Summary
我们描述了一种研究pH值如何响应非洲锥虫血液形式糖体中环境线索的方法。该方法涉及将pH敏感的可遗传蛋白传感器与流式细胞术相结合，以测量pH动态，既可以作为时程测定，也可以作为高通量筛选形式。
Abstract
葡萄糖代谢对非洲锥虫 布氏锥虫至关重要，它是寄生虫发育的重要代谢过程和调节剂。关于环境葡萄糖水平变化时产生的细胞反应知之甚少。在血流和前环形式（昆虫阶段）寄生虫中，糖体容纳了大部分糖酵解。这些细胞器在葡萄糖剥夺的作用下迅速酸化，这可能导致糖酵解酶（如己糖激酶）的变构调节。在以前的工作中，用于进行pH测量的化学探针的定位具有挑战性，限制了其在其他应用中的实用性。
本文描述了表达糖体定位pHluorin2（一种可遗传的蛋白质pH生物传感器）的寄生虫的开发和使用。pHluorin2 是一种比率 pHluorin 变体，在 395 nm 处显示 pH（酸）依赖性激发降低，同时在 475 nm 处产生激发增加。通过将 pHluorin2 开放阅读框克隆到锥虫表达载体 pLEW100v5 中来产生转基因寄生虫，从而在任一生命周期阶段实现诱导蛋白表达。免疫荧光用于确认 pHluorin2 生物传感器的糖体定位，将生物传感器的定位与糖体驻留蛋白醛缩酶进行比较。通过在一系列pH值范围为4至8的缓冲液中孵育细胞，在不同的pH值水平下校准传感器的响应性，我们以前曾使用这种方法来校准基于荧光素的pH传感器。然后，我们使用流式细胞术测量 405 nm 和 488 nm 处的 pHluorin2 荧光，以确定糖体 pH 值。我们验证了表达pHluorin2的活转基因寄生虫的性能，监测pH值随时间的变化以响应葡萄糖剥夺，这是PF寄生虫中糖体酸化的已知触发因素。该工具具有一系列潜在应用，包括可能用于高通量药物筛选。除了糖体pH值之外，该传感器还可以适用于其他细胞器或用于其他锥虫，以了解活细胞环境中的pH动态。
Introduction
与大多数生物体一样，寄生动质体依赖于葡萄糖作为中枢碳代谢的基本成分。该组包括具有重要医学意义的生物，例如非洲锥虫， 布氏锥虫; 美国锥虫， 克氏锥虫; 和 利什曼原虫 属的寄生虫。葡萄糖代谢对寄生虫在致病生命周期阶段的生长至关重要。例如，当被剥夺葡萄糖时，非洲锥虫的血流形式（BSF）会迅速死亡。值得注意的是，糖酵解是感染这一阶段ATP 的唯一来源 1。利什曼原虫寄生虫同样依赖于人类宿主中的葡萄糖，宿主巨噬细胞中的无鞭毛体生命周期阶段依赖于这种碳源的生长2。
虽然这些寄生虫具有不同的生活方式，涉及不同的昆虫媒介，但它们在如何反应和消耗葡萄糖方面有许多共同点。例如，这些寄生虫将大多数糖酵解酶定位到称为糖体的修饰过氧化物酶体中。这种动质体特异性细胞器与哺乳动物过氧化物酶体有关，基于保守的生物合成机制和形态 3,4,5,6。
大多数糖酵解途径酶的区室化为糖体提供了寄生虫特异性的途径调节手段。使用化学 pH 探针，我们确定营养剥夺触发原环形式 （PF） 寄生虫糖体的快速酸化，通过暴露关键糖酵解酶己糖激酶 7,8 上的变构调节剂结合位点导致糖酵解酶活性改变。在我们之前的工作中，化学探针需要不断输送才能使用，这限制了其在其他应用中的实用性。此外，维持 BSF 中糖体中探针分布的挑战限制了该方法在该生命阶段研究糖体 pH 值的效用。
在这项研究中，我们使用荧光蛋白生物传感器 pHluorin2 来监测 BSF 布氏锥虫 的糖体 pH 值变化，以响应包括葡萄糖饥饿在内的环境线索9 （图 1）。这项工作的结果表明，BSF T. brucei 以可逆的方式快速酸化糖体以响应饥饿，类似于我们在 PF 寄生虫中观察到的反应。我们预计这种生物传感器将提高我们对 布氏锥虫 和相关寄生虫糖酵解调节的理解。
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Protocol
使用 布氏布氏锥 虫 90-13 BSF 锥虫（一种单态寄生虫系）需要考虑安全性，因为它们被认为是风险组 2 生物，应在生物安全 2 级设施中处理。
1. 锥虫培养和转染
- 在 37 °C 的 5% CO210 中，在 HMI-9 培养基中培养布氏布氏锥虫 90-13 BSF 锥虫。
注意：为了保持培养物健康，请将细胞密度保持在 2 × 104 和 5 × 106 个细胞/mL 之间。 - 将 pHluorin2-PTS1 克隆到 pLEW100v5 中
- 商业合成 pHluorin2 开放阅读框，以产生具有编码双甘氨酸接头的 3' 延伸的基因，然后是三肽 AKL（PTS1 定位标签）。
- 通过限制性酶切将该构建体克隆到诱导型锥虫表达载体 pLEW100v5 中。使用 HindIII 和 BamHI11 双重消化含有 pHluorin2-PTS1 和 pLEW100v5 的克隆载体。执行纯化步骤，优选通过琼脂糖凝胶纯化，以去除限制性内切酶、不需要的克隆载体骨架和切除的荧光素酶含基因片段。
- 将携带 pHluorin2 的插入片段与 T4 DNA 连接酶12 连接到消化的 pLEW100v5 中。（有关克隆方案，请参见 补充图S1 ）。
- 通过下一代全质粒测序对质粒进行测序，以验证插入片段和载体是否正确连接，并且在克隆过程中 pHluorin2-PTS1 基因内未引入突变。
注意：完整的质粒序列已提交给 Addgene.org，并已分配#83680。 - 通过用40单位NotI消化使20μg质粒线性化;然后，使用参考的人 T 细胞试剂盒通过核转染到 BSF 90-13 寄生虫中（参见 材料表）。选择稳定集成，如 Burkard 等人 13 所述。
2. pHlourin2-PTS1的免疫荧光共定位
- 通过在H2O中用聚-L-赖氨酸0.1%（w / v）处理10分钟来制备显微镜载玻片。去除聚-L-赖氨酸溶液后，用PBS清洗载玻片一次。
- 为了诱导pHluorin2-PTS1表达，在收获前24小时用四环素或多西环素（1μg/ mL）以2×10 5 个细胞/ mL处理细胞。沉淀 2 × 106 亲本和诱导的 pLEWpHluorin2-PTS1 （pHL） 寄生虫通过离心（室温 [RT]，10 分钟，1,000 × g）并用 PBS 洗涤一次。
- 将细胞重悬于200μL新鲜制备的2%多聚甲醛PBS中，PBS由商业提供的16%EM级溶液制成。将固定剂中的细胞涂在载玻片上，让细胞沉降30分钟。用洗涤液（PBS中的0.1%正常山羊血清）洗涤粘附的细胞2次。
- 将透化溶液（PBS中的0.5%Triton X-100）施加到细胞上并孵育30分钟。取出透化溶液，用足量的洗涤液洗涤一次。
- 应用封闭溶液（10%普通山羊血清和0.1%Triton X-100的PBS溶液）并孵育30分钟。
- 在封闭溶液中稀释针对 布氏锥虫 醛缩酶 1：500 升高的抗血清并将其涂抹到细胞14.在室温下孵育1小时，用洗涤液洗涤载玻片5次3-5分钟。
- 在嵌段溶液中以1：1,000稀释山羊抗兔Alexa fluor 568并涂抹在细胞上。在室温下孵育1小时，用洗涤液洗涤载玻片5次3-5分钟。
- 涂上安装介质并将盖玻片密封到载玻片上。
- 用 100 倍物镜 （NA 1.4-0.7） 对细胞进行成像，并使用 ImageJ 分析图像。使用 ImageJ 的“Coloc 2”插件执行 Pearson 的共定位分析。有关代表性单元格字段，请参阅 补充图 S2 。）
- 若要完成此操作，请将图像文件添加到 Fiji，然后选择 “图像”。
- 将每个通道的亮度和对比度调整到不可见背景的点。
- 将图像从 16 位更改为 8 位，合并图像，然后裁剪为具有拆分通道的单个单元格。
- 在 “分析和协定位”下，选择 Coloc2 插件。选择 醛缩酶 （ 红色通道）作为 通道 1 ，选择 pHL （ 绿色通道）作为 通道 2 ，然后单击 确定 以启动 Pearson 相关性的计算。
3. 流式细胞术的样品制备
- 用四环素或多西环素（1μg/ mL）诱导pHL细胞过夜。
- 通过离心（室温，10分钟，1,000×g）沉淀细胞（~4×107 pHL和~1× 106亲本）。除去上清液并将细胞重悬于1 mL PBS中，含或不含10mM葡萄糖，具体取决于样品是饥饿还是未饥饿。对于时程测定，重悬于补充有10mM葡萄糖的PBS中，以防止细胞饥饿，直到洗涤完成。对于高通量筛选 （HTS） 测定，重悬于不含葡萄糖的 PBS 中，以尽量减少葡萄糖的残留;再重复洗涤两次。
- 第四次离心细胞，除去上清液，并将细胞沉淀重悬于PBS，PBS加5mM葡萄糖或PBS加10mM葡萄糖中，具体取决于处理。用 1 μg/mL 碘化丙啶 （PI） 或 100 nM 噻唑红 （TR） 补充样品，用于活/死测定。将每个样品转移到与流式细胞仪兼容的 5 mL 试管中。
4. 流式细胞术
注意：在包含以下激光器的流式细胞仪上准备实验：405nm（紫色），488nm（蓝色）和561nm（黄色）或638nm（红色）。有关下面讨论的通道的通用名称，请参阅 补充表 S1 。
- 要测量 pHL 荧光，请使用通道 KO525（VL2-H，激发 405 nm，发射 542/27 nm）和 FITC（BL1-H，激发 488 nm，发射 530/30 nm）。要区分活细胞和死细胞，请使用 PI 或 TR;在 YL2-H 通道上测量 PI（激发 561 nm，发射 620/25 nm）。测量 RL1-H 通道上的 TR（638 nm 激发，660/10 BP）。
- 要在流式细胞仪软件上设置实验，请创建以下图：1） YL2-H 通道直方图（如果使用 PI）或 RL1-H 通道直方图（如果使用 TR），2） FSC-A 与 SSC-A 点图，3） FSC-A 与 FSC-H 点图，以及 4） BL1-H 与 VL2-H 通道点图。
- 首先将未染色的WT（亲本细胞系）对照品放在样品进样口（SIP）上，然后将载物台抬高到位。开始在流速下采集流速流式细胞仪上的数据，以便有时间进行必要的调整。为避免对虚假碎片和死细胞进行评分，请在样品采集开始后 5 秒开始记录事件。
- 调整 YL2 或 RL1 电压，使主峰在 103-10 4 相对荧光强度 （RFI） 单位内。调整 FSC 和 SSC 电压，使 >90% 的事件符合点阵图。调整 FSC 阈值以排除碎片群，但不包括可能的细胞群。
- 调整 VL2 和 BL1 通道，使未染色 WT 对照的初级峰在 10 3-104 个 RFI 单位以内。
- 将第一个含有用 PI 或 TR 染色的诱导 pHL 的样品放在 SIP 上并将载物台提升到位。开始以最低流速采集数据，并仔细观察每个图中的事件。确保每个图中 >90% 的事件，并且没有事件使 VL2-H 和 BL1-H 通道饱和。
- 继续运行示例。确保每个样本至少记录 10,000 个事件。
- 将样本中的数据保存为 .fcs 文件格式并导出以供分析。
5. 流式细胞术结果的数据分析
注意：此数据分析工作流程使用 FlowJo 软件。如果使用其他流式细胞术分析软件，请继续使用适合软件的工具执行下述关键步骤。要可视化绘图和门控，请参阅 补充图 S3 和 补充图 S4。
- 打开新布局并打开在步骤 4.3 中获取的 .fcs 文件。将 .fcs 文件拖放到布局窗口中。
- 活细胞门。
- 双击未染色的WT对照，打开此样品的窗口。
- 在 YL2-H 通道（如果使用 PI）或 RL2-H（如果使用 TR）通道上以直方图形式查看数据。在它和用活性染料染色的样品之间切换，以识别活的和死的种群。
注意：所有事件都应未染色，因为该样品中未添加活性染料。 - 创建一个平分门，将活人口和死人口分开;将左门命名为 Live ，将右门命名为 Dead。将此门应用于所有样品，然后在样品之间切换，以确保为所有样品正确绘制此门。根据需要调整浇口。
- 细胞的门。
- 在未染色的 WT 控件上，双击 Live 门以查看该门中的事件。将点阵 图 x 轴 更改为 FSC-A ， 将 y 轴 更改为 SSC-A。
- 使用 面门工具 在像元群周围绘制门，并将其命名为 像元。注意排除碎片/垂死细胞（通常位于点图的最左侧和底部）和聚集体（点图的最右侧和顶部）。
- 将此门应用于所有样品的 实时 门下。在样品之间切换，以确保门包含所有样品的可能细胞群，并进行必要的调整。更改后，请务必将门重新应用于所有样品。
注意：FSC与SSC的饥饿和未饥饿条件下的细胞群分布显着变化;确保 Cell 门在所有条件下都包含细胞群。
- 用于单细胞的门，可提高pH测量的质量。
- 在未染色的 WT 对照上，双击 Cell 门以查看该门中的事件。将点阵 图 x 轴 更改为 FSC-A ， 将 y 轴 更改为 FSC-H。
- 在此点图上寻找单细胞的对角线分布，双峰在单峰群的右下方形成次级群（参见 补充图 S1 第三张图）。使用 面门工具，在单重态事件周围绘制一个门，不包括双峰种群。将此门命名为 Singlets。
- 对所有样品在细胞门下应用单线门。同样，在样本之间切换以确保门正确排除双峰群体，同时包括单峰群体。根据需要进行调整。
- 荧光pHL细胞的门。
- 在未染色的 WT 对照样品上，双击 Singlets 门以打开该群体的点图。将 x 轴 更改为 BL1-H ， 将 y 轴 更改为 VL2-H。
- pH传感器pHluorin2在VL2和BL1中均呈荧光。使用 多边形门工具 绘制一个斜形门，该门延伸到点阵图左下角的自发荧光群体的顶部和右侧。将此门命名为 pHL+。
- 对所有样品在 Singlets 门下应用 pHL+ 门。切换到 pHL 样品并调整门以包括 VL2-H 和 BL1-H 中荧光强度高于 WT 对照的事件。确保该门包含所有样品的荧光群体，因为该群体的位置将随着糖体pH值的变化而移动。
注意：pHL+种群的这种微小但可见的变化是由于荧光团激发光谱的pH依赖性变化。
- 导出统计信息。
- 点击 表格编辑器 |编辑栏 |添加列 以添加要导出的新统计信息。
注意：对于要导出的每个统计数据，选择相应的统计数据以及要从中导出的总体。请务必为适用的统计数据（如中位数）选择适当的参数。保持样品不变。 - 添加包含以下统计信息的列： 总（未添加）计数、pHL+ 计数、总计的实时频率（基于总事件的百分比）、父项的 pHL+ 频率（基于父门的百分比）、pHL+ VL2-H 中位数和 pHL+ BL1-H 中位数。
- 单击 “表格编辑器 ”并更改以下导出设置：“ 显示 到 文件 ”和 “文本 到 CSV ”，然后选择 文件目标 和 名称。单击 “创建表”。
- 点击 表格编辑器 |编辑栏 |添加列 以添加要导出的新统计信息。
- 计算荧光比。
- 将导出的 .csv 文件另存为电子表格文件。
- 通过比较实验中所有样品的以下内容来执行质量控制分析：每个样本的事件数、实时事件的百分比和 pHL+ 事件的百分比。根据实验，在条形图或散点图中直观地比较这些。
- 将新列标记为 pHL+ 中位数 VL2/BL1。对于每个样品，将中值 VL2-H 值除以中值 BL1-H，如公式 （1） 所示。
（一）
- 使用统计分析软件使用荧光比进行统计分析。
（一）6. pH生物传感器校准
注意：要将测得的荧光比转换为pH单位，请使用尼日利亚霉素和缬氨霉素校准表达pHL的细胞。Nigericin 是一种 K+/H+ 反转运蛋白，一种离子载体，当缓冲液15 中有足够的 K+ 时，它可以平衡跨膜的 pH 值。尼日利亚菌素通常用于校准pHluorin和其他pH传感器16,17。由于先前使用10μM尼日利亚霉素18校准过氧化物异构定位的pHluorin，因此我们选择用该浓度进行处理。缬霉素是一种钾离子载体，已用于（在 4 μM 处）平衡线粒体膜的 pH 值19。我们使用 10 μM 缬氨霉素通过确保 K+ 离子在膜上平衡来辅助尼日利亚霉素的 pH 平衡活性。虽然我们使用了尼日利亚素-缬氨霉素组合，但尼日利亚霉素可能足以平衡细胞器pH值。
- 制备八种通用校准缓冲液（UCB;15 mM MES、15 mM HEPES 和 130 mM KCl），每种溶液的 pH 值范围为 5 至 8.5。
- 离心机（室温，10分钟，800-1,000× g）8个独立的2mL表达pHL的BSF培养物（~4×106 个细胞）。
- 除去上清液，然后将每个细胞沉淀重悬于不同pH值的UCB中。
- 引入尼日利亚霉素和缬氨霉素，各至10μM。 PI中的峰值至1μg/ mL。
- 将细胞在每种溶液中孵育15分钟。
- 在流式细胞仪上运行每个样品以测量荧光比，如步骤4-5所述。
- 再重复该实验两次，以获得每个pH值的三个生物学重复。以 .fcs 格式导出数据。
- 按照步骤 5.1 到 5.8 中所述分析 .fcs 文件。使用每个pH值的测得荧光比，在未来的实验中使用公式（2）插入糖体pH值。
(2)
注： 补充图 S3 显示了点图和门控方案。结果可在 补充表S2中找到。下面介绍如何使用GraphPad Prism从荧光比值中插值pH值。如果使用其他统计软件，请遵循相同的关键步骤。- 打开 GraphPad Prism 并创建一个包含三个 y 重复的 XY 表。将pH值粘贴到x柱中，将其相关的荧光比值粘贴到y柱中。
- 单击与表关联的图表。查看图表时，单击“分析”功能区下的“分析”|”在 XY 分析下插值标准曲线。
- 选择 Sigmoidal、4PL、X 是 log（浓度）， 因为 pH 单位采用对数刻度。顶部和底部参数是估计的顶部和底部平台。选择 “不对异常值进行特殊处理”。
注意：软件将寻求将数据拟合到公式 （2） 和步骤 6.9.3 中描述的模型。在结果表和图表上的曲线中查找缺乏拟合的证据。 - 要从其他实验中的荧光比中插入pH值，请转到包含pHL校准数据的表格。将荧光比值粘贴 到y柱中校准数据下方。给每个 y 值一个标题，但将 x 值（pH 值）留空，因为它是未知的。
- 在 “结果库”中，单击 插值分析 ，然后转到“ 插值 X 重复 ”选项卡。查找将与输入的荧光比值一起列出的插值pH值。
注意：该软件使用从校准数据中找到的模型和最佳拟合参数值，根据荧光比插值 pH 值，用于 pH 值未知的实验。
(2)7. 葡萄糖饥饿和加回时间过程
- 如步骤1.1所述，用在37°C孵育的1μg/ mL多西环素诱导15mL BSF pHL寄生虫过夜。
- 在补充有 10 mM 葡萄糖的 PBS 中洗涤 15 mL 诱导的 pHL 培养物。重复此步骤 3 次。
- 同时，如步骤3.2所述，在PBS 3x中洗涤3mL WT培养物。
- 第一次洗涤后，当pHL样品重悬于1mL PBS中时，取出0.1mL等分试样的pHL细胞悬液以保持在10mM葡萄糖中作为未饥饿的对照。
- 最终洗涤后，将pHL样品重悬于补充有1μg/ mL PI的PBS中。
- 获取流式细胞术数据
- 根据实验和样品的不同，每5、10、30或90分钟在流式细胞仪上测量每个样品，开始监测饥饿和未饥饿样品的糖体pH值。如步骤 4.1 至 4.3 中所述获取流式细胞术数据，确保事先准备好电压和图。
- 首先在0分钟时运行未染色的WT对照。
- 从0分钟开始，每90分钟在细胞仪上运行一次未饥饿的对照样品。对于饥饿时程测定，从 0 分钟开始每 10 分钟运行一次饥饿样品。对于葡萄糖加回测定，在0,5,10,20,30,60和90分钟运行饥饿样品;然后，在引入葡萄糖后重复。
- 在90分钟的饥饿时间过程和180分钟的葡萄糖添加时间过程中在室温下孵育样品。
- 按照步骤 5.1 到 5.8 中所述分析 .fcs 文件。
注意： 补充图 S4 显示了如何执行门控以及点图应该是什么样子。 补充表 S3 和 补充表 S4 分别显示了葡萄糖饥饿时程测定和葡萄糖加回时程测定的结果。
8. 优化药物筛选检测
- 如前所述，在 PBS 中以大约 2 × 106 个细胞/mL 的速度洗涤约 32 mL 表达 pHL 的 BSF 寄生虫和 3 mL 的 WT 细胞。
注：每孔需要记录超过 10,000 个事件，以最大限度地减少测得荧光比的变异性并准确测量 Z 因子统计量。实现此目的所需的最小培养物约为 26 mL，但为了便于处理，我们建议使用 32 mL。- 第一次洗涤后，将pHL样品均匀地分离到两个微量离心管中。
- 洗涤后，将一个 pHL 样品重悬于含有 5 mM 葡萄糖、0.1% DMSO 和 TR 的 18 mL PBS 中，将另一个 pHL 样品重悬于 18 mL PBS 加 0.1% DMSO 和 TR 中。
注意：DMSO用于模拟药物筛选中的缓冲液组成，因为化合物通常溶解在DMSO中。 - 将这两种细胞溶液转移到 12 孔储液槽中，每孔 9 mL。
- 使用移液机器人将细胞溶液移液到384孔板的分半孔中，每孔80μL。
- 将板在室温下孵育1.5小时，轻轻摇晃并用铝箔包裹，以保护荧光团免受光照。
- 在能够运行 384 孔板的流式细胞仪上运行板。
注意：以下工作流程适用于配备 Cytkick Max 自动进样器的 Attune NxT。如果使用其他流式细胞仪，请继续执行关键步骤。- 对于板，以最快的流速 （1,000 uL/min） 运行并启用 升压模式。采集 20 μL/孔。在每个孔之间包括一个混合循环和一个漂洗循环。
- 按照步骤 4.1.3 中的说明创建绘图。
- 按照步骤 4.1.3 和 4.1.4 中的说明运行未染色的 WT 管控制并优化电压。运行饥饿的 pHL 管样品并优化 VL2 和 BL1 电压，如步骤 4.1 中所述。
- 开始在流式细胞仪上采集板。水平运行板，使饥饿和未饥饿的样品孔之间没有明显的采集时间差异。确保在~1.5小时内完成板采集。
- 导出 .fcs 文件并按照步骤 5.1 到 5.8 中所述分析数据。求用葡萄糖 （Glc） 或无葡萄糖 （饥饿） 处理的样品的荧光比的平均值 （AVG） 和标准差 （SD）。
注意：我们的 Z 因子实验数据可以在 补充表 S5 中找到。 - 使用公式 （3） 计算 Z 因子20 统计量。
（3）
（3）
图 1：活 BSF 锥虫中糖体 pH 值评分方法图。 （A） 表达糖体定位的 pHluorin2 传感器的细胞系的描述。包含过氧化物酶体靶向序列可控制定位。注意：我们预计消除 PTS-1 将导致胞质定位，从而允许将来分析该亚细胞区室中的 pH 值。（B） 传感器验证分析的描述。缩写：BSF = 血流形式。 请点击这里查看此图的较大版本.
注意：Z因子统计量用于确定测定对HTS的适用性。0.5 和 1.0 之间的值通常意味着 HTS 的检测质量是可接受的。
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Representative Results
pHLuorin2-PTS1 定位于 BSF 布氏锥虫中的糖体
为了评估pHluorin2-PTS1的亚细胞定位，寄生虫进行了免疫荧光测定。来自转基因的信号与抗血清共定位，针对糖体驻留蛋白醛缩酶（Tb醛缩酶）（图2A）。抗Tb醛缩酶与pHluorin2-PTS1共定位的平均Pearson相关系数为0.895，表明pHluorin2-PTS1主要定位于糖小体。随着 pHluorin2-PTS1 定位于糖体，我们继续研究 BF 糖体 pH 值。
图 2：pHluorin2-PTS1 定位到 BSF 布氏锥虫糖体的定位。 （A） pHluorin2-PTS1 与糖体驻留蛋白 TbAldolase 的共定位。用 pLEWpHluorin2-PTS1 转染 BF 90-13 寄生虫，用多西环素 （1 μg/mL） 诱导表达。使用抗 TbAldolase 血清定位 TbAldolase，然后用山羊抗兔 Alexa fluor 568 孵育。平均 Pearson 相关系数为 0.895（30 个细胞）。（B） BSF 布氏锥虫中 pHluorin2-PTS1 的校准。比例尺 = 4 μm。缩写：BSF = 血流形式。 请点击这里查看此图的较大版本.
pHluorin2-PTS1校准
pH 值的变化会改变 pHluorin2-PTS1 的激发光谱。在中性pH下，pHluorin2-PTS1在405 nm处的激发大于488 nm处的激发;当 pH 值下降时，反之亦然 9,21。为了通过流式细胞术测量糖体的相对pH值，我们测量了405 nm激光激发时的发射（VL2通道）和488 nm激光激发时的发射（BL1通道），使用VL2/BL1（荧光比）的比率来测量相对糖体pH值。为了将荧光比转换为pH值，我们使用离子载体缬氨霉素和尼日利亚霉素17,18将细胞内和糖体pH值与细胞外pH值平衡，然后进行流式细胞术分析以找到荧光比。正如预期的那样，随着细胞外pH值的增加，荧光比增加，细胞内Kd为pH 6.5（图2B）。该 Kd 略低于 pHluorin29 的体外 Kd。有趣的是，在葡萄糖存在下，BSF糖体pH值为~pH 8.0，这比葡萄糖22存在下的PF糖体更碱性。在随后的实验中，我们使用该校准曲线将荧光比转换为pH值。
葡萄糖饥饿导致的糖体酸化
虽然 布氏锥虫 PF 寄生虫在缺乏葡萄糖22 时会酸化其糖体，但 BSF 糖体对葡萄糖的反应尚不清楚。为了探索这一点，我们在PBS和10mM葡萄糖中洗涤表达pHluorin2-PTS1的BSF寄生虫以除去培养基，然后在没有葡萄糖的PBS中重悬细胞。立即测量传感器对这种扰动的响应，然后通过流式细胞术每 10 分钟测量一次，持续 1.5 小时。将反应与PBS加10mM葡萄糖（未饥饿）中的细胞进行比较。
为了应对饥饿，我们观察到随着时间的推移逐渐轻度酸化，并在~90分钟时趋于稳定（图3A）。糖体pH值的这种变化具有统计学意义（p < 0.0001），并且在三个单独的实验中可重复。这表明BSF细胞在缺乏葡萄糖时会轻度酸化其糖体，类似于在PF生命阶段9中观察到的反应。
图3：BSF 布氏锥虫 糖体在缺乏葡萄糖时的可逆酸化。 （A） 在没有葡萄糖（饥饿，蓝色）或存在葡萄糖（未饥饿，红色）的情况下生长的细胞的糖体 pH 值。在Attune NxT流式细胞仪上首次测量之前~2分钟，将饥饿的细胞重悬于不含葡萄糖的PBS中。对时间过程进行了三次生物学重复。将未饥饿的寄生虫在PBS加10mM葡萄糖中孵育。对饥饿和未饥饿的 90 分钟时间点进行非配对双尾学生 t 检验，***p = 0.0001。（B） 糖体 pH 值变化的时程饥饿（蓝色）和未饥饿（红色）BSF 寄生虫，在 90 分钟时重新引入 10 mM 葡萄糖（绿色虚线）。对时间过程进行了五次生物学重复。NS = 不显著（p = 0.25，未配对的双尾学生 t 检验）。 请点击这里查看此图的较大版本.
响应葡萄糖的可逆糖体酸化
接下来，我们通过使细胞挨饿然后重新引入葡萄糖来测试BSF糖体酸化是否可逆。寄生虫在没有葡萄糖的情况下孵育90分钟。然后加入葡萄糖（10mM），并通过细胞术再测量90分钟的传感器响应（图3B）。我们观察到，重新引入葡萄糖后，糖体 pH 值在 ~30 分钟内恢复到饥饿前的水平。这些结果表明，BSF糖体pH值是动态的，并且可以对葡萄糖进行调节，类似于在PF寄生虫中观察到的pH值响应。
pHluorin2 检测方法用于高通量药物筛选的调整
糖小体是锥虫的重要细胞器，因为它们具有关键的代谢途径。糖小体的重要性表明，其体内平衡抑制剂有望成为潜在的治疗线索。在这里，我们将糖体pH值的测定调整为高通量形式，这将允许适应药物筛选以识别糖体pH值的抑制剂。鉴于已知 pH 值对糖体驻留蛋白功能的影响，我们预计这种反应的调节中断可能对寄生虫有害 7。
为了建立高通量形式，我们对检测的稳定性进行了评分。为了完成此操作，将诱导表达pHluorin2-PTS1的寄生虫接种在384孔微量滴定板中，在5mM葡萄糖（高对照）或无葡萄糖（低对照）中，然后在室温下孵育90分钟。然后通过流式细胞术分析板。如 图 4 所示，重复测量之间的变异性较低，高对照和低对照很好地分离，这些特征导致可接受的 Z 因子为 0.645。通常认为>值为 0.5 的检测方法足够可靠，可以适应高通量筛选活动。鉴于这方面的成功，我们预计这种传感器和方法将用于未来的高通量药物筛选。
图 4：用于评估 pHluorin2-PTS1 传感器携带 BSF 对未来 HTS 活动的适用性的测定。 将细胞与葡萄糖（高对照，红色，5 mM葡萄糖）或不含己糖（低对照，蓝色，无额外葡萄糖）一起孵育90分钟。计算出的Z因子为0.645。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 S1：将 pHluorin2-PTS1 基因克隆到可诱导的 布氏锥虫 表达载体 pLEW100v5 中。 （A） 两种载体均采用 HindIII 和 BamHI 双限制性消化，然后纯化。使用 T4 DNA 连接酶将 pHluorin2-PTS1 基因片段连接到 pLEW100v5 中。（B） pLEW100-pHlourin2-PTS1。 请点击此处下载此文件。
补充图 S2：pHL 与转染 pLEWpHluorin2-PTS1 的 TbAldolase BF 90-13 寄生虫的共定位。 用多西环素 （1 μg/mL） 诱导表达。使用抗 TbAldolase 血清（以 1：500 的面色稀释）定位 TbAldolase，然后与山羊和 G-rabbit Alexa fluor 568 孵育。平均 Pearson 相关系数为 0.895（30 个细胞）。比例尺 = 10 μm。 请点击此处下载此文件。
补充图 S3：以 pH 8 校准缓冲液样品为例，用于校准 BSF pHL 传感器细胞系的代表性门控图和点图。 用活性染料PI对样品进行染色，以评估pH值如何影响YL2-H通道的活力，但活力未用于门控方案。FSC-A 与 SSC-A 的宽栅极用于细胞的栅极，因为校准中使用了活细胞和死细胞。对细胞进行门控后，使用 FSC-A 与 FSC-H 对单细胞（单胞体）进行门控。最后，对 BL1-H 和 VL2-H 通道中 pHL 的荧光事件使用严格的门。缩写：BSF = 血流形式;PI = 碘化丙啶;FSC-A = 前向散射峰面积;SSC-A = 侧向散射峰面积;FSC-H = 前向散射峰高度。 请点击此处下载此文件。
补充图 S4：葡萄糖饥饿和加回时间过程测定的代表性门控图和点图。 以饥饿的 0 分钟样本为例。由于使用了 PI，活细胞在 YL2-H 通道上设门。使用 FSC-A 与 SSC-A 对细胞进行门控，以排除碎片和聚集体。使用 FSC-A 与 FSC-H 对单线体进行门控。通道 BL1-H 和 VL2-H 用于对 pHL+ 事件进行门控。在设置此门时，WT 对照用于排除自发荧光事件。缩写：PI = 碘化丙啶;FSC-A = 前向散射峰面积;SSC-A = 侧散射峰面积。 请点击此处下载此文件。
补充表S1：用于流式细胞术的通道和通用名称。 提供了通道名称、通用名称以及使用的激光和发射滤光片。 请点击此处下载此文件。
补充表S2：在不同pH缓冲液中使用尼日利亚霉素和缬氨霉素进行pHL校准的结果。 此表包括从 .fcs 文件的 FlowJo 分析中导出的统计信息。这些值用于找到用于校准pHL的荧光比（VL2-H/BL1-H），如 图2所示。这些pH校准结果还用于对葡萄糖饥饿和加回时程实验的pH值进行插值（图3）。以下统计量用于质量控制：总事件计数、pHL+ 计数、PI- （%）、PI+ （%） 和 pHL+ （%）。每个生物重复的数据位于单独的选项卡中，标有“汇总结果”的选项卡包含每个 pH 处理和重复的荧光比。 请点击此处下载此文件。
补充表S3： 图3A所示的BSF pHL葡萄糖饥饿时程测定的分析数据。 此表包括从 FlowJo 软件中分析的 .fcs 文件中导出的统计数据。荧光比值是通过取中位VL2-H和中位BL1-H（均来自pHL+群体）的比值来计算的。这些比率在标有“汇总结果”的选项卡中编译。PI-（%）用于确定葡萄糖饥饿对生存能力的影响。总计数和pHL+计数用于质量控制。 请点击此处下载此文件。
补充表S4： 图3B所示的BSF pHL葡萄糖加回时程测定的分析数据。 此表包含从 FlowJo 软件中分析的 .fcs 文件导出的统计信息。pHL+ VL2/BL1 中位数值是根据 Excel 中的 pHL+ 中位数 VL2-H 和 BL1-H 计算得出的。其他统计数据用于质量控制。 请点击此处下载此文件。
补充表 S5：使用 pHL 对 Z-Factor 试验高通量筛选测定的 FlowJo 分析得出的数据。 标有“0 mM 葡萄糖”（低）和“5 mM 葡萄糖”（高）的标签分别包括来自用 0 或 5 mM 葡萄糖处理的细胞的数据。这些荧光比如 图4所示。在“合并分析”选项卡中，编译了两种处理的荧光比，并计算了每种处理的样品（SD）的平均值和标准偏差。使用公式 3 计算 Z 因子统计量。计算平均最高价/最低价的比率以衡量均值的分离。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
对非洲锥虫的环境感知和反应机制知之甚少。众所周知，营养可用性的变化会引发寄生虫的各种反应，包括糖体的酸化。在这里，我们描述了一种使用可遗传蛋白质传感器、pHluorin2 和流式细胞术研究活细胞中糖体 pH 值对环境扰动的反应的方法。
传感器的使用有几个关键步骤。首先，表达转基因的转染寄生虫的表征很重要，因为表达可能存在细胞间差异。一些转基因的表达水平会随着时间的推移而下降。虽然迄今为止尚未在携带pHluorin2的细胞中观察到这一点，但如果传感器反应性变得高度可变（例如，诱导后，传感器信号不稳健），则可能需要克隆培养物，因为某些群体成员可能比其他成员表达更高的蛋白质水平。或者，再转化和选择已被证明可用于生成具有更高（尽管可能是瞬时）表达的新细胞系。如果需要重新转染，我们建议克隆单个品系，因为目的转基因的表达可能会带来微妙的生长劣势，导致群体中高表达者随着时间的推移而丢失。
此外，在测定期间和常规维持培养物时，监测寄生虫活力也很重要。为此，我们在测定过程中加入了 PI 或噻唑红，这些报告基因确保数据仅反映活细胞中的反应。确保正常培养期间的细胞倍增时间是恒定的，特别是在开始大规模检测（例如，HTS 型检测）之前，可以限制对未茁壮成长的细胞启动检测的担忧，这可能会对高低对照信号产生负面影响，并影响筛选的整体稳定性。
我们在这里描述的测量糖体pH值的方法稳健而灵敏。但是，该方法存在局限性。首先，需要使用具有适当功能的流式细胞仪，包括能够接受微量滴定板的采样器。虽然可以通过荧光显微镜收集比率数据，但以这种方式分析的样品数量有限，限制了筛选（和基于时程的测定）等方法的实用性。
第二个潜在的局限性是，这些检测涉及生物安全问题。装有工作所需仪器的核心设施可能不允许活的寄生虫出现在他们的设备上。这些局限性，以及产生和维持转基因锥虫的技术挑战，可以通过在寄生虫生物学和细胞分析方面具有适当专业知识的小组之间的合作来克服。
这里描述的工作重点是在非洲锥虫中使用糖体pH传感器，但该工具可以适用于其他动质体寄生虫。虽然目前尚不清楚细胞器的酸化在利什曼原虫属的生物学中可能起什么作用。或克氏锥虫，鉴于寄生虫特异性表达载体可用，并且糖体输入机制在生物体中相似，pHLuorin2-PTS1 是否有可能在细胞中表达为转基因 5,23,24。
携带传感器的细胞的一个潜在应用是鉴定改变细胞酸化糖体能力的小分子。这些可能对寄生虫有害，因为已发现改变的pH值是调节己糖激酶的一种可能手段，己糖激酶是一种糖体驻留蛋白，在非洲锥虫的致病生命周期阶段至关重要7。这里描述的测定方法已经适应了高通量（图4），允许对这种活性的大量化学收集进行询问。
总之，该工具提供了剖析寄生虫特异性细胞器中动态反应所涉及的机制的机会。将传感器谱系与正向和反向遗传学相结合，可能会识别出独特的寄生虫特异性途径。此外，传感器系列为识别反应的小分子抑制剂提供了机会，为发现新的药物靶点打开了大门。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
pHluorin2-PTS1 由 Twist Bioscience 克隆到 pLEW100v5 中，Twist Bioscience 在高拷贝克隆载体中提供了该构建体;pLEW100v5 是 George Cross 博士的礼物。针对 布氏锥虫 醛缩酶的抗血清可应要求从克莱姆森大学的 Meredith T. Morris 博士处获得。JCM和KAC实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（R01AI156382）的部分支持。SSP 由 NIH 3R01AI156382 支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistical software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
| For pH calibration | |||
| For pH calibration |
References
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