Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måling av dynamiske glykosomale pH-endringer i levende trypanosoma brucei

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66279
Automatic Translation
*1, *2,3, 1, 2,3, 2,4, 1, 2
1Department Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, 2Eukaryotic Pathogens Innovation Center, Clemson University, 3Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University, 4Department of Physics and Astronomy, Clemson University
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en metode for å studere hvordan pH reagerer på miljømessige signaler i glykosomene i blodet form av afrikanske trypanosomer. Denne tilnærmingen involverer en pH-sensitiv arvelig proteinsensor i kombinasjon med flowcytometri for å måle pH-dynamikk, både som en tidskursanalyse og i et skjermformat med høy gjennomstrømning.

Abstract

Glukosemetabolismen er kritisk for det afrikanske trypanosomet, Trypanosoma brucei, som en viktig metabolsk prosess og regulator av parasittutvikling. Lite er kjent om de cellulære responsene som genereres når miljøglukosenivåene endres. I både blodbanen og prosyklisk form (insektstadium) parasitter huser glykosomer det meste av glykolyse. Disse organellene surgjøres raskt som respons på glukosemangel, noe som sannsynligvis resulterer i allosterisk regulering av glykolytiske enzymer som heksokinase. I tidligere arbeid var lokalisering av den kjemiske sonden som ble brukt til å gjøre pH-målinger utfordrende, noe som begrenset bruken i andre applikasjoner.

Denne artikkelen beskriver utvikling og bruk av parasitter som uttrykker glykosomalt lokalisert pHluorin2, en arvelig protein pH-biosensor. pHluorin2 er en ratiometrisk pHluorin-variant som viser en pH (syre)-avhengig reduksjon i eksitasjon ved 395 nm samtidig som den gir en økning i eksitasjon ved 475 nm. Transgene parasitter ble generert ved kloning av den åpne leserammen pHluorin2 i trypanosomuttrykksvektoren pLEW100v5, noe som muliggjorde induserbart proteinuttrykk i begge livssyklusstadiene. Immunfluorescens ble brukt til å bekrefte den glykosomale lokaliseringen av pHluorin2-biosensoren, og sammenlignet lokaliseringen av biosensoren med det glykosomale residente proteinaldolasen. Sensorresponsen ble kalibrert ved forskjellige pH-nivåer ved å inkubere celler i en serie buffere som varierte i pH fra 4 til 8, en tilnærming vi tidligere har brukt til å kalibrere en fluoresceinbasert pH-sensor. Vi målte deretter pHluorin2-fluorescens ved 405 nm og 488 nm ved hjelp av flowcytometri for å bestemme glykosomal pH. Vi validerte ytelsen til de levende transgene pHluorin2-uttrykkende parasittene, og overvåket pH over tid som respons på glukosemangel, en kjent utløser av glykosomal surgjøring i PF-parasitter. Dette verktøyet har en rekke potensielle applikasjoner, inkludert potensielt brukt i narkotikascreening med høy gjennomstrømning. Utover glykosomal pH kan sensoren tilpasses andre organeller eller brukes i andre trypanosomatider for å forstå pH-dynamikk i levende celleinnstilling.

Introduction

Parasittiske kinetoplastider, som de fleste levende organismer, stole på glukose som en grunnleggende komponent i sentral karbonmetabolisme. Denne gruppen inkluderer medisinsk viktige organismer, som det afrikanske trypanosomet, Trypanosoma brucei; det amerikanske trypanosomet, T. cruzi; og parasitter av slekten Leishmania. Glukosemetabolismen er kritisk for parasittvekst i de patogene livssyklusstadiene. For eksempel, når det blir fratatt glukose, dør blodomløpsformen (BSF) av det afrikanske trypanosomet raskt. Spesielt tjener glykolyse som den eneste kilden til ATP i dette infeksjonsstadiet1. Leishmania-parasitter er også avhengige av glukose i den menneskelige verten, med amastigotisk livssyklusstadium som ligger i vertsmakrofager som er avhengige av denne karbonkilden for vekst2.

Mens disse parasittene har forskjellige livsstiler som involverer forskjellige insektvektorer, deler de mange fellestrekk i hvordan de reagerer på og forbruker glukose. For eksempel lokaliserer disse parasittene de fleste glykolytiske enzymer i modifiserte peroksisomer kalt glykosomer. Denne kinetoplastidspesifikke organellen er relatert til pattedyrperoksisomer basert på konserverte biosyntetiske mekanismer og morfologi 3,4,5,6.

Oppdelingen av de fleste glykolytiske veienzymer i glykosomet tilbyr parasittspesifikke midler for regulering av banen. Ved hjelp av en kjemisk pH-sonde fastslo vi at næringsmangel utløser en rask forsuring av prosyklisk form (PF) parasittglykosomer som resulterer i endret glykolytisk enzymaktivitet gjennom eksponering av et allosterisk regulatorbindingssted på nøkkelglykolytisk enzym heksokinase 7,8. I vårt tidligere arbeid krevde kjemikaliesonden konstant levering for bruk, noe som begrenset bruken i andre applikasjoner. I tillegg begrenset utfordringer med å opprettholde sondefordelingen i glykosomet i BSF nytten av tilnærmingen for å undersøke glykosomal pH i det livsstadiet.

I denne studien har vi brukt fluorescerende protein biosensor pHluorin2 for å overvåke glykosomal pH-endring i BSF T. brucei som respons på miljømessige signaler, inkludert glukose sult9 (figur 1). Resultater fra dette arbeidet tyder på at BSF T. brucei syrer glykosomer raskt som respons på sult på en reversibel måte, lik responser vi har observert i PF-parasitter. Vi forventer at denne biosensoren vil forbedre vår forståelse av glykolytisk regulering i T. brucei og relaterte parasitter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bruk av T. brucei brucei 90-13 BSF trypanosomer, en monomorf parasittlinje, krever vurdering av sikkerhet da de betraktes som risikogruppe 2-organismer som skal håndteres i biosikkerhetsnivå 2-anlegg.

1. Trypanosom kultur og transfeksjon

  1. Kultur T. brucei brucei 90-13 BSF trypanosomer i HMI-9 medium supplert med 10% varmeinaktivert FBS og 10% Nu-Serum ved 37 ° C i 5% CO210.
    MERK: For å holde kulturen sunn, oppretthold celletettheten mellom 2 × 104 og 5 × 106 celler / ml.
  2. Kloning av pHluorin2-PTS1 til pLEW100v5
    1. Syntetiser pHluorin2 åpen leseramme kommersielt for å gi genet med en 3'-forlengelse som koder for en to glycinlinker etterfulgt av tripeptidet AKL, en PTS1-lokaliseringskode.
    2. Klon denne konstruksjonen inn i den induserbare trypanosomuttrykksvektoren pLEW100v5 ved restriksjonsfordøyelse. Fordøy både kloningsvektoren som inneholder pHluorin2-PTS1 og pLEW100v5 ved bruk av HindIII og BamHI11. Utfør et oppryddingstrinn, helst ved agarosegelrensing, for å fjerne restriksjonsenzymer, den uønskede kloningsvektorryggraden og det utskårne luciferase-genholdige fragmentet.
    3. Liger pHluorin2-bærende innsats i fordøyd pLEW100v5 med T4 DNA Ligase12. (se tilleggsfigur S1 for skjema for kloning).
  3. Sekvenser plasmidet ved neste generasjons hel-plasmidsekvensering for å verifisere at innsatsen og vektoren er ligert korrekt og at ingen mutasjoner blir introdusert i pHluorin2-PTS1-genet under kloningsprosessen.
    MERK: Den komplette plasmidsekvensen er sendt til Addgene.org og har blitt tildelt #83680.
  4. Linearisere 20 μg av plasmidet ved å fordøye med 40 enheter NotI; deretter transfekt til BSF 90-13 parasitter via nukleofeksjon ved hjelp av det refererte humane T-cellesettet (se materialtabellen). Velg for stabil integrasjon som beskrevet av Burkard et al.13.

2. Immunfluorescens samlokalisering av pHlourin2-PTS1

  1. Forbered mikroskopiske lysbilder ved å behandle dem med poly-L-lysin 0,1% (w / v) i H2O i 10 minutter. Etter fjerning av poly-L-lysinoppløsningen, vask lysbildet en gang med PBS.
  2. For å indusere pHluorin2-PTS1-ekspresjon, behandle celler ved 2 × 105 celler / ml med tetracyklin eller doksycyklin (1 μg / ml) 24 timer før høsting. Pellet 2 × 106 foreldre og induserte pLEWpHluorin2-PTS1 (pHL) parasitter ved sentrifugering (romtemperatur [RT], 10 min, 1000 × g) og vask en gang med PBS.
  3. Resuspender cellene i 200 μL nytilberedt 2% paraformaldehyd i PBS laget av kommersielt levert 16% EM-grad løsning. Påfør cellene i fiksativet på lysbildet og la cellene slå seg ned i 30 minutter. Vask de festede cellene 2x med vaskeoppløsning (0,1% normalt geitserum i PBS).
  4. Påfør permeabiliseringsløsningen (0,5% Triton X-100 i PBS) på cellene og inkuber i nøyaktig 30 minutter. Fjern permeabiliseringsoppløsningen og vask en gang med rikelig med vaskeoppløsning.
  5. Påfør blokkløsningen (10% normalt geitserum og 0,1% Triton X-100 i PBS) og inkuber i 30 minutter.
  6. Fortynn antisera hevet mot T. brucei aldolase 1:500 i blokkoppløsning og påfør den på cellene14. Inkuber i 1 time ved RT. Vask lysbildene i 5x i 3-5 min med vaskemiddel.
  7. Fortynn geit anti-kanin Alexa fluor 568 1: 1,000 i blokkoppløsning og gjelder for cellene. Inkuber i 1 time ved RT. Vask lysbildene i 5x i 3-5 min med vaskeoppløsning.
  8. Påfør monteringsmedium og forsegl et deksel på lysbildet.
  9. Avbilde cellene med et 100x-objektiv (NA 1.4-0.7) og analyser bildene ved hjelp av ImageJ. Utfør Pearsons samlokaliseringsanalyse ved hjelp av plugin-modulen Coloc 2 for ImageJ. Se tilleggsfigur S2 for et felt med representative celler. )
    1. For å fullføre dette, legg til bildefilen på Fiji og velg Bilder.
    2. Juster lysstyrke og kontrast for hver kanal til et punkt der ingen bakgrunn er synlig.
    3. Endre bilder fra 16-biters til 8-biters, slå sammen bildene, og beskjær deretter til en enkelt celle med delte kanaler.
    4. Under Analyser og samlokalisering velger du plugin-modulen Coloc2. Velg aldolase (den røde kanalen) som Kanal 1 og pHL (den grønne kanalen) som Kanal 2 , og klikk OK for å starte beregningen av Pearsons korrelasjon.

3. Prøveklargjøring for flowcytometri

  1. Indusere pHL-celler med enten tetracyklin eller doksysyklin (1 μg / ml) over natten.
  2. Pellet cellene (~4 × 107 pHL og ~1 × 106 parentale) ved sentrifugering (RT, 10 min, 1000 × g). Fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml PBS enten med eller uten 10 ml glukose, avhengig av om prøven er sultet eller ikke-sultet. For tidsforløpsanalyser, resuspender i PBS supplert med 10 mM glukose for å forhindre at cellene sulter til vaskene er fullført. For HTS-analysen (High Throughput Screen), resuspender i PBS uten glukose for å minimere overføring av glukose; Gjenta vasken to ganger til.
  3. Sentrifuger cellene for fjerde gang, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i enten PBS, PBS pluss 5 mM glukose eller PBS pluss 10 mM glukose, avhengig av behandlingen. Suppler prøvene med enten 1 μg/ml propidiumjodid (PI) eller 100 nM tiazolrødt (TR) for levende/død bestemmelse. Overfør hver prøve til 5 ml rør som er kompatible med flowcytometeret.

4. Flowcytometri

MERK: Forbered eksperimentet på et flowcytometer som inneholder følgende lasere: 405 nm (fiolett), 488 nm (blå) og 561 nm (gul) eller 638 nm (rød). Se tilleggstabell S1 for vanlige navn på kanaler som omtales nedenfor.

  1. For å måle pHL-fluorescens, bruk kanalene KO525 (VL2-H, eksitasjon 405 nm, utslipp 542/27 nm) og FITC (BL1-H, eksitasjon 488 nm, utslipp 530/30 nm). For å skille levende celler fra døde celler, bruk enten PI eller TR; måle PI på YL2-H-kanalen (eksitasjon 561 nm, utslipp 620/25 nm). Mål TR på RL1-H-kanalen (638 nm eksitasjon, 660/10 BP).
    1. For å sette opp eksperimentet på flowcytometerprogramvaren, opprett følgende plott: 1) YL2-H-kanalhistogram (hvis du bruker PI) eller et RL1-H-kanalhistogram (hvis du bruker TR), 2) FSC-A vs SSC-A punktplott, 3) FSC-A vs FSC-H punktplott, og 4) BL1-H vs VL2-H kanalpunktplott.
    2. Plasser den ufargede WT-kontrollen (foreldrecellelinje) på prøveinjeksjonsporten (SIP) først, og løft trinnet på plass. Begynn å samle inn data på cytometeret ved laveste strømningshastighet for å gi tid til å foreta nødvendige justeringer. For å unngå å score falske rusk og døde celler, begynn å registrere hendelser 5 s etter at prøveinnsamlingen begynner.
    3. Juster YL2- eller RL1-spenningen slik at hovedtoppen er innenfor 10 3-10 4 relative fluorescensintensitetsenheter (RFI). Juster FSC- og SSC-spenningene slik at >90 % av hendelsene passer på punktplottet. Juster FSC-terskelen for å ekskludere ruskpopulasjonen, men ikke sannsynlige celler.
    4. Juster VL2- og BL1-kanalene slik at den primære toppen er innenfor 103-10 4 RFI-enheter for den ufargede WT-kontrollen.
    5. Plasser den første prøven som inneholder indusert pHL farget med enten PI eller TR på SIP og løft trinnet på plass. Begynn å samle inn data med laveste strømningshastighet og observer nøye hendelser i hvert plott. Forsikre deg om at >90 % av hendelsene er innenfor hvert plott, og at ingen hendelser metter VL2-H- og BL1-H-kanalene.
  2. Fortsett med å kjøre prøvene. Sørg for å registrere minst 10 000 hendelser per prøve.
  3. Lagre dataene fra eksemplene i FCS-filformat og eksporter for analyse.

5. Dataanalyse av flowcytometriresultater

MERK: Denne arbeidsflyten for dataanalyse bruker FlowJo-programvare. Hvis du bruker annen programvare for flowcytometrianalyse, fortsetter du å følge de viktigste trinnene som er beskrevet nedenfor, ved hjelp av programvaretilpassede verktøy. For å visualisere plottene og gating, se tilleggsfigur S3 og tilleggsfigur S4.

  1. Åpne et nytt oppsett og åpne .fcs-filene som ble anskaffet i trinn 4.3. Dra og slipp .fcs-filene inn i layoutvinduet.
  2. Gate for levende celler.
    1. Dobbeltklikk den ufargede WT-kontrollen for å åpne et vindu for dette eksemplet.
    2. Vis dataene som et histogram på enten YL2-H-kanalen (hvis du bruker PI) eller RL2-H-kanalen (hvis du bruker TR). Veksle mellom dette og prøver farget med levedyktighetsfargen for å identifisere levende og døde populasjoner.
      MERK: Alle hendelser bør være ufarget siden et levedyktighetsfargestoff ikke ble tilsatt i denne prøven.
    3. Lag en bisektorport som deler levende og døde befolkninger; navngi venstre port Live og høyre port Død. Bruk denne porten på alle prøver, og veksle deretter mellom prøver for å sikre at denne porten tegnes riktig for alle prøver. Juster porten etter behov.
  3. Gate for cellene.
    1. På den ufargede WT-kontrollen dobbeltklikker du på Live-porten for å vise hendelser i den porten. Endre punktplottet x-aksen til FSC-A og y-aksen til SSC-A.
    2. Bruk polygonportverktøyet til å tegne en port rundt cellepopulasjonen og gi den navnet Celler. Pass på å ekskludere rusk/døende celler (vanligvis helt til venstre og nederst i punktplottet) og aggregater (helt til høyre og øverst i punktplottet).
    3. Bruk denne porten under Live-porten for alle prøver. Veksle mellom prøver for å sikre at porten omfatter den sannsynlige cellepopulasjonen for alle prøver og foreta nødvendige justeringer. Sørg for å bruke porten på nytt på alle prøver etter at du har endret den.
      MERK: Cellepopulasjonsfordelingen endres merkbart mellom sultede og ikke-sultne forhold på FSC vs SSC; sikre at celleporten omfatter cellepopulasjonen under alle forhold.
  4. Gate for enkeltceller for å øke kvaliteten på pH-målinger.
    1. På den ufargede WT-kontrollen dobbeltklikker du på celleporten for å vise hendelser i den porten. Endre punktplottet x-aksen til FSC-A og y-aksen til FSC-H.
    2. Se etter en diagonal fordeling av enkeltceller på dette punktplottet med dubletter som danner en sekundærpopulasjon nederst til høyre i singletpopulasjonen (se tilleggsfigur S1 tredje plott). Bruk polygonportverktøyet til å tegne en port rundt singlethendelsene unntatt dublettpopulasjonen. Gi denne porten navnet Singlets.
    3. Bruk Singlets-porten under celleporten for alle prøver. Igjen, veksle mellom prøver for å sikre at porten ekskluderer dublettpopulasjonen på riktig måte, samtidig som singletpopulasjonen inkluderes. Juster etter behov.
  5. Port for fluorescerende pHL-celler.
    1. I eksemplet med ufarget WT-kontroll dobbeltklikker du på Singlets-porten for å åpne et punktdiagram for den populasjonen. Endre x-aksen til BL1-H og y-aksen til VL2-H.
    2. pH-sensoren pHluorin2 er fluorescerende i både VL2 og BL1. Bruk polygonportverktøyet til å tegne en diagonalformet port som strekker seg til toppen og rett bort fra den autofluorescerende populasjonen nederst til venstre i punktplottet. Gi denne porten navnet pHL+.
    3. Påfør pHL+ -porten under Singlets-porten for alle prøver. Bytt til en pHL-prøve og juster porten for å inkludere hendelser med større fluorescensintensitet i både VL2-H og BL1-H enn WT-kontrollen. Sørg for at denne porten omfatter denne fluorescerende populasjonen for alle prøver, da posisjonen til denne populasjonen vil skifte når glykosomal pH endres.
      MERK: Dette lille, men synlige skiftet i pHL + -populasjonen skyldes pH-avhengige endringer i fluoroforens eksitasjonsspektrum.
  6. Eksporter statistikken.
    1. Klikk på Table Editor | Rediger bar | Legg til kolonne for å legge til ny statistikk som skal eksporteres.
      MERK: For hver statistikk som skal eksporteres, velger du den respektive statistikken og hvilken populasjon den skal eksporteres fra. Pass på at du velger riktig parameter for gjeldende statistikk, for eksempel Median. La prøven være uendret.
    2. Legg til kolonner med følgende statistikk: Totalt (ungated) Count, pHL+ Count, Live Freq. av Total (prosent basert på totale hendelser), pHL+ Freq. av Parent (prosent basert på parent gate), pHL+ Median VL2-H og pHL+ Median BL1-H.
    3. Klikk på Table Editor og endre følgende eksportinnstillinger: Vis til Til fil og Tekst til CSV, og velg deretter fildestinasjon og navn. Klikk på Opprett tabell.
  7. Beregn fluorescensforholdet.
    1. Lagre den eksporterte .csv filen som en regnearkfil.
    2. Utfør kvalitetskontrollanalyse ved å sammenligne følgende på tvers av alle prøvene i eksperimentet: antall hendelser per utvalg, prosentandel av live-hendelser og prosentandel av pHL+-hendelser. Sammenlign disse visuelt i stolpe- eller punktdiagrammer, avhengig av eksperimentet.
    3. Merk en ny kolonne som pHL+ Median VL2/BL1. For hvert utvalg deler du median VL2-H-verdien med median BL1-H-verdi som vist i ligningen (1).
      Equation 1(1)
  8. Bruk statistisk analyseprogramvare for å utføre statistisk analyse ved hjelp av fluorescensforholdet.

6. kalibrering av pH-biosensor

MERK: For å konvertere målte fluorescensforhold til pH-enheter, kalibrer pHL-uttrykkende celler ved hjelp av nigericin og valinomycin. Nigericin er en K+/H+ antiporter, en ionofor som kan balansere pH over membraner når det er tilstrekkelig K+ i bufferen15. Nigericin har ofte blitt brukt til å kalibrere pHluorin og andre pH-sensorer16,17. Siden peroksisomalt lokalisert pHluorin tidligere ble kalibrert med 10 μM nigericin18, valgte vi å behandle med den konsentrasjonen. Valinomycin er en kaliumionofor og har blitt brukt (ved 4 μM) for å balansere pH over mitokondriemembraner19. Vi brukte 10 μM valinomycin for å hjelpe pH-likevektsaktiviteten til nigericin ved å sikre at K + -ioner ble likevektet over membranene. Mens vi brukte en kombinasjon av nigericin-valinomycin, kan nigericin være tilstrekkelig til å balansere organellar pH.

  1. Forbered åtte løsninger med universell kalibreringsbuffer (UCB; 15 mM MES, 15 mM HEPES og 130 mM KCl) hver ved en annen pH fra 5 til 8,5.
  2. Sentrifuge (RT, 10 min, 800-1000 × g) åtte separate rør med 2 ml pHL-uttrykkende BSF-kultur (~4 × 106 celler hver).
  3. Fjern supernatanten og resuspender deretter hver cellepellet i UCB ved forskjellige pH-verdier.
  4. Introduser nigericin og valinomycin, hver til 10 μM. Spike i PI til 1 μg / ml.
  5. Inkuber cellene i hver løsning i 15 minutter.
  6. Kjør hver prøve på et flowcytometer for å måle fluorescensforholdet som beskrevet i trinn 4-5.
  7. Gjenta dette eksperimentet to ganger til for å oppnå tre biologiske replikater for hver pH-verdi. Eksporter data i .fcs-format.
  8. Analyser FCS-filene som beskrevet i trinn 5.1 til og med 5.8. Bruk det målte fluorescensforholdet for hver pH for å interpolere glykosomal pH i fremtidige eksperimenter ved bruk av ligning (2).
    Equation 2(2)
    MERK: Tilleggsfigur S3 viser punktplottene og gating-skjemaet. Resultatene finnes i tilleggstabell S2. Følgende beskriver hvordan du interpolerer pH fra fluorescensforhold ved hjelp av GraphPad Prism. Hvis du bruker annen statistisk programvare, følger du de samme nøkkeltrinnene.
    1. Åpne GraphPad Prism og opprett en XY-tabell med tre y-replikater. Lim inn pH-verdiene i x-kolonnen og deres tilknyttede fluorescensforholdsverdier i y-replikate-kolonnene.
    2. Klikk på grafen som er tilknyttet tabellen. Når du ser på grafen, klikker du på Analyser under Analyse-båndet | Interpoler en standardkurve under XY-analyser.
    3. Velg sigmoidal, 4PL, X er log (konsentrasjon) siden pH-enheter er på en logaritmisk skala. Parametrene Topp og Bunn er de estimerte topp- og bunnplatåene. Velg Ingen spesiell håndtering av uteliggere.
      MERK: Programvaren vil søke å tilpasse dataene til modellen beskrevet i ligning (2) og trinn 6.9.3. Se etter bevis på manglende tilpasning i resultattabellen og kurven på grafen.
    4. For å interpolere pH fra fluorescensforhold i andre eksperimenter, gå til tabellen med pHL-kalibreringsdataene. Lim inn fluorescensforholdsverdiene under kalibreringsdataene i y-kolonnen(e). Gi hver y-verdi en tittel, men la x-verdien (pH) stå tom siden den er ukjent.
    5. I resultatgalleriet klikker du på interpolasjonsanalysen og går deretter til kategorien Interpolerte X-replikater . Se etter de interpolerte pH-verdiene som vil bli oppført sammen med de angitte fluorescensforholdsverdiene.
      MERK: Programvaren bruker modellen og best tilpassede parameterverdier funnet fra kalibreringsdataene for å interpolere pH fra fluorescensforhold for eksperimenter der pH er ukjent.

7. Glukose sult og addback time-kurs

  1. Induser 15 ml BSF pHL-parasitter over natten med 1 μg/ml doksysyklin inkubert ved 37 °C som beskrevet i trinn 1.1.
  2. Vask 15 ml indusert pHL-kultur i PBS tilsatt 10 ml glukose. Gjenta dette trinn 3x.
    1. Vask samtidig 3 ml WT-kultur i PBS 3x som beskrevet i trinn 3.2.
    2. Etter den første vasken når pHL-prøven resuspenderes i 1 ml PBS, fjern en 0,1 ml alikot med pHL-cellesuspensjon for å holde i 10 mM glukose som en ikke-sultet kontroll.
  3. Etter siste vask resuspenderes pHL-prøven i PBS tilsatt 1 μg/ml PI.
  4. Innhenting av flowcytometridata
    1. Begynn å overvåke glykosomal pH for både sultede og ikke-sultne prøver ved å måle hver prøve på et strømningscytometer hver 5, 10, 30 eller 90 min, avhengig av eksperimentet og prøven. Innhent flowcytometridata som beskrevet i trinn 4.1 til 4.3, og sørg for at spenninger og plott er forberedt på forhånd.
    2. Kjør den uflekkede WT-kontrollen først på 0 min.
    3. Kjør den ikke-sultne kontrollprøven på cytometeret hvert 90. minutt fra 0 min. For sultetidskursanalysen, kjør den sultede prøven hvert 10. minutt fra 0 min. For Glucose Addback-analysen, kjør den sultede prøven på 0, 5, 10, 20, 30, 60 og 90 minutter; Gjenta deretter etter å ha introdusert glukose.
    4. Inkuber prøvene ved romtemperatur i løpet av 90 min sultetid og 180 min Glukose Addback tid kurs.
  5. Analyser FCS-filene som beskrevet i trinn 5.1 til og med 5.8.
    MERK: Tilleggsfigur S4 viser hvordan du utfører gating og hvordan prikkplottene skal se ut. Supplerende tabell S3 og tilleggstabell S4 viser resultatene av henholdsvis glukose sultetid kursanalysen og glukose add-back time course assay.

8. Optimalisering av analysen for narkotika screening

  1. Vask ca. 32 ml pHL-uttrykkende BSF-parasitter og 3 ml WT-celler, begge ved ca. 2 × 106 celler/ml, 2x i PBS som beskrevet tidligere.
    MERK: Mer enn 10 000 hendelser må registreres per brønn for å minimere variasjonen i målte fluorescensforhold og måle Z-faktorstatistikken nøyaktig. Minimumskulturen som er nødvendig for å oppnå dette er ca. 26 ml, men vi anbefaler 32 ml for enkel håndtering.
    1. Etter den første vasken, skill pHL-prøven likt i to mikrosentrifugerør.
  2. Etter vask, resuspender en pHL-prøve i 18 ml PBS inneholdende 5 mM glukose, 0,1% DMSO og TR. Suspender den andre pHL-prøven i 18 ml PBS pluss 0,1% DMSO og TR.
    MERK: DMSO brukes til å etterligne buffersammensetningen i en stoffskjerm, da forbindelser vanligvis oppløses i DMSO.
  3. Overføre disse to celleløsningene til et 12-brønns reservoar, 9 ml per brønn.
  4. Bruk en pipetteringsrobot til å pipe celleløsningene i separate halvdeler av en plate på 384 brønner, 80 μL per brønn.
  5. Inkuber platen ved romtemperatur i 1,5 time, rist forsiktig og pakket inn i aluminiumsfolie for å beskytte fluoroforene mot lys.
  6. Kjør platen på et flowcytometer som er i stand til å kjøre 384-brønnplater.
    MERK: Følgende arbeidsflyt er tilpasset en Attune NxT med Cytkick Max automatisk prøvetaker. Hvis et annet flowcytometer brukes, fortsett å følge de viktigste trinnene.
    1. For platen, kjør med den raskeste strømningshastigheten (1,000 uL / min) og aktiver boost-modus. Oppnå 20 μL/brønn. Inkluder en blandingssyklus og en skyllesyklus mellom hver brønn.
    2. Opprett plott som beskrevet i trinn 4.1.3.
    3. Kjør en ufarget WT-rørkontroll og optimaliser spenningene som beskrevet i trinn 4.1.3 og 4.1.4. Kjør en utsultet pHL-rørprøve og optimaliser VL2- og BL1-spenningene som beskrevet i trinn 4.1.
    4. Begynn å anskaffe platen på strømningscytometeret. Kjør platen horisontalt slik at det ikke er noen signifikant innsamlingstidsforskjell mellom de sultne og ikke-sultne prøvebrønnene. Forsikre deg om at plateoppkjøpet er ferdig i ~ 1,5 time.
  7. Eksporter FCS-filene, og analyser dataene som beskrevet i trinn 5.1 til 5.8. Finn gjennomsnittet (AVG) og standardavviket (SD) av fluorescensforholdene for prøvene behandlet med enten glukose (Glc) eller ingen glukose (sultet).
    MERK: Dataene fra våre Z-faktoreksperimenter finnes i tilleggstabell S5.
  8. Beregn Z-faktor20-statistikken ved hjelp av ligning (3).
    Equation 3(3)

Figure 1
Figur 1: Diagram over metoden for å skåre glykosomal pH i levende BSF-trypanosomer. (A) Avbildning av cellelinjer som uttrykker glykosomalt plassert pHluorin2-sensor. Inkluderingen av en peroksisomal målrettingssekvens gir kontroll over lokaliseringen. MERK: Vi forventer at eliminering av PTS-1 vil føre til cytosolisk lokalisering, noe som tillater fremtidig analyse av pH i det subcellulære rommet. (B) Avbildning av sensorvalideringsanalysen. Forkortelse: BSF = blodbaneform. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

MERK: Z-faktorstatistikken brukes til å bestemme hvor egnet en analyse er for HTS. Verdier mellom 0,5 og 1,0 betyr generelt at analysekvaliteten er akseptabel for HTS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

pHLuorin2-PTS1 lokalisering til glykosomer i BSF T. brucei
For å vurdere den subcellulære lokaliseringen av pHluorin2-PTS1 ble parasitter utsatt for immunfluorescensanalyser. Signal fra transgenet samlokalisert med antisera hevet mot et glykosomresident protein, aldolase (TbAldolase) (figur 2A). Den gjennomsnittlige Pearsons korrelasjonskoeffisient for kolokalisering mellom anti-TbAldolase og pHluorin2-PTS1 var 0,895, noe som indikerer at pHluorin2-PTS1 primært var lokalisert til glykosomer. Med pHluorin2-PTS1 lokalisert til glykosomet, fortsatte vi å undersøke BF-glykosom pH.

Figure 2
Figur 2: Lokalisering av pHluorin2-PTS1 til glykosomer i BSF Trypanosoma brucei. (A) Samlokalisering av pHluorin2-PTS1 med det glykosomal-residente proteinet TbAldolase. BF 90-13 parasitter ble transfektert med pLEWpHluorin2-PTS1 og ekspresjon ble indusert med doksysyklin (1 μg/ml). TbAldolase ble lokalisert ved hjelp av anti-TbAldolase sera, etterfulgt av inkubasjon med geit anti-kanin Alexa fluor 568. Den gjennomsnittlige Pearsons korrelasjonskoeffisient var 0,895 (30 celler). (B) Kalibrering av pHluorin2-PTS1 i BSF T. brucei. Skalastenger = 4 μm. Forkortelse: BSF = blodbaneform. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

pHluorin2-PTS1 kalibrering
Endringer i pH endrer eksitasjonsspekteret til pHluorin2-PTS1. Under nøytral pH er pHluorin2-PTS1-eksitasjon ved 405 nm større enn ved 488 nm; når pH faller, er det motsatte sant 9,21. For å måle den relative pH i glykosomet ved flowcytometri, målte vi utslipp når det ble eksitert av 405 nm laser (VL2-kanal) og utslipp når det ble eksitert av 488 nm laser (BL1-kanal), ved å bruke forholdet mellom VL2 / BL1 (fluorescensforhold) for å måle den relative glykosomale pH. For å konvertere fluorescensforholdet til pH, likevektet vi intracellulær og glykosomal pH med ekstracellulær pH ved hjelp av ionoforene valinomycin og nigericin17,18 etterfulgt av flowcytometrianalyse for å finne fluorescensforholdet. Som forventet økte fluorescensforholdet da ekstracellulær pH økte med en intracellulær Kd på pH 6,5 (figur 2B). Denne Kd var litt lavere enn det som er rapportert in vitro Kd for pHluorin29. Interessant nok var BSF glykosomal pH i nærvær av glukose ~ pH 8,0, som var mer grunnleggende enn PF-glykosomer i nærvær av glukose22. Vi brukte denne kalibreringskurven til å konvertere fluorescensforholdet til pH i påfølgende eksperimenter.

Glykosomforsuring på grunn av glukose sult
Mens T. brucei PF-parasitter forsurer glykosomene når de sultes av glukose22, er hvordan BSF-glykosomer reagerer på glukose ukjent. For å utforske dette vasket vi BSF-parasitter som uttrykker pHluorin2-PTS1 i PBS pluss 10 mM glukose for å fjerne kulturmediet og deretter resuspenderte cellene i PBS uten glukose. Sensorresponsen på denne forstyrrelsen ble målt umiddelbart og deretter hvert 10. minutt i 1,5 time ved flowcytometri. Responsene ble sammenlignet med celler i PBS pluss 10 mM glukose (ikke-sultet).

Som følge av sult observerte vi en gradvis mild forsuring over tid, som flatet ut med ~90 min (figur 3A). Denne endringen i glykosomal pH var statistisk signifikant (p < 0,0001) og repeterbar på tvers av tre separate eksperimenter. Dette antyder at BSF-celler mildt forsurer glykosomene når de sultes av glukose, lik responsen observert i PF-livsstadiet9.

Figure 3
Figur 3: Reversibel forsuring av glykosomer av BSF T. brucei ved berøvet glukose. (A) Glykosomal pH i celler dyrket i fravær (sultet, blå) eller tilstedeværelse (ikke-sultet, rød) av glukose. De sultede cellene ble resuspendert i PBS uten glukose ~ 2 min før første måling på et Attune NxT flowcytometer. Tre biologiske replikater av tidsforløpet ble utført. Ikke-sultne parasitter ble inkubert i PBS pluss 10 mM glukose. En uparet to-tailed Student t-test ble utført sammenligne de utsultede og ikke-sultne 90 min tidspunkter, ***p = 0,0001. (B) Tidsforløpet av glykosomal pH-endring sultet (blå) og ikke-sultne (røde) BSF-parasitter med 10 mM glukose gjeninnført etter 90 minutter (grønn stiplet linje). Fem biologiske replikater av tidsforløpet ble utført. NS = ikke signifikant (p = 0,25, uparret tosidig Student t-test). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Reversibel glykosomal forsuring som respons på glukose
Vi testet deretter om BSF-glykosomforsuring var reversibel ved å sulte cellene og deretter gjeninnføre glukose. Parasitter ble inkubert i fravær av glukose i 90 minutter. Deretter ble glukose (10 mM) tilsatt, og sensorresponsen ble målt med cytometri i ytterligere 90 minutter (figur 3B). Vi observerte at etter at glukose ble gjeninnført, returnerte glykosomal pH til sultenivåer i ~ 30 minutter. Disse resultatene antyder at BSF glykosomal pH er dynamisk og regulerbar som respons på glukose, lik pH-responsen observert i PF-parasitter.

Tilpasning av pHluorin2-analysen for legemiddelscreening med høy gjennomstrømning
Glykosomer er essensielle organeller for trypanosomet, da de huser viktige metabolske veier. Betydningen av glykosomer antyder at hemmere av deres homeostase kan holde løfte som potensielle terapeutiske ledere. Her har vi tilpasset analysen for glykosomal pH til et høyt gjennomstrømningsformat, noe som vil tillate tilpasning til legemiddelskjermer for å identifisere hemmere av glykosomal pH. Vi forventer at forstyrrelse av reguleringen av denne responsen kan være skadelig for parasitten, gitt den kjente effekten av pH på glykosom-bosatt proteinfunksjon7.

For å etablere formatet med høy gjennomstrømning scoret vi analysens robusthet. For å fullføre dette ble parasitter indusert til å uttrykke pHluorin2-PTS1 belagt i en 384-brønns mikrotiterplate i enten 5 mM glukose (høye kontroller) eller ingen glukose (lave kontroller) og deretter inkubert i 90 minutter ved romtemperatur. Platen ble deretter analysert med flowcytometri. Som vist i figur 4 var det lav variasjon mellom replikerende målinger, og de høye og lave kontrollene er godt separert, trekk som resulterte i en akseptabel Z-faktor på 0,645. Analyser med verdier > 0,5 anses generelt som robuste nok for tilpasning til screeningkampanjer med høy gjennomstrømning. Gitt suksessen her, forventer vi at denne sensoren og tilnærmingen vil bli brukt i fremtidige stoffskjermer med høy gjennomstrømning.

Figure 4
Figur 4: Analyse for å vurdere egnetheten til pHluorin2-PTS1 sensorbærende BSF for fremtidige HTS-kampanjer. Cellene ble inkubert i 90 minutter med glukose (høy kontroll, rød, 5 mM glukose) eller uten heksose (lav kontroll, blå, ingen ekstra glukose). Den beregnede Z-faktoren var 0,645. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur S1: Kloning av pHluorin2-PTS1-genet i den induserbare T. brucei-ekspresjonsvektoren pLEW100v5. (A) Begge vektorene var dobbel restriksjon fordøyd av HindIII og BamHI og deretter renset. pHluorin2-PTS1-genfragmentet ble ligert til pLEW100v5 ved bruk av T4 DNA-ligase. (B) pLEW100-pHlourin2-PTS1. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S2: Samlokalisering av pHL med TbAldolase BF 90-13 parasitter transfektert med pLEWpHluorin2-PTS1. Ekspresjon ble indusert med doksysyklin (1 μg/ml). TbAldolase ble lokalisert ved hjelp av anti-TbAldolase sera (fortynnet 1:500 i blokk), etterfulgt av inkubasjon med geit anG-kanin Alexa fluor 568. Den gjennomsnittlige Pearsons korrelasjonskoeffisient var 0,895 (30 celler). Skala barer = 10 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S3: Representativ gating og punktplott for kalibrering av BSF pHL-sensorcellelinje med pH 8-kalibreringsbufferprøven som et eksempel. Prøver ble farget med levedyktighetsfargen PI for å vurdere hvordan pH påvirket levedyktigheten ved bruk av YL2-H-kanalen, men levedyktighet ble ikke brukt i gating-skjemaet. En bred port på FSC-A vs SSC-A ble brukt til å gate for celler da både levende og døde celler ble brukt i kalibreringen. Etter gating for celler ble enkeltceller (singleter) styrt ved hjelp av FSC-A vs FSC-H. Til slutt ble en streng port brukt til hendelser fluorescerende for pHL i BL1-H- og VL2-H-kanalene. Forkortelser: BSF = blodstrømsform; PI = propidiumjodid; FSC-A = fremover scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremover scatter-peak høyde. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S4: Representative gating- og prikkplott for glukosesult og tilleggstidskursanalyser. Prøven Starved 0 min brukes som eksempel. Levende celler ble styrt på YL2-H-kanalen siden PI ble brukt. Celler ble styrt ved hjelp av FSC-A vs SSC-A for å utelukke rusk og aggregater. Singlets ble gated ved hjelp av FSC-A vs FSC-H. Kanalene BL1-H og VL2-H ble brukt til å portere for pHL+-hendelser. En WT-kontroll ble brukt til å utelukke autofluorescerende hendelser ved innstilling av denne porten. Forkortelser: PI = propidiumjodid; FSC-A = fremover scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S1: Kanal og fellesnavn brukt for flowcytometri. Kanalnavnet, det vanlige navnet og laser- og utslippsfilteret som brukes, er angitt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S2: Resultater fra pHL-kalibrering med nigericin og valinomycin i forskjellige pH-buffere. Denne tabellen inneholder eksportert statistikk fra FlowJo-analysen av .fcs-filene. Disse verdiene ble brukt til å finne fluorescensratioen (VL2-H/BL1-H) for kalibrering av pHL, som vist i figur 2. Disse pH-kalibreringsresultatene ble også brukt til å interpolere pH for glukosesult og add-back time-course eksperimenter (figur 3). Følgende statistikk ble brukt til kvalitetskontroll: Totalt antall hendelser, pHL+-telling, PI- (%), PI+ (%) og pHL+ (%). Data for hver biologisk replikat er i en egen fane, og fanen merket "Oppsummerte resultater" inneholder fluorescensforholdene for hver pH-behandling og replikerer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S3: Analyserte data fra BSF pHL glukose sult tidsforløpsanalyse presentert i figur 3A. Denne tabellen inneholder eksportert statistikk fra .fcs-filer analysert i FlowJo-programvaren. Fluorescensratioer ble beregnet ved å ta forholdet mellom median VL2-H og median BL1-H (begge fra pHL+-populasjonen). Disse forholdene ble samlet i fanen merket "Oppsummerte resultater". PI- (%) ble brukt for å bestemme effekten av glukosesult på levedyktighet over tid. Totaltelling og pHL+-telling ble brukt til kvalitetskontroll. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S4: Analyserte data fra BSF pHL glukoseadd-back time-course analysen presentert i figur 3B. Denne tabellen inneholder eksportert statistikk fra .fcs-filer analysert i FlowJo programvare. pHL+ Median VL2/BL1-verdiene ble beregnet ut fra pHL+ median VL2-H og BL1-H i Excel. Den øvrige statistikken ble brukt til kvalitetskontroll. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S5: Resulterende data fra FlowJo-analyse av Z-faktor-studien med høy gjennomstrømningsscreeninganalyse ved bruk av pHL. Faner merket "0 mM glukose" (lav) og "5 mM glukose" (høy) inkluderer data fra celler behandlet med henholdsvis 0 eller 5 mM glukose. Disse fluorescensforholdene er presentert i figur 4. I fanen "Pooled Analysis" ble fluorescensforholdene for begge behandlingene samlet, og gjennomsnittet og standardavviket til prøven (SD) ble beregnet for hver. Z-faktorstatistikken ble beregnet ved hjelp av ligning 3. Forholdet mellom gjennomsnittlig høy/lav ble beregnet for å måle separasjonen av gjennomsnittene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Miljøpersepsjon og responsmekanismer i det afrikanske trypanosomet er dårlig forstått. Endringer i næringstilgjengelighet er kjent for å utløse ulike responser i parasitten, inkludert forsuring av glykosomer. Her har vi beskrevet en metode for å studere glykosomal pH-respons på miljøforstyrrelser i levende celler ved hjelp av en arvelig proteinsensor, pHluorin2, og flowcytometri.

Det er flere kritiske trinn i bruken av sensoren. For det første er karakteriseringen av transfektede parasitter som uttrykker transgenet viktig, da det kan være celle-til-celle-variasjon i uttrykk. Ekspresjonsnivåer av noen transgener kan falle over tid. Selv om dette ikke har blitt observert med de pHluorin2-bærende cellene til dags dato, kan det være nødvendig å klone ut kulturen hvis sensorresponsen blir svært variabel (f.eks. Etter induksjon er sensorsignalet ikke robust), da noen medlemmer av befolkningen kan uttrykke proteinet på høyere nivåer enn andre. Alternativt har retransformasjon og seleksjon vist seg nyttig for å generere nye cellelinjer med høyere (om enn muligens forbigående) uttrykk. Hvis re-transfeksjon er nødvendig, anbefaler vi kloning av individuelle linjer, da uttrykket for transgenet av interesse kan gi en subtil vekstulempe som fører til tap av høye ekspressorer i befolkningen over tid.

I tillegg er det viktig å overvåke parasittenes levedyktighet - både under analysen og mens du rutinemessig opprettholder kulturer. Vi har inkludert enten PI eller tiazolrødt for dette formålet under analysen, og disse reporterne sikrer at data bare gjenspeiler respons i levende celler. Å sikre at celledoblingstiden under normal kultur er konstant, spesielt før initiering av storskala analyser (f.eks. HTS-type analyser) begrenser bekymring for å initiere analyser med celler som ikke trives, noe som kan negativt endre høye og lave kontrollsignaler og påvirke skjermens generelle robusthet.

Tilnærmingen vi har beskrevet her for måling av glykosomal pH er robust og følsom. Det er imidlertid begrensninger i tilnærmingen. For det første kreves tilgang til cytometre med passende evner, inkludert prøvetakere som er i stand til å akseptere mikrotiterplater. Mens ratiometriske data kan samles inn ved fluorescensmikroskopi, begrenser det begrensede antallet prøver som kan analyseres på den måten nytten av tilnærminger som skjermer (og tidskursbaserte analyser).

En annen potensiell begrensning er at analysene involverer en agent for biosikkerhetsproblem. Det er mulig at kjernefasiliteter som huser instrumentene som trengs for arbeidet, kanskje ikke tillater levende parasitter på utstyret. Disse begrensningene, sammen med de tekniske utfordringene ved å generere og vedlikeholde transgene trypanosomer, kan overvinnes gjennom samarbeid mellom grupper med passende kompetanse innen parasittbiologi og celleanalyser.

Arbeidet beskrevet her fokuserer på å bruke den glykosomale pH-sensoren i afrikanske trypanosomer, men verktøyet kan tilpasses for bruk i andre kinetoplastidparasitter. Selv om det er uklart hvilken rolle forsuring av organellen kan ha i biologien til Leishmania spp. eller Trypanosoma cruzi, er det mulig at pHLuorin2-PTS1 kan uttrykkes som et transgen i cellene gitt at parasittspesifikke ekspresjonsvektorer er tilgjengelige og at det glykosomale importmaskineriet er likt i organismene 5,23,24.

En potensiell anvendelse av de sensorbærende cellene er identifisering av små molekyler som endrer cellekapasiteten for å forsure glykosomet. Disse vil sannsynligvis være skadelige for parasitten, da endret pH har vist seg å være et mulig middel for regulering av heksokinase, et glykosombosatt protein som er essensielt i det patogene livssyklusstadiet av det afrikanske trypanosom7. Analysen beskrevet her er tilpasset til å være høy gjennomstrømning (figur 4), noe som gjør det mulig å undersøke store kjemiske samlinger for denne aktiviteten.

Oppsummert gir dette verktøyet muligheten til å dissekere mekanismer involvert i dynamiske responser i en parasittspesifikk organell. Ved å bruke sensorlinjene i kombinasjon med fremover og omvendt genetikk er det sannsynlig at unike parasittspesifikke veier vil bli identifisert. Videre gir sensorlinjene muligheten for identifisering av småmolekylære hemmere av responsen, og åpner døren for ny oppdagelse av legemiddelmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

pHluorin2-PTS1 ble klonet til pLEW100v5 av Twist Bioscience som ga konstruksjonen i en høykopiert kloningsvektor; pLEW100v5 var en gave fra Dr. George Cross. Antiserum hevet mot T. brucei aldolase er tilgjengelig fra Dr. Meredith T. Morris, Clemson University, på forespørsel. Arbeid fra JCM og KAC laboratorier ble delvis støttet av en pris fra National Institutes of Health (R01AI156382). SSP ble støttet av NIH 3R01AI156382.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) VWR 10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) Corning 431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate BrandTech  781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit Lonza VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer invitrogen by Thermo Fisher Scientific A24858 FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate Millipore Sigma BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler invitrogen by Thermo Fisher Scientific A42973
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule Fisher Scientific 50-980-487
GraphPad Prism statistical software
Nigericin (sodium salt) Cayman Chemical 11437
Nucleofector 2b Lonza Discontinued Product
OP2 Liquid Handler opentrons OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O Sigma Life Science CAS:25988-63-0 Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3) biotium #40087 We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin Cayman Chemical 10009152 Pipetting robot for HTS assay
         For pH calibration
         For pH calibration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702 (2011).
  2. Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine. F1000Res. 4, 938 (2015).
  3. Parsons, M. Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).
  4. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).
  5. Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).
  6. Allmann, S., Bringaud, F. Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).
  7. Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change. The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).
  8. Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei. Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).
  9. Mahon, M. J. Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).
  10. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
  11. Restriction digest v.2. , Available from: https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2 (2018).
  12. Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3. , Available from: https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3 (2021).
  13. Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).
  14. Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome. mSphere. 5 (1), e00744 (2020).
  15. Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis. Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).
  16. Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139 (2022).
  17. Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. 14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange. TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).
  18. Jankowski, A., et al. In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin. The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).
  19. Jankowski, A., Grinstein, S. A. A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils. The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).
  20. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  21. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  22. Lin, S., et al. Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei. The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).
  23. Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).
  24. Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania. Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 203
Måling av dynamiske glykosomale pH-endringer i levende <i>trypanosoma brucei</i>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Call, D., Pizarro, S. S., Tovey, E., … More

Call, D., Pizarro, S. S., Tovey, E., Knight, E., Baumgardner, C., Christensen, K. A., Morris, J. C. Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (203), e66279, doi:10.3791/66279 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter