning, som omfatter en specialfremstillet stimulator, en dataindsamlingsenhed, en isoleret differentiel forstærker og en dataindsamlings- og analysesoftware som anført i materialetabellen.
- Sæt dyret i et håndklæde, hvis det kræves, tilslut et kabel til det bageste perkutane stik, og tilslut den anden ende af kablet til en stimulator. For at teste elektrodernes fælles jordimpedans skal du anvende bifasiske strømimpulser (100 μs pr. Fase og strøm på 107 μA) mellem elektroden af interesse og alle andre elektroder på arrayet.
- Mål spidsspændingen i slutningen af den første fase af spændingsbølgeformen (Vtotal) og beregn total impedans (Ztotal) ved hjælp af Ohms lov (Z = spænding / strøm).
- Der tilsluttes et par elektroder til stimulatoren og et par elektroder til optageapparatet, og der anvendes bipolar stimulering til at generere ECAP'er ved hjælp af VNS-implantatets referenceelektrode placeret under huden som reference for differentiel registrering af ECAP'er. Lav to sæt optagelser i gennemsnit fra i alt 50 gentagelser ved hjælp af dataindsamlings- og analysesoftwaren.
- Brug følgende indstillinger til målinger.
Strømme: 0 til 2 mA i trin på 0,1 mA;
Pulsbredde: 25 - 200 μs;
Interfase mellemrum: 8 - 50 μs;
Stimuleringshastighed: 10 - 30 impulser/s;
Samplinghastighed: 100 kHz;
Filter: Højpas 200 Hz, lavpas 2000 Hz, spændingsforstærkning 1 x 102. - Brug dataanalysesoftwaren til at analysere ECAP-responsen ved at måle spidsspændingen mellem bølgeformerne i analysevinduet (4 - 10 ms efter stimulus, angivet med skygge i figur 3A, B). ECAP-tærsklen defineres som den mindste stimulusstrømintensitet, der producerer en responsamplitude på mindst 0,1 μVpeak-peak i begge sæt gennemsnitlige elektrofysiologiske optagelser. Et gyldigt svar gentages for mindst to aktuelle niveauer over tærsklen og ikke til stede for mindst to aktuelle niveauer under tærsklen10,15.
4. Kronisk abdominal VNS hos vågne rotter
BEMÆRK: Abdominal VNS kan anvendes til vågne dyr, når operationssåret omkring det perkutane stik er helet og stabiliseret. For at reducere stressrespons og muliggøre bedre dataindsamling vænnes dyrene til testernes håndterings- og stimuleringsmiljø en time om dagen over syv dage før implantationsoperationen og påbegyndelsen af VNS-behandlingen.
- Mål impedansen for hver elektrode som beskrevet i trin 3.4, før der anvendes VNS. Sørg for, at impedansen af stimulerende elektroder er under 20 kΩ.
- Tilslut et kabel til det bageste perkutane stik, og tilslut den anden ende af kablet til en stimulator, der er programmeret til at anvende passende stimulering (f.eks. 27 Hz, 1,6 mA, 200 μs pulsbredde med 50 μs interfaseafstand, 30 s ON, 2,5 min off15), og tænd stimulatoren.
BEMÆRK: Selvom dyr ofte observeres at falde i søvn under stimulering, hvis de er vant til det, skal du bruge et kabel med beskyttende ydre materiale såsom stålspoler, hvor det er muligt for at forhindre, at det tygges. - Observer dyret i starten af hver VNS-behandlingssession for at sikre, at der ikke er nogen bivirkning såsom overdreven pelspleje eller pludselig stigning/fald i aktivitetsniveauet synkroniseret med tidspunktet for stimulering.
- Overvåg hvert 30. minut for at kontrollere, om kablet vrides eller frakobles. Hvis du vil anvende VNS kronisk (f.eks. 3 timer om dagen over 7 dage15), skal du gentage trin 4.1-4.3 i starten af hver session.
BEMÆRK: Brug af en kommutator kan reducere risikoen for, at kabler bliver vredet og kan kræve mindre hyppig overvågning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Registrering af fremkaldte sammensatte aktionspotentialer (ECAP'er, figur 3A, B) umiddelbart efter operationen er en teknik, der kan bruges til at bekræfte korrekt placering af nerven i array-kanalen, og at stimulering er effektiv til at aktivere vagusnerven.
I figur 3 blev hunrotter med mørk agouti (8-9 uger) implanteret med VNS-elektrodearrayet. Hos rotter, der var tilfældigt udvalgt til at modtage terapeutisk stimulation, blev ECAP'er registreret umiddelbart efter operationen (dag 0, figur 3A) og ved afslutningen af VNS-behandlingssessionen (dag 23, figur 3B). Tilstedeværelsen af ECAP'er (figur 3B) indikerede, at stimuleringsintensiteten var over neurale tærskler, og at nerven blev aktiveret med succes. Dyr i VNS-behandlingsgruppen blev ekskluderet, hvis ECAP'er ikke blev registreret, da der ikke var nogen garanti for, at stimulering blev leveret med succes15. Latenstiden for det neurale respons (figur 3A, B, angivet med grøn pil) kan bruges til at vurdere, hvilken klasse af fibre der blev aktiveret.
I tidligere undersøgelser har vi observeret, at de fleste neurale reaktioner typisk forekommer mellem 4 ms og 10 ms 10,15. I betragtning af afstanden mellem stimulerende og optagepar er 4,7 mm, er den omtrentlige ledningshastighed for dette responsvindue 0,47 - 1,2 m / s, hvilket er i overensstemmelse med ledningshastigheden for C-fibre18.
Der er en stigning i neurale tærskler mellem dag 0 (377 μA, figur 3A) og dag 23 (1335 μA, figur 3B), som forekommer over tid, sandsynligvis på grund af mindre godartet fibrose, der dannes omkring vævselektrodegrænsefladen10,15.
Figur 3C angav den eksperimentelle testopsætning og placeringen af back-konnektoren, som forblev stabil i hele 3 ugers testperiode15.
Figur 1: Steder for cervikal VNS og abdominal VNS. (A) Cervikal VNS påføres over grenene til hjertet og luftvejene, og abdominal VNS påføres under disse grene. (B) Elektrodearrayet indsættes i en nålehætte (med kanten fjernet) for at beskytte den under tunneling under huden. (C) Rotte abdominal VNS array er implanteret og sikret med suturer (D) over cøliaki og levergrene under membranen. Forkortelser: VN = vagusnerve, b. = gren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Rotte VNS-array. (A) Et rotte-VNS-array består af et perkutant stik og et elektrodearray, der er forbundet med blytråd. (B) En fane nær elektrodearrayet kan sutureres til spiserøret for at hjælpe med at stabilisere arrayets position. Standard rotte abdominal vagus nerve array leveres med to elektrodepar (E1 og E2, og E3 og E4). Begge elektrodepar kan bruges til enten stimulering eller optagelse. Det perkutane stik er monteret på dyrets tømmerområde, og blytråden er tunneleret under huden på venstre side af dyret. Referenceelektroden langs blytråden placeres under huden på venstre side af dyret, når elektrodearrayet er implanteret. Elektrodearrayet implanteres på vagusnerven langs spiserøret over maven og lige under membranen. C) Den ekstra længde af blytråden på venstre side af dyret under huden giver trækaflastning. Forkortelser: E = elektrode. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Typiske elektrofysiologiske spor registreret fra abdominal vagusnerve under kronisk implantation og en rotte, der modtager VNS-behandling. (A) Hvert elektrofysiologispor er i gennemsnit 25 gentagelser. De grønne skraverede bokse angiver den typiske latenstid for C-fiberrespons i rottens abdominale vagusnerve, mellem 4 ms og 10 ms (ved hjælp af et elektrodearray med afstand på 4,7 mm mellem stimulerende og registrerende elektrodepar, center til center). ECAP'er er mærket med grønne pilespidser. B) En rotte, der får VNS-behandling via det perkutane stik på ryggen i hjemmeburet. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Rengøringsopløsning | Sonikering tid |
| 1. 0,5% pyroneg i ultrarent vand | 15 minutter |
| 2. Ultrarent vand | 5 minutter |
| 3. Ultrarent vand | 5 minutter |
| 4. 96% ethanol | 10 minutter |
| 5. Ultrarent vand | 5 minutter |
| 6. Ultrarent vand | 5 minutter |
Tabel 1: Sonikering trin. Tabellen indeholder detaljer om sonikering udført her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode til abdominal VNS-implantatkirurgi og kronisk stimulering af vagusnerven og registrering af ECAP'er er blevet anvendt med succes og tolereret godt i 5 uger hos rotter efter implantation 10,15,16. Tilbagetrækning af mave, lever og tarm for at få et godt overblik over spiserøret og vagusnerven er et af de vigtigste trin i operationen. Når disse organer er trukket tilbage, bliver vagusnerven tilgængelig. Tilbagetrækning af maven risikerer at kompromittere vejrtrækningen, i hvilket tilfælde tilbagetrækningen løsnes. Derudover skal man sørge for at undgå beskadigelse af membranen, når bindevævet omkring spiserøret skæres for at få adgang til vagusnerven, hvilket kan føre til forstyrrelse i intrathoraxtrykket, alvorlig åndedrætsundertrykkelse og dyrets død under operationen. Det anbefales, at bindevævet omkring spiserøret ryddes lige nok til at passe elektrodearrayet over lever- og cøliakigrenene.
Mulige postkirurgiske komplikationer omfatter vævsadhæsion omkring spiserøret, brok og postoperativ ileus. Vævsadhæsion kan minimeres ved liberal anvendelse af sterilt saltvand i bughulen under operationen og inden lukning af bughulen. Suturlukning af bughindelaget sammen med muskellaget skal også hjælpe med at beskytte de indre organer og reducere vævsadhæsion. Da leveren let får blå mærker, og manipulation af tarmen kan forårsage postoperativ ileus, er minimal og skånsom håndtering af disse organer vigtig. Endelig, især hos tungere dyr, er det afgørende, at løbende sutursømme placeres tæt sammen, eller at afbrudte suturer i stedet anvendes, når bughulen lukkes for at forhindre brok og xyphoid-procesfremspring.
Som standard postoperativ pleje bør dyrene kontrolleres regelmæssigt efter operationen for tegn på afføring, vægtændring, pels, aktivitetsniveau og tilstedeværelse af hævelse eller udflåd fra operationssårene. I sjældne tilfælde kan der forekomme overdreven udflåd, rødme og hævelse omkring kirurgiske sår, hvilket tyder på infektion. Ved sådanne lejligheder administreres antibiotika såsom Baytril (0,2 mg / ml i drikkevand i 3-5 dage), indtil infektionen er forsvundet. Mens normale rotter generelt kommer sig godt efter operationen, kan rotter med kompromitterede sundhedsmæssige forhold (dvs. sygdomsmodeller) kræve mere tid, før test og stimulering kan begynde efter operationen. Passende postoperativ pleje (som opsummeret i trin 2.26) for sådanne dyr er afgørende for dyrenes velfærd.
En af begrænsningerne ved denne protokol er, at mens designet af rotte VNS-elektrodearrayet er fremragende til optagelse af langsommere C-fiberrespons, er afstanden mellem elektrodeparrene (4,7 mm) muligvis ikke egnet til at fange aktivitet af nogle af de hurtigere fibertyper. Selvom den samlede længde af arrayet er begrænset af den tilgængelige længde af den subdiaphragmatiske vagusnerve over lever- og cøliakigrenene, kan disse VNS-arrays købes med yderligere elektrodepar. Sådanne arrays kan bruges til at udforske anvendelsen af blokerende stimulering, der kan manipulere retningen af VNS16,19, hvilket udvider den mulige anvendelse af denne model.
Optagelse af ECAP'er kan bruges til at vurdere placeringen af arrayet omkring nerven, kvaliteten af elektrodegrænsefladen og enhedens evne til at aktivere vagalfibre. Vagus er en autonom nerve, der består af 97% -99% C-fibre18,20, hvor de resterende 1% -3% af fibrene er myelinerede fibre (funktion ukendt), som bekræftet af transmissionselektronmikroskopiundersøgelser20. Reaktionerne i figur 3 er sandsynligvis fra elektrisk fremkaldt aktivitet af vagusnerven, snarere end myogen aktivitet, da de passer til formen og formen af det sammensatte aktionspotentiale for en perifer nerve21,22. Desuden er den typiske ledningshastighed for rottens abdominale vagusnerve-ECAP'er 0,47 - 1,2 m / s, hvilket er i overensstemmelse med ledningshastigheden for C-fibre18. I indledende pilotundersøgelser af enhedsudvikling blev optagelserne valideret i bedøvede rotteundersøgelser ved at skære vagusnerven mellem stimulerings- og optageelektroden, hvilket resulterede i eliminering af eventuelle fremkaldte reaktioner (data ikke vist). Elektrodearrayet er designet således, at vagusnerven sidder i en platin-silikonekanal, hvilket effektivt isolerer den elektrisk fra omgivende strukturstrukturer (f.eks. Spiserøret). Stimulering og optagelse udføres også begge ved hjælp af bipolære konfigurationer ved hjælp af tilstødende elektroder, hvilket yderligere minimerer mulighederne for spredning af stimulering og kontaminering af optagelsen. Vi har konsekvent rapporteret lignende bølgeformer efter elektrisk stimulering af abdominal vagusnerven i bedøvede og vågne præparater 10,15,16,19,23, herunder undersøgelser, hvor fysiologiske virkninger af stimulering bekræftede vagal nerveaktivering 10,15,16. Selvom det er umuligt at udelukke kontaminering af registreringen ved myogen aktivitet, kan myogene reaktioner normalt skelnes fra neurale responser på grund af deres hurtige og store vækstamplitudeprofil24 i modsætning til de graduerede, mindre vækstprofiler, der blev observeret i vores undersøgelser10,15 og i figur 3A, B: Dag 0: nuværende niveau 377 μA latenstid: 7,24 ms > nuværende niveau 1750 μA: 6,74 ms.
Mens aktiveringen af den subdiaphragmatiske vagusnerve, som næsten udelukkende består af C-fibre20,25, har vist sig at være effektiv til behandling af prækliniske modeller af inflammatorisk tarmsygdom10, reumatoid arthritis15 og diabetes16, er de optimale abdominale VNS-parametre for at maksimere dens terapeutiske virkning ikke blevet undersøgt fuldt ud14. Yderligere forskning om dette emne ville være til stor gavn, da anvendelse af abdominal VNS til behandling af inflammatorisk tarmsygdom i øjeblikket undersøges i et første klinisk forsøg på mennesker. Da den antiinflammatoriske virkning af abdominal VNS anses for at være systemisk26, er der et stort potentiale for, at denne terapi også er effektiv til andre inflammatoriske tilstande såsom systemisk lupus erythematosus27 og kronisk nyresygdom28.
Vores rotteundersøgelser viser, at abdominal VNS har en unik fordel i forhold til cervikal VNS, idet det ikke forårsager hjerte- eller åndedrætsvirkninger uden for målet10. Stimulering med højere intensitet kan anvendes i længere perioder uden at gå på kompromis med åndedrættet eller dyrets hjertefrekvens. Parret med evnen til at overvåge det fremkaldte neurale respons, der bekræfter suprathreshold stimuleringsintensiteter, giver denne metode en god model til at studere effektiviteten af abdominal VNS til behandling af en række sygdomme. Da anvendelsen af VNS fortsætter med at udvide, forventes anvendelsen af denne VNS-metode også at blive udvidet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denne forskning blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Udviklingen af VNS-implantatet til rotter blev finansieret af Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) BTO under ledelse af Dr. Doug Weber og Dr. Eric Van Gieson gennem Space and Naval Warfare Systems Center (kontrakt nr. N66001-15-2-4060). Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af Bionics Institute Incubation Fund. Bionics Institute anerkender den støtte, de modtager fra den victorianske regering gennem sit operationelle infrastrukturstøtteprogram. Vi vil gerne takke Mr. Owen Burns for mekanisk design, Prof. John B Furness for anatomisk ekspertise, Prof. Robert K Shepherd for perifer grænseflade, neuromodulation og registrering ekspertise, Philippa Kammerer og Ms. Amy Morley for husdyrhold og testning, fru Fenella Muntz og Dr. Peta Grigsby for deres råd om postoperativ dyrepleje, og fru Jenny Zhou og elektrode fabrikation team fra NeoBionica for produktion af VNS arrays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Briemarpak | SC3050 | |
| Baytril | Bayer | ||
| Betadine | Sanofi-Aventis Healthcare | ||
| Buprelieve (Buprenorphine) | Jurox | ||
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6210 | |
| DietGel Boost (dietary gel supplement) | ClearH2O | ||
| Dumont tweezer, style 5 | ProSciTech | T05-822 | |
| Dumont tweezer, style N7, self-closing | ProSciTech | EMS72864-D | |
| Elmasonic P sonicator | Elma | ||
| Hartmann's solution | Baxter | AHB2323 | |
| Hemostat | ProSciTech | TS1322-140 | |
| HPMC/PAA Moisturising Eye Gel | Alcon | ||
| Igor Pro-8 software | Wavemetrics, Inc | ||
| Isoflo (Isoflurane) | Zoetis | ||
| Isolated differential amplifier | World Precision Instruments | ISO-80 | |
| Liquid pyroneg | Diversey | HH12291 | cleaning solution |
| Marcaine (Bupivacaine) | Aspen | ||
| Plastic drape | Multigate | 22-203 | |
| Rat vagus nerve implant | Neo-Bionica | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis | ||
| Silk suture 3-0 | Ethicon | ||
| Silk suture 7-0 | Ethicon | ||
| SteriClave autoclave | Cominox | 24S | |
| Sterile disposable surgical gown | Zebravet | DSG-S | |
| Suicide Nickel hooks | Jarvis Walker | ||
| Ultrapure water | Merck Millipre | Milli-Q Direct | |
| Underpads | Zebravet | UP10SM | |
| Vannas scissors | ProSciTech | EMS72933-01 | |
| Vicryl suture 4-0 | Ethicon |
References
- Fang, Y. T., et al. Neuroimmunomodulation of vagus nerve stimulation and the therapeutic implications. Front Aging Neurosci. 15, 1173987 (2023).
- Fudim, M., et al. Device therapy in chronic heart failure: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 78 (9), 931-956 (2021).
- Sinniger, V., et al. A 12-month pilot study outcomes of vagus nerve stimulation in Crohn's disease. Neurogastroenterol Motil. 32 (10), 13911 (2020).
- Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation in patients with rheumatoid arthritis: 24 month safety and efficacy. Arthritis Rheumatol. 70, (2018).
- Genovese, M. C., et al. Safety and efficacy of neurostimulation with a miniaturised vagus nerve stimulation device in patients with multidrug-refractory rheumatoid arthritis: a two-stage multicentre, randomised pilot study. Lancet Rheumatol. 2 (9), e527-e538 (2020).
- Lu, J. Y., et al. A randomized trial on the effect of transcutaneous electrical nerve stimulator on glycemic control in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 13 (1), 2662 (2023).
- Huang, F., et al. Effect of transcutaneous auricular vagus nerve stimulation on impaired glucose tolerance: a pilot randomized study. BMC Complement Altern Med. 14, 203 (2014).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- McAllen, R. M., Shafton, A. D., Bratton, B. O., Trevaks, D., Furness, J. B. Calibration of thresholds for functional engagement of vagal A, B and C fiber groups in vivo. Bioelectron Med (Lond). 1 (1), 21-27 (2018).
- Payne, S. C., et al. Anti-inflammatory effects of abdominal vagus nerve stimulation on experimental intestinal inflammation). Front Neurosci. 13, 418 (2019).
- Ben-Menachem, E., Revesz, D., Simon, B. J., Silberstein, S. Surgically implanted and non-invasive vagus nerve stimulation: a review of efficacy, safety and tolerability. Eur J Neurol. 22 (9), 1260-1268 (2015).
- Parhizgar, F., Nugent, K., Raj, R. Obstructive sleep apnea and respiratory complications associated with vagus nerve stimulators. J Clin Sleep Med. 7 (4), 401-407 (2011).
- Mao, H., Chen, Y., Ge, Q., Ye, L., Cheng, H. S. hort- and long-term response of vagus nerve stimulation therapy in drug-resistant epilepsy: A systematic review and meta-analysis. Neuromodulation. 25 (3), 327-342 (2022).
- Payne, S. C., Furness, J. B., Stebbing, M. J. Bioelectric neuromodulation for gastrointestinal disorders: effectiveness and mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 89-105 (2019).
- Payne, S. C., Romas, E., Hyakumura, T., Muntz, F., Fallon, J. B. Abdominal vagus nerve stimulation alleviates collagen-induced arthritis in rats. Front Neurosci. 16, 1012133 (2022).
- Payne, S. C., et al. Blood glucose modulation and safety of efferent vagus nerve stimulation in a type 2 diabetic rat model. Physiol Rep. 10 (8), 15257 (2022).
- Shepherd, R. K., Fallon, J. B., Payne, S. C., Burns, O., Furness, J. B. Peripheral nerve electrode array. US patent. , US-2020230400-A1 (2019).
- Castoro, M. A., et al. Excitation properties of the right cervical vagus nerve in adult dogs. Exp Neurol. 227 (1), 62-68 (2011).
- Payne, S. C., et al. Differential effects of vagus nerve stimulation strategies on glycemia and pancreatic secretions. Physiol Rep. 8 (11), 14479 (2020).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anat Embryol (Berl). 181 (2), 101-115 (1990).
- Gasser, H. S., Erlanger, J. The role played by the sizes of the constituent fibers of a nerve trunk in determining the form of its action potential wave. Am J Physiol-Legacy Content. 80 (3), 522-547 (1927).
- Parker, J. L., Shariati, N. H., Karantonis, D. M. Electrically evoked compound action potential recording in peripheral nerves. Bioelectron Med. 1 (1), 71-83 (2018).
- Villalobos, J., et al. Stimulation parameters for directional vagus nerve stimulation. Bioelectron Med. 9 (1), 16 (2023).
- Verma, N., et al. Characterization and applications of evoked responses during epidural electrical stimulation. Bioelectron Med. 9 (1), 5 (2023).
- Hoffman, H. H., Schnitzlein, H. N. The numbers of nerve fibers in the vagus nerve of man. Anat Rec. 139, 429-435 (1961).
- Bassi, G. S., et al. Anatomical and clinical implications of vagal modulation of the spleen. Neurosci Biobehav Rev. 112, 363-373 (2020).
- Courties, A., Berenbaum, F., Sellam, J. Vagus nerve stimulation in musculoskeletal diseases. Joint Bone Spine. 88 (3), 105149 (2021).
- Hilderman, M., Bruchfeld, A. The cholinergic anti-inflammatory pathway in chronic kidney disease-review and vagus nerve stimulation clinical pilot study. Nephrol Dial Transplant. 35 (11), 1840-1852 (2020).
