Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65906
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1,3,4
1Department of Microbiology and Immunology, Life Sciences Institute, University of British Columbia, 2Department of Biology, San Diego State University, 3School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 4Humans and the Microbiome Program, Canadian Institute for Advanced Research

Summary

Bakterileri enfekte eden virüsler olan bakteriyofajlar (fajlar), bağırsak mikrobiyomunun ayrılmaz bir bileşenidir. Bu simbiyotik sakinler bakteriyel zindeliği ve popülasyon dinamiklerini yönlendirse de, bağırsak homeostazını ve hastalığını nasıl etkiledikleri hakkında çok az şey anlaşılmıştır. Bu protokol, diğer faj-bakteri çiftlerine uyarlanabilen bir fare modeli içinde izole edilmiş T4 fajlarını inceler.

Abstract

Bakteriyofajlar (fajlar), bakterileri tür ve suş düzeyinde özgüllükle enfekte eden virüslerdir ve bilinen tüm ekosistemlerde en bol bulunan biyolojik varlıklardır. Bağırsak mikrobiyotasında bulunanlar gibi bakteri topluluklarında fajlar, mikrobiyota popülasyon dinamiklerini düzenlemede ve bakteri evrimini yönlendirmede rol oynar. Son on yılda, kısmen, antimikrobiyal dirençli bakterilerin artan tehdidine karşı koymak için umut verici bir araç sunan litik fajların konakçıya özgü öldürme yetenekleri nedeniyle, faj araştırmalarına olan ilgi yeniden artmıştır. Ayrıca, fajların bağırsak mukusuna yapıştığını gösteren son çalışmalar, altta yatan epitele bakteri istilasını önlemede koruyucu bir role sahip olabileceklerini düşündürmektedir. Daha da önemlisi, bakteriyel mikrobiyomlar gibi, bozulmuş fageomlar, inflamatuar bağırsak hastalığı gibi hastalıklarda kötüleşen sonuçlarla ilişkilendirilmiştir. Önceki çalışmalar, fajların dışkı süzüntüsü nakli yoluyla hayvanların ve insanların mikrobiyomunu modüle edebildiğini ve konakçının sağlığına fayda sağladığını göstermiştir. Bu son araştırma dalgasıyla birlikte, bağırsak mikrobiyomu bağlamında fajları incelemek için protokoller oluşturma ve standartlaştırma gerekliliği ortaya çıkıyor. Bu protokol, izole edilmiş T4 fajlarını ve bakteriyel konakçıları Escherichia coli'yi murin gastrointestinal sistemi bağlamında incelemek için bir dizi prosedür sağlar. Burada açıklanan yöntemler, bir faj lizatından nasıl başlanacağını, farelere nasıl uygulanacağını ve bakteri konakçısı ve faj seviyeleri üzerindeki etkilerin nasıl değerlendirileceğini özetlemektedir. Bu protokol değiştirilebilir ve diğer faj-bakteri çiftlerine uygulanabilir ve konak-faj dinamiklerini in vivo olarak incelemek için bir başlangıç noktası sağlar.

Introduction

Bakteriyofajlar veya fajlar, tür ve suş düzeyinde özgüllük1 ile bakterileri enfekte eden ve öldüren virüslerdir. Fajlar, popülasyon dinamiklerini düzenlemede ve bakteriyel uygunluğu yönlendirmede rol oynadıkları bağırsak mikrobiyotası gibi karmaşık bakteri topluluklarında önemli roller oynarlar2. Son on yıl boyunca, antimikrobiyal dirençli patojenlerin3 yükselişi ve alternatif bir tedavi stratejisi olarak faj tedavisinin potansiyeli nedeniyle faj araştırmalarına olan ilgi yeniden artmıştır. Son yıllarda, litik faj kokteylleri, insanlarda ciddi, antibiyotiğe dirençli bakteriyel septik enfeksiyonlarda bir miktar başarı ile intravenöz olarak kullanılmıştır 3,4. Oral faj tedavisi, bağırsak enfeksiyonlarını ve iltihabı tedavi etmek için antibiyotiklere potansiyel bir alternatif olarak da önerilmiştir. Ayrıca, fajlar, tekrarlayan Clostridioides difficile enfeksiyonu (rCDI)5,6, inflamatuar bağırsak bozuklukları (IBD)7,8 ve erken doğmuş domuzlarda nekrotizan enterokolit tedavisinde bakterileri uzaklaştırmak için filtrelenmiş dışkı mikrobiyota preparatları olan dışkı süzüntü nakillerinin(FFT) başarısında rol oynamıştır. Bu sonuçlar göz önüne alındığında, hem fajlar ve bağırsak mikrobiyotası hem de fajlar ve memeli konakçı arasındaki etkileşimleri dikkate almak önemlidir, çünkü önceden var olan bir topluluğa yeni fajların eklenmesi, yalnızca hedef bakteriler üzerinde değil, bir bütün olarak topluluk üzerinde dolaylı etkilere sahip olabilir 2,10.

Fajların hedef bakterilerle etkileşimlerinin in vitro olarak incelenmesinin, bağırsaktaki faj ve bakteri etkileşimlerinin mekanizmalarını ve etkilerini anlamak için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu ortamda, Caudovirales takımının Escherichia coli'ye özgü T4 fajlarının, bağırsak mukusunayapışmak için virion yüzeyindeki yüksek antijenik dış kapsid (Hoc) proteinleri içinde yer alan immünoglobulin (Ig) benzeri alanlara ihtiyaç duyduğu gösterilmiştir 11. Ek olarak, transwell deneyleri, T4 fajlarının epitel hücre kültürleri ile etkileşime girebildiğini ve makropinositoz12,13 ile hücre katmanları boyunca yer değiştirebildiğini göstermiştir. Bu sonuçlar, fajların ökaryotik hücreleri enfekte edemeseler bile metazoan konakçılarıyla etkileşime girebilecekleri hipotezini desteklemektedir. Bu modeller, yararlı olmakla birlikte, fajlar, bakteriler ve metazoan konakçı arasındaki üçlü etkileşimin kapsamlı bir şekilde araştırılması için gerekli olan bir bağırsak ekosisteminde meydana gelen tüm karmaşık etkileşimlerden yoksundur.

Fare modelleri, karmaşık ortamlarda fajları araştırmak için önemli bir araçtır. Faj uygulamasının arzu edilen bir uygulaması, IBD dahil olmak üzere kronik enflamatuar hastalıklarla ilişkili antimikrobiyal dirençli enfeksiyonları veya patobiyonları tedavi etmek için alternatif bir stratejidir. Bununla birlikte, ortaya çıkan literatür, in vitro faj davranışının in vivo fonksiyonları tam olarak temsil etmediğini göstermektedir. Buttimer ve ark.14, bir faj kokteylinin, basitleştirilmiş bir insan mikrobiyota konsorsiyumunda hedeflenen bakterileri in vitro olarak tüketebildiğini, ancak aynı bakteri-faj konsorsiyumu ile kolonize edilen gnotobiyotik farelerde in vivo olarak çoğaltılamadığını gösterdi. Ayrıca, geleneksel bir fare mikrobiyomunda, T7 fajı, hedef bağırsak bakterilerinin seçici olarak tükenmesine yol açtı, ancak zaman içinde kademeli iyileşme gözlendi, bu da gelişmiş direncingöstergesi 15. Diğer çalışmalar, oral yoldan uygulanan fajların ve hedef bakteri suşlarının in vivo 2,16 bir arada bulunduğunu göstermiştir. Gerçekten de, faj/bakteri birlikteliğinin ötesinde, faj uygulaması genel mikrobiyota topluluğu bileşiminde ve işlevinde yaygın değişikliklere yol açmıştır 2,16. Bu, hastalık ortamlarında önemlidir, çünkü birkaç çalışma, Caudovirales'in nispi bolluğunun artması ile IBD 7,8,17 arasında bakteri bolluğundaki değişikliklerden bağımsız olarak ilişkiler bulmuştur7. Bunun hastalık patogenezinin bir itici gücü mü yoksa bir sonucu mu olduğu bilinmemektedir.

Faj araştırmasının tarihsel odak noktası, bir faj ile hedef bakteri arasındaki ilişki etrafında olmuştur. Bununla birlikte, faj ile metazoan konağın mukozası, epiteli ve bağışıklık sistemi arasındaki potansiyel etkileşimleri dikkate almak da önemlidir. Bu etkileşimlerin tümü, bağırsak faj enfeksiyonuna verilen genel yanıtta önemli bir rol oynar. Bunu göstermek için, mikrobiyota8'in müdahalesi olmadan bağışıklık sistemi üzerindeki etkilerini aydınlatmak için mikropsuz (GF) fareler kullanılarak fajlar incelenmiştir. Bu sistemde, faj nükleik asitleri, fagositik immün hücrelerin (makrofajlar ve dendritik hücreler) endozomları içinde bulunan Toll benzeri reseptörler (TLR'ler) tarafından tespit edildi. Bu, aşağı akış sinyalini aktive etti ve T hücresine bağlı interferon (IFN)-γ8 veya tip I IFN'ler18 üretimini uyardı. Ayrıca, Fluckiger ve ark.19, faj kodlu (kehanet) antijenlerin tanınmasında bellek CD8+ T hücrelerini kullandılar, bu da tümör antijenleri ile T hücresi çapraz reaktivitesi ile sonuçlandı ve bu da tümör yükünün azalmasına neden oldu. Son olarak, fajlara özgü antikor üretimi, fajların hayvan modellerine içme suyu 8,20 yoluyla sürekli olarak verildiğiveya birkaç ay boyunca tekrarlanan oral gavaj yoluyla20 faj proteinlerinin humoral bağışıklık tepkilerini destekleme kapasitesini gösterdiği fare çalışmalarında belgelenmiştir. Bu faj aşılama modları, bağışıklık sisteminin optimal ve sürekli olarak hazırlanmasına izin verse de, fajlar ve bağırsak ortamı arasında doğal olarak meydana gelen etkileşimleri veya oral yoldan uygulanan faj tedavisinin kinetiğini temsil etmeyebilirler. Şimdiye kadar, sınırlı sayıda çalışma, monokolonize fare modellerinde fajın tek bir bakteri türüyle etkileşimlerini incelemiştir21. Bununla birlikte, monokolonize fareler, bireysel türlerin gastrointestinal (GI) sistem ve bağışıklık gelişimi 22,23,24 üzerindeki mikroplara özgü etkilerinin deşifre edilmesinde kritik olduğunu kanıtlamıştır ve fajlar, hedef bakterileri ve metazoan konakçı arasındaki üçlü etkileşimleri anlamada yararlı olabilirler.

Heyecan verici bir şekilde, bağırsak fajı ve bağırsak kommensal bakterileri arasındaki etkileşimlerin yanı sıra metazoan konakçı ile içinde bulunan fajlar arasında meydana gelen etkileşimler hakkında öğrenilecek çok şey var. Bu protokol, bir gnotobiyotik fare modeli kullanarak izole edilmiş T4 fajını ve bakteriyel muadili E. coli'yi (K-12, BW25113) incelemek için bir dizi prosedür sağlar. Bu standartlaştırılmış prosedürler ayrıca, büyüme parametrelerini ilgilenilen çiftlere uyarlayarak diğer faj/bakteri çiftlerini optimize etmek için bir temel sağlar. Burada açıklanan yöntemler şunları özetlemektedir: (1) Farelerin oral gavajı için T4 faj ve araç lizatlarının hazırlanması; (2) T4 fajının E. coli monokolonize gnotobiyotik farelere oral yoldan verilmesi; (3) Fare dışkısında ve dokularında T4 faj seviyelerinin zaman içinde izlenmesi.

Burada sunulan temsili sonuçlar için, saflaştırılmış T4 faj lizatları, Rohwer Laboratuvarı tarafından tutulan faj bankası stoklarından çoğaltıldı. T4 fajını yaymak için Phage-on-Tap yöntemi, bu protokolde atıfta bulunulduğu gibi25'e uyarlanmıştır. Yöntem, üç gün içinde yüksek titre, endotoksin düşük faj stokları verir. Bu yaklaşım kullanılarak, rutin olarak 10 mL ≥10 10 plak oluşturan birim (pfu)/mL < 0.5 endotoksin birimi (EU)/mL T4 faj toplandı. Farelere oral veya intravenöz uygulama için önerilen endotoksin seviyeleri sırasıyla ≤ 20 EU/mL ve ≤ 5 EU/kg/s'dir (veya 20 g'lık bir fare için 1 saat boyunca uygulanan 0.1 EU), bu da bunu in vivo aşılama için uygun bir faj hazırlama yöntemi haline getirir. Tüm faj stokları 4 °C'de salin magnezyum (SM) faj tamponunda saklandı (tarif adım 1.1.5.1'de verilmiştir). E. coli , LB ortamında yetiştirildi. Çeşitli faj-bakteri çiftleri için, çeşitli kültür ortamları ve büyüme koşulları bu protokolden uyarlanabilir. Fajlar ayrıca atık su, deniz suyu, toprak ve bağırsak içeriği gibi çevreden de elde edilebilir ve ilgilenilen her bir faj-konakçı çifti için uygun büyüme ve yayılma koşulları kullanılarak hazırlanmadan önce Sambrook ve Russell26'ya göre izole edilebilir ve saflaştırılabilir25. Alternatif olarak, fajlar ticari kaynaklardan (bkz . Malzeme Tablosu) veya faj bankalarından elde edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler, UBC Hayvan Bakım Komitesi ve Biyogüvenlik Komitesi onaylı protokoller (A23-0113, B19-0038) tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Fareler, British Columbia Üniversitesi'nde, Hastalık Modelleme Merkezi'nde patojen içermeyen koşullar altında barındırıldı. C57BL/6 fareleri, steril fare diyeti, su, yatak takımı ve yuvalama malzemesi ile sağlanan steril bir esnek film izolatöründe tesis içinde yetiştirildi. Fareler 12 saatlik bir gündüz / gece döngüsünde tutuldu. Hem erkek hem de dişi deney fareleri, her deneyde 6 ila 12 haftalık arasında değişen ve tüm deneyler için 15-30 g ağırlığında yaşları eşleştirildi.

1. Farelerde oral gavaj için faj ve araç lizatlarının hazırlanması

  1. Faj saflaştırma ve stok üretimi
    NOT: Bu çalışmada, T4 fajları, aşağıda açıklanan tek agar tabakası yöntemi kullanılarak bir bakteri çimi üzerine kaplanarak büyütülür ve titrelenir. Çift agar tabakası yöntemi daha önce açıklanmıştır25,27ve benzer etkinlikle de kullanılabilir. Daha iyi plak görünürlüğü sağladığı için bu protokol için tek agar tabakası yöntemi seçilmiştir28.
    1. Steril polistiren veya cam kültür tüplerinde (kapaklı) 5 mL steril LB ortamında E. coli büyütün. Tüpleri 37 °C'de, sabit faza ulaşılana kadar gece boyunca 200 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
    2. Takviyeden önce LB'yi %0,5 agar ile otoklavlayarak ve 50 °C veya altına soğutarak (sıvı kalırken) bir cam ortam şişesinde yumuşak agar hazırlayın. Tabak başına 15 mL'ye yetecek kadar yumuşak agar hazırlayın.
    3. Yumuşak agarı MgS04 ve CaCl 2 ile her biri için 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar destekleyin. Her 3 mL yumuşak agar için 100 μL gece boyunca E. coli kültürü ekleyin. Yumuşak agardaki takviyeleri ve kültürü homojenize etmek için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak hafifçe karıştırın.
      NOT: Yumuşak agar preparatına eklenen E. coli'nin  hacmi ve yoğunluğundaki tutarlılık kritiktir (temsili sonuçlar bölümünde özetlenmiştir).
    4. Serolojik bir pipet kullanarak Petri kabı başına (15 cm çapında) 15 mL yumuşak agar + E. coli ekleyin. Plakaların aynı gün kullanım için oda sıcaklığına ayarlanmasına izin verin.
      NOT: Plakalar, kapaklar açıkken yaklaşık 20 dakika içinde sertleşecektir. Agar yumuşak kalacak ancak plakalar ters çevrildiğinde kaymayacaktır.
    5. SM tamponunda seyrelterek kaynak T4 fajının 8-10 seri dilüsyonunu 10 faktör olarak hazırlayın. Her seyreltmenin 5 μL'sini plakalara yerleştirin. Lekelerin kurumasına, ters çevirmesine ve plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe etmesine izin verin.
      1. Tuzlu Magnezyum (SM) faj tamponu hazırlamak için, 1 L deiyonizeH2O'da100 mM NaCl, 8 mM MgSO4·7H2Ove 50 mM Tris-HCl'yi (pH 7.4) çözün. Otoklavlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
        NOT: Ertesi gün, E. coli yumuşak LB agar boyunca bir çime dönüşmüş olmalıydı. E. coli çimlerinde görülebilen plaklar veya temizlenmiş büyüme alanları, enfekte E. coli konakçılarının faj öldürmesinin meydana geldiği yerlerde ortaya çıkacaktır. Her plak, bir plak oluşturma birimini (pfu) temsil eder.
    6. Steril bir pipet ucunu plağın ortasına iterek yumuşak agar plakasından tek bir plak seçin ve ucun ucunda bir agar tıkacı oluşturun. Plak tapasını 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL SM tamponuna yeniden süspanse edin. Karıştırmak için tüpü maksimum hızda 1 dakika vorteksleyin.
    7. Lizattaki kalıntıları temizlemek için tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    8. İzole edilmiş fajı çoğaltmak için 1.1.1-1.1.3 adımlarını tekrarlayın. Konik bir tüpte E. coli içeren 15 mL'lik bir yumuşak agar alikotuna 100 μL izole faj ekleyin. Karıştırmak için tüpü üç kez ters çevirin ve agarı bir petri kabına dökün.
    9. Ters çevirmeden ve gece boyunca 37 °C'de inkübe etmeden önce plakaların kurumasını bekleyin. E. coli'nin canlılığını doğrulamak için fajsız bir çim kontrol plakası hazırlayın.
      NOT: Gece boyunca inkübasyondan sonra, kontrol plakasında bir E.coli çimi bulunmalı ve faj içeren plaka tamamen parçalanmalıdır.
    10. Fajı plakadan çıkarmak için, fajla temizlenmiş plakanın yüzeyine 5 mL SM tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir külbütör üzerinde 70 rpm'de çalkalayın.
    11. Tamponu plakadan 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne toplayın ve agar plakasındaki kalıntıları toplamak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4000 x g'da santrifüjleyin.
    12. T4 faj stoğu lizatını yeni bir tüpe toplayın ve titrasyon ve yayılmaya kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: T4 fajları 10 yıldan fazlastabildir 25; Bununla birlikte, stabilite fajın türüne ve saklama koşullarına bağlı olacaktır. Faj titresi de saklama süresine göre değişecektir. Fajlar donmaya karşı hassastır. Bu nedenle, sıvı nitrojende kriyoprezervasyon yapılması ve fajlara zarar verebileceği ve faj titresini25 azaltabileceği için donma-çözülme döngülerinden kaçınılması önerilir.
    13. Daha önce tarif edildiği gibi pfu / mL'deki konsantrasyonu belirlemek için T4 faj stok lizatını titreedin 25,29,30. Yüksek titreli bir T4 faj stoğu 108 pfu / mL veya daha fazlasını içerecektir.
  2. Deneysel faj lizatlarının hazırlanması
    1. Steril polistiren veya cam kültür tüplerinde (kapaklı) 5 mL LB ortamında kültür E. coli . Tüpleri gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de çalkalanarak, sabit faza ulaşılana kadar inkübe edin.
    2. Gece boyunca alt kültür E. coli kültürü 100 mL LB ortamında 1:50 cam konik bir şişede. Bakteriler erken ila orta üstel faza (yaklaşık 1,5 saat) ulaşana kadar 200 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Bakteri kültürünün üstel fazda olduğu 600 nm (OD600) aralığında optik yoğunluğu belirlemek için bir başlangıç büyüme eğrisi gerçekleştirilebilir. Son kanıtlar fajların polipropilen31 gibi plastiklere yapışabildiğini bulduğundan, cam konik bir tüpte kültür önerilmektedir.
    3. Adım 1.1'den itibaren 100 μL yüksek titreli T4 faj stoğu E. coli alt kültürüne ekleyin ve 37 ° C'de 3 saat çalkalayarak veya yeni lizat artık bulanık olmayana kadar inkübe edin. T4 faj lizatını 50 mL'lik konik tüplere toplayın ve doğrudan temizleme adımlarına geçin veya gerekirse ertesi güne kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Daha büyük bir faj patlaması boyutu (replikasyon döngüsü başına salınan daha yüksek bir ortalama virion sayısını gösterir), adım 1.2.2'de bakteri alt kültürü için daha uzun bir inkübasyon süresi gerektirir. Bu, faj stokları ile sivrilmeden önce bakteri yoğunluğunun artmasını sağlar.
    4. Kalan bakteri ve hücresel kalıntıları peletlemek için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 4000 x g'da lizatları santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı 0.22 μm'lik bir naylon filtre kullanarak filtreyle sterilize edin ve süzüntüyü yeni 50 mL'lik konik santrifüj tüplerine aktarın.
    5. Kalan bakterileri öldürmek ve bakteri üremesini önlemek için filtrelenmiş T4 faj lizatının her hacmine 0.1 hacim kloroform ekleyin. Karıştırmak için kısaca vorteks yapın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
      NOT: Lipid zarflı fajlar kloroforma duyarlıdır, bu da faj titresini25 azaltabilir. Gerekirse bu adımı atlayın.
      DİKKAT: Kloroform, solunduğunda, yutulduğunda veya cilt yoluyla emildiğinde tehlikeli olan toksik bir organik çözücüdür. Kloroform ile çalışırken çeker ocak ve uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. Çoğu plastikle uyumlu olmadığı için kloroform ile çalışırken polistiren serolojik pipetler yerine cam kullanın. Kloroform, 1.2.5-1.2.6 adımları için polipropilen konik santrifüj tüplerine yerleştirilebilir, ancak plastik tüplerde uzun süre saklanmamalıdır.
    6. Kloroformu lizattan ayırmak için lizatı 4000 x g'da oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleyin. Alttaki kloroform tabakasını bozmadan üst lizat tabakasını 50 mL'lik yeni bir konik tüpe dikkatlice aktarmak için serolojik bir pipet kullanın. Kloroform atıklarını uygun tehlikeli sıvı atık kabına atın. Lizatları ertesi gün konsantrasyon ve tampon değişimine kadar 4 °C'de saklayın.
    7. Cihazın üst rezervuarına 13 mL faj lizat ekleyerek ve 5 dakika boyunca 4000 x g'da santrifüjleyerek veya lizatın çoğu filtreden alt rezervuara geçene kadar 100 kDa'lık bir santrifüj filtre cihazında (Malzeme Tablosuna bakınız) faj lizatlarını konsantre edin.
      NOT: Sıkma süresinin sonunda yaklaşık 2 mL lizat elde etmeyi hedefleyin. Lizat ilavesiyle filtredeki faj konsantrasyonu arttıkça, sıkma süreleri muhtemelen artacaktır. Santrifüj filtre cihazları, kuru dönmelerini önlemek için fiziksel bir ölü durdurmaya sahiptir32. Sürekli kullanım amaçlanıyorsa filtre membranının kurumasına izin vermeyin (yani, üst rezervuardaki tüm sıvıyı çıkararak). Sıkma süreleri faj tipine ve titreye göre değişebilir.
    8. Bir P200 veya P1000 pipeti kullanarak, her dönüşten sonra filtre membranının tıkanıklığını açmak için kalan ~2 mL lizatı üst rezervuar içinde yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin. Süzüntüyü alt rezervuardan bir atık kabına atın ve konsantre fajı üst rezervuarda bırakın.
    9. Her dönüşten sonra üst rezervuarda ~2 mL konsantre faj tutulacak şekilde, tüm faj lizat hacmi filtre cihazından geçene kadar 1.2.7-1.2.8 adımlarını tekrarlayın.
    10. Son sıkmadan sonra üst rezervuarda kalan lizatı (~2 mL) yukarı ve aşağı pipetleyerek filtre membranının tıkanıklığını açın. Üst rezervuara 12 mL SM tamponu ekleyerek fajı (tampon değişimi) yıkayın ve 4000 x g'da 10 dakika boyunca veya tamponun çoğu filtreden geçene kadar santrifüjleyin.
    11. Süzüntüyü atın ve yıkama adımını tekrarlayın (adım 1.2.10). Uzun süreli depolama için SM tamponunda kalan 2 mL lizatı 10 mL (veya daha az) nihai hacme yeniden süspanse edin. Lizatı 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve endotoksin giderilene kadar 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Faj lizatının konsantre edildiğinden emin olmak (> 108 pfu / mL) ve endotoksin çıkarma işlemi sırasında faj kaybını belirlemek için bu aşamada fajı titre etmek isteğe bağlıdır.
    12. Toplam lizat hacmine 0.4 hacim 1-oktanol (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek T4 faj lizatından kirletici endotoksinleri çıkarın.
      NOT: Endotoksinler, yüksek oranda immünostimülatör oldukları için çıkarılır ve bu nedenle varlıkları, fajdan bağımsız doğuştan gelen bir bağışıklık tepkisinin indüksiyonuna yol açabilir25.
      DİKKAT: 1-Oktanol, güçlü bir kokuya sahip aromatik, organik, yanıcı bir bileşiktir ve gözü tahriş eder. 1-oktanol ile çalışırken uygun KKD giyin. Buhar solunmasını önlemek için tüm işleri çeker ocakta gerçekleştirin. Çeker ocak dışında çalışırken tüplerin sızmasını önlemek için sızdırmazlık filmi kullanın.
    13. Sızıntıyı önlemek için konik santrifüj tüpünün kapağını sızdırmazlık filmi ile kapatın. Bir platform veya sallanan çalkalayıcı üzerinde 120 rpm'de oda sıcaklığında 1 saat çalkalayın, ardından 4 °C'de 1,5 saat çalkalamadan inkübe edin.
    14. Endotoksin ile temizlenmiş lizatı 1-oktanolden ayırmak için 10 dakika boyunca 4000 x g'da santrifüjleyin. 1-oktanol tabakası lizatın üzerinde yüzecektir. Mümkün olduğunca 1000 oktanol'ü dikkatlice çıkarmak için bir P1 pipeti kullanın ve uygun tehlikeli/yanıcı sıvı atık kabına atın.
    15. 18 oktanol katmanını toplamamaya dikkat ederek, kalan 1 oktanol tabakasının altındaki faj lizatını toplamak için 1 G iğne ve 1 mL şırınga kullanın. Lizatı hızlı vakuma kadar 4 °C'de saklayın.
    16. T4 faj lizatının 1 mL alikotlarını steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Lizattan kalan 1-oktanol'ü buharlaştırmak için oda sıcaklığında 4000 x g'da kapaklar açıkken hızlı vakum. 3 saat boyunca veya faj lizat hacmi %30 oranında azaltılana kadar hızlı vakum25. Titrasyona kadar 4 °C'de saklayın.
    17. Pfu / mL'deki konsantrasyonu belirlemek için faj lizatını titre edin. Elde edilen T4 faj lizatını SM tamponunda istenen konsantrasyona seyreltin ve onaylamak için yeniden titre edin.
    18. Üretici talimatlarına göre bir kromojenik endotoksin kantitasyon kiti kullanarak T4 faj lizatında bulunan endotoksinleri ölçün (bkz. Malzeme Tablosu). Son faj lizatındaki endotoksin seviyelerini, endotoksin giderme öncesi numune, araç kontrolleri, tampon ve fare içme suyu ile karşılaştırın.
      NOT: Kromojenik endotoksin kantifikasyon kiti 1-oktanol25 ile inaktive edilir. Endotoksinleri ölçmeden önce 1-oktanol'ü (adım 1.2.16) çıkarmak için hızlı vakum adımlarını gerçekleştirin. Damıtılmış su için endotoksin içeriğinin 20 EU/mL25 olduğu tahmin edilmektedir; Bununla birlikte, fare içme suyunun endotoksin içeriği tesisler arasında değişebilir. Faj lizatındaki endotoksin seviyeleri içme suyunda bulunan miktarı aşarsa, endotoksin giderme adımlarını tekrarlamayı düşünün (1.2.12-1.2.16).
    19. Konsantre, endotoksin ile temizlenmiş T4 faj lizatlarını 4 ° C'de SM tamponunda saklayın.
  3. Araç kontrolleri için fajsız bakteri lizatının hazırlanması
    NOT: Faj içermeyen bir bakteri lizatı, farelere aşılandığında deneysel sonuçları etkileyebilecek adım 1.2'de faj lizat üretiminde üretilen bakteriyel kirleticilere (örneğin, endotoksin) bağlı herhangi bir etkiyi kontrol etmek için bir araç olarak hazırlanabilir.
    1. Bir gecede E. coli kültüründen, E. coli 1:50'yi 100 mL LB ortamına alt kültürleyin. Faj eklemeden, 37 ° C'de 3 saat çalkalarken veya adım 1.2'de üretilen faj lizatı için inkübasyon süresini eşleştirirken bakterileri kültürlemeye devam edin.
    2. Bakteri hücrelerini manuel olarak parçalamak için 30 s darbeler (3x) için 30 kHz'de buz üzerinde bir sonikatör probu (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak E. coli kültürünü 50 mL konik tüplere ve lizaz hücrelerine aktarın.
    3. Tüm temizleme, yıkama ve endotoksin giderme adımları dahil olmak üzere adım 1.2.4'ten başlayarak adım 1.2'ye göre protokolün geri kalanını izleyin.
      NOT: Santrifüj filtre cihazını kullanarak konsantrasyon sırasında, araç lizatı, faj yokluğundan dolayı filtreden faj lizatından daha hızlı akacaktır. Bu nedenle, uzun süreli santrifüjleme sırasında ultrafiltre membranının kurumamasını sağlamak için santrifüj sürelerini 5 dakikadan 2-5 dakikaya kısaltın.
    4. Faj içermediğini doğrulamak için araç lizatını titre edin.
    5. Araç lizatındaki endotoksin seviyelerini ölçmek için üretici talimatlarına göre bir kromojenik endotoksin kantitasyon kiti kullanın. Faj lizatındaki endotoksin seviyelerine uyması için araç lizatını SM tamponunda seyreltin.
  4. Alternatif deneysel kontroller: ısıyla inaktive edilmiş faj lizatının hazırlanması
    NOT: Faj içermeyen bakteri lizatına bir alternatif, ısıyla etkisiz hale getirilmiş bir faj lizatıdır. Isı inaktivasyonu faj viryonlarını ayrıştırırken, lipopolisakkaritler (LPS) gibi rezidüel endotoksinler ısıya dayanıklıdır 8,33. Bu yöntem Gogokhia ve ark.8 tarafından immün aktivasyon için sağlam, canlı faj virionların gerekli olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Araştırmacılar, her iki yöntemi de (fajsız ve ısıyla etkisizleştirilmiş) test etmeye ve deneysel ihtiyaçları için hangi kontrolün en uygun olduğunu belirlemeye teşvik edilir. Hangisi seçilirse seçilsin, bir faj stoğunu konsantre etmek ve temizlemek için gereken önemli manipülasyon nedeniyle bir tampon kontrolünün uygun olma ihtimalinin düşük olduğunu kabul etmek önemlidir.
    1. Gerekli hacimde temizlenmiş, saflaştırılmış ve seyreltilmiş T4 faj lizatını adım 1.2'den (fare başına 100 μL) kapak kilitleri ile donatılmış steril mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
    2. Lizatları 95 °C'de 15 dakikaısıtın 16.
    3. İSTEĞE BAĞLI: Faj/bakteriyel nükleik asitlerin çıkarılması gerekiyorsa, Jakočiūnė ve Moodley34'e göre DNaz I ve RNase A tedavisi uygulayın. Kısaca:
      1. 450 μL ısıyla inaktive edilmiş faj lizatına 50 μL DNaz I 10x tampon, 1μL DNaz I (1 U/μL) ve 1 μL RNase A (10 mg/mL) (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
      2. Lizatları 37 °C'de bir ısı bloğunda 1,5 saat çalkalamadan inkübe edin.
      3. 20 μL 0.5 M etilendiamintetraasetik asit (EDTA)34 ekleyerek DNaz I ve RNase A'yı etkisiz hale getirin.
    4. Lizatları soğutmak için 10 dakika oda sıcaklığında tutun ve birden fazla tüp kullanılıyorsa lizatları birleştirin. Titrasyona kadar 4 °C'de saklayın.
    5. Lizatta canlı bir T4 fajı bulunmadığını doğrulamak için bir faj titresi uygulayın. Isı ile etkisiz hale getirilmiş lizatları 4 °C'de saklayın.
    6. Isıyla inaktive edilmiş lizattaki endotoksin seviyelerini ölçmek için üretici talimatlarına göre bir kromojenik endotoksin kantitasyon kiti kullanın. SM tamponundaki ısıyla etkisiz hale getirilmiş lizatı, eşleşen faj lizatında bulunan endotoksin seviyelerine göre seyreltin.

2. E. coli monokolonize farelerde T4 fajının uygulanması ve izlenmesi

  1. E. coli ile farelerin monokolonizasyonu
    1. E. coli'yi gece boyunca LB ortamında tek bir koloniden toplanan E. coli'yi kültürleyerek GF farelerine8 uygulama için hazırlayın.
    2. Sıkı, steril koşullaraltında 35, oral gavaj yoluyla steril vinil izolatörlere veya biyo-dışlama hava geçirmez kafeslere yerleştirilmiş GF farelerine 200 μL E. coli kültürü uygulayın. Aerotolerant bakteriler kullanılıyorsa, fareler ayrıca her farenin sırtına 200 μL bakteri kültürü uygulanarak kolonize edilebilir.
      NOT: Farklı bakteriler farklı pH hayatta kalma kabiliyetigösterdiğinden, aşılama dozu suşa bağlı olacaktır 36,37. Zucoloto ve ark.35, hayvan başına 1 x 108 cfu ile aşılamayı önermektedir. Burada gösterilen temsili sonuçlar, bir gece kültürü ile aşılanmış farelerden üretilmiştir (cfu belirlenmemiştir). İlgilenilen fare suşunun güvenilir kolonizasyonu ile sonuçlanan bir dozu belirlemek için pilot deneyler yapılabilir. Oral gavaj ile uygulanacak bakteri hacmi, farelerin yaşı ve ağırlığından etkilenebilir. İzin verilen maksimum dozlar için bireysel laboratuvar veya kurumsal hayvan etik protokolüne danışın. Burada önerilen hacim, fare vücut ağırlığının %10'u kadar bir gavaj payına dayanmaktadır (örneğin, 20 g'lık bir fare için maksimum 200 μL). Bazı bakteri türleri midenin asitliğini tolere etmez ve bağırsakları kolonize edemez. Mide asitlerininötralize etmek için önce 100 μL 1 M NaHCO3 ile gavaging yapmayı düşünün 2. Kolonize etmek için katı bir anaerob kullanılıyorsa, mikrobun anaerobik koşullar altında büyütülmesi ve ayrı ayrı hazırlanmış hava geçirmez kaplarda (her fare için 1 adet) gnotobiyotik hayvan tesisine aktarılması gerekecektir. Oksijene maruz kalma nedeniyle mikrobiyal canlılık kaybını sınırlamak için kap açıldıktan sonra her gavajı hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
    3. Fareleri olumsuz sağlık etkileri açısından izleyin.
      NOT: Olumsuz sağlık etkileri olması durumunda, ilgili hayvan bakım tesisi tarafından belirlenen standartlara bakın. Olası olumsuz sağlık etkileri aşağıdakileri içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir: (1) Gavaj sıvısının aspirasyonu: semptomlar arasında burun yoluyla kabarcıkların dışarı atılması, "açık ağız" solunum/nefes alma yer alır. (2) Yemek borusunun delinmesi: semptomlar arasında hızla sağlıksızlık, kamburluk, uyuşukluk yer alır ve 24 saat içinde hayvanın ölümüne yol açar. (3) Tekrarlanan gavajlar nedeniyle yemek borusu iltihabı: semptomlar arasında gavaj iğnesinin yerleştirilmesinde zorluk yer alır. (4) Mikrobiyomdaki değişikliklere bağlı ishal.
    4. Haftada en az bir kez kültürleyerek ve/veya 16S rRNA dizilimi35 ile dışkı peletlerinde bakteri kolonizasyonunu doğrulayın.
      NOT: Deney farelerinin üretimi için yetiştiricileri bir gnotobiyotik izolatör içinde kolonize ediyorsanız, 6 haftalık birinci nesil yavru (F1) deney farelerinin üretimi için en az 9 hafta önceden plan yapın. Alternatif olarak, GF yetişkin fareler monokolonize edilebilir. Bu yaklaşımda, faj aşılamasından önce kolonizasyondan sonra 7 hafta beklenmesi önerilir, çünkü bu, GF farelerine karmaşık bir mikrobiyota eklendikten sonra bağırsak mukozasının stabilize olması için gereken süredir38.
  2. T4 fajının E. coli monokolonize farelere oral aşılanması
    1. T4 faj lizatlarını ve araç kontrollerini SM tamponunda önceden belirlenmiş bir konsantrasyona seyreltin. Hsu ve ark.2'ye göre, fare 2 başına 2 x 106 pfu'nun uygulanmasına izin vermek için faj lizatlarını seyreltin2.
      NOT: İn vivo fajın stabilitesine bağlı olarak daha yüksek veya daha düşük bir faj konsantrasyonu kullanılabilir. Fare başına 2 x 102, 2 x 104 ve 2 x 106 pfu T4 faj dozları, bağırsakta doza bağımlı görünmeyen stabil ve uzun süreli kolonizasyona neden oldu (temsili sonuçlar bölümünde gösterilmiştir). Bu nedenle faj-bakteri kinetiği, büyük ölçekli deneylerden önce in vivo olarak denenmelidir.
    2. Steril, gnotobiyotik koşullar altında, mide asitlerini nötralize etmek için her fareyi 100 μL otoklavlanmış 1 MNaHCO3 ile gavajlayın. 10 dakika bekleyin, ardından 100 μL T4 faj lizatı veya araç kontrolü ile gavajlayın.
    3. Fareleri olumsuz sağlık etkileri açısından izleyin.

3. T4 faj seviyelerinin in vivo izlenmesi

NOT: Fareler faj ile aşılandıktan sonra, hem fajların hem de hedef bakterilerin konsantrasyonu dışkı veya doku örneklerinde ölçülebilir. Bu, her iki organizmanın faj enfeksiyonunun kinetiği ve kolonizasyon dinamikleri hakkında bilgi sağlar.

  1. Dışkı peletlerindeki konsantrasyonu belirlemek için nokta kaplama T4 fajı
    1. T4 faj ve E. coli seviyelerini ölçmek için her fareden dışkı peletlerini steril, önceden tartılmış, mikrosantrifüj tüplerinde toplayın. Tüpleri kaplamaya kadar buz üzerinde saklayın.
      NOT: Aerotolerant bakterilerin büyümesini yavaşlatmak için toplama ve kaplama arasındaki ara dönemde numuneleri buz üzerine yerleştirin. Birkaç saat boyunca, hala aerobik bakteri üremesi veya oksijene maruz kalma nedeniyle çarpık bakteri sayımlarına yol açabilecek bazı anaerobik bakteri ölümleri olabilir. Bu nedenle, numune alındıktan sonra mümkün olan en kısa sürede bakteri ve faj kaplaması yapılmalıdır. Zorunlu anaerobik bakteriler oksijene maruz kalmayı tolere etmeyecektir. Numuneyi korumak için, numuneleri kapalı tüplere toplayın ve tüpleri aldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede anaerobik bir odaya aktarın. Dışkı örneklerinde büyüme tespit edilmezse, bakteri kantitasyonu için 16S rRNA qPCR gibi alternatifleri düşünün.
    2. Her tüpün son ağırlıklarını kaydedin ve ilk tüp ağırlığını çıkararak numune ağırlığını hesaplayın. Bu, T4 faj ve E. coli konsantrasyonunu numune ağırlığına (sırasıyla pfu/g veya cfu/g) normalleştirmek için kullanılacaktır.
    3. Her tüpe 1 mL steril SM tamponu ekleyin ve dışkı peletlerini homojenize etmek için maksimum hızda (>1 dakika) iyice girdaplayın. Numune 15 mg'dan azsa, daha küçük bir hacimde SM tamponu eklenebilir. Numunenin cfob/g veya pfu/g hesaplamaları için her numuneye eklenen SM tamponunun hacmini kaydedin.
    4. 10 faktöründe 180 μL SM tamponunda her numuneden 20 μL'lik 8 (veya beklenen faj konsantrasyonuna bağlı olarak daha fazla) seri dilüsyon serisi hazırlayın. İlk tüpe/kuyucuğa eklemeden önce karıştırmak için homojenleştirilmiş her numuneyi kısaca vorteksleyin. Numune taşıma yoluyla faj veya bakteri sayımlarının şişmesini önlemek için her ekleme arasında karıştırmak ve her seyreltme arasında uçları değiştirmek için pipet kullanın.
      NOT: Numunede bulunan lifler ve kalıntılar pipetlemeyi engelliyorsa, stok numuneyi daha da seyreltmek için dışkı bulamacına ek tampon ekleyin.
    5. Her numunede T4 faj ve E. coli konsantrasyonunu belirlemek için E. coli (faj plak deneyleri için) veya LB agar plakaları (bakteri kolonisi deneyleri için% 1.5 agar) içeren LB yumuşak agar plakalarına her seyreltmenin 5 μL'sini yerleştirin. Doğruluk için, her numuneyi üç kopya halinde tespit edin.
      NOT: 96 oyuklu bir plakada seri seyreltmeler hazırlıyorsanız, seri olarak seyreltilmiş numunenin her bir sütununu plakalara pipetlemek için 8 kanallı bir P20 çok kanallı pipet kullanılabilir. Faj pipet ucunun duvarlarına yapışabileceğinden ve her yeni kuyucuğa eklenen faj miktarını değiştirebileceğinden, en seyreltikten en konsantreye doğru hareket etse bile, her seyreltme arasında uçları değiştirin31.
    6. Plakayı ters çevirmeden ve inkübatöre yerleştirmeden önce her noktanın kurumasını bekleyin. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    7. Her numune için, nokta başına 3-30 sayılabilir plak bulunan seyreltmeyi seçin. Noktadaki plakların sayısını ve kullanılan seyreltmeyi sayın ve kaydedin.
    8. Plak sayısını, pfu/μL vermek için her bir noktada kaplanan hacme bölerek numunenin pfu/g'sini hesaplayın. Son olarak, pfu/g30 verecek şekilde numune ağırlığına bölün.
      Equation 1
      Equation 2
  2. Deneysel uç noktalarda doku örneklemesi
    1. Seçilen her zaman noktasında, onaylanmış kurumsal hayvan etiği protokolüne göre farelere ötenazi yapın ve çekal içeriğini, ince ve kalın bağırsak içeriğini ve ilgilenilen dokuları steril, önceden tartılmış 2 mL yuvarlak tabanlı mikrosantrifüj tüplerinde toplayın.
    2. Numune ağırlığını hesaplamak için her tüpün son ağırlıklarını kaydedin. Mendilleri ve çekal içeriğini aynı gün kaplamaya kadar buz üzerinde saklayın.
    3. Her tüpe steril SM tamponu ekleyin ve eklenen hacimleri kaydedin.
    4. Çekal ve bağırsak içeriği için, adım 3.1.3'e göre iyice (>1 dakika) vorteks numuneleri alın.
    5. Doku örnekleri için, her tüpe bir steril metal boncuk ekleyin. 20 Hz'de 5 dakika boyunca veya dokular ayrışana ve süspansiyon homojen olana kadar bir doku parçalayıcı (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak dokuları homojenize edin.
      NOT: Numuneler iyi homojen olmazsa, eklenen SM tamponunun hacmini artırmayı, homojenizasyon süresini artırmayı veya homojenizasyon frekansını 30 Hz'e çıkarmayı düşünün. Bakteri ve faj geri kazanımına izin verirken dokuları ayırmak için bir doku homojenizatörü de kullanılabilir39,40. Homojenizatörler, bakteri bütünlüğünü korurken doku parçalayıcılardan daha yüksek frekanslarda çalıştırılır.
    6. Her numunenin 10 faktöründe seri dilüsyonlarını hazırlayın ve adım 3.1.4-3.1.841'de açıklandığı gibi her numunedeki E. coli ve T4 faj konsantrasyonlarını belirlemek için nokta kaplama yapın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fare bağırsağında T4 faj/E. coli dyad arasındaki etkileşimleri araştırmak için T4 fajı ve araç lizatları hazırlandı, temizlendi ve saflaştırıldı (Şekil 1A). T4 faj lizatları plak testi ile titre edildi ve SM tamponunda 2 x 107 pfu/mL'ye (2 x 106 pfu/fare) seyreltildi. Araç lizatları ayrıca canlı faj varlığını doğrulamak için titre edildi ve T4 faj lizatı ile aynı hacimde SM tamponu içinde seyreltildi. Endotoksin seviyeleri, bir kromojenik endotoksin kantifikasyon kiti kullanılarak seyreltilmiş lizatlarda ölçüldü. T4 fajı, ısıyla inaktive edilmiş faj ve araç lizatları, içme suyu için kabul edilebilir seviyelerin altında endotoksin seviyelerine sahipti (<20 EU/mL)25 (Şekil 1B). Araç lizatı, T4 faj lizatı ile benzer miktarda endotoksin içerdiğinden, uygun bir kontrol olarak kabul edildi. Isıyla inaktive edilmiş faj lizatı (ısıl işlemden önce 2 x 107 pfu / mL) hem araçtan hem de T4 faj lizatından daha az endotoksin içeriyordu. Kit talimatlarına göre, 1-oktanol ile muamele edilmiş numuneler, 0.5 EU/mL'lik bir nihai konsantrasyon vermek için araç lizatına (çivili araç) bir endotoksin standardı eklenerek test inhibisyonu açısından test edildi. Sivri uçlu araç endotoksin seviyeleri eksi araç endotoksin seviyeleri, üretici tavsiyelerine göre 0.5 EU/mL ±%25 olarak ölçülmüştür (Şekil 1B). Bu, 1-oktanolün başarılı bir şekilde çıkarıldığını ve testin sonuçlarına müdahale edebilecek lizatların neden olduğu herhangi bir test inhibisyonu olmadığını gösterdi.

E. coli K-12 (BW25113) monokolonize C57BL / 6 fareleri, gnotobiyotik koşullar altında steril bir esnek film vinil izolatörü içinde yetiştirildi (Şekil 2A). F0 nesil fareler, çevrelerine ve birlikte barınmalarına eklenmesi yoluyla E. coli ile kolonize edildi. Deneyler için sadece doğumdan dikey iletim ve birlikte barınma yoluyla E. coli ile kolonize edilen döller (F1 ve F2 nesli) kullanıldı. Bu strateji, bakteri aşılamasına yanıt olarak meydana gelen bağışıklık sistemi, mukus üretimi ve GI yolu gelişimindeki değişikliklerikontrol etti 22,37, bu nedenle sadece faj girişi nedeniyle meydana gelen değişikliklerin ölçülmesine izin verdi. Olgunlaştıktan sonra, deney fareleri, her birinin 6-8 haftalıkken oral gavaj yoluyla 2 x 106 pfu T4 faj veya eşit hacimde araç lizatı aldığı steril izokafeslere transfer edildi. T4 faj ve E. coli bolluğu, sırasıyla% 0.5 (yumuşak) agar veya% 1.5 agar üzerinde dışkı peletlerinin toplanması ve nokta kaplama testleri ile dört hafta boyunca izlendi. Bu deney boyunca, T4 faj ve E. coli, her iki popülasyon da tükenmeden bir arada var olabildiler (Şekil 2B, C). T4 fajın 2 x 102 ve 2 x 104 pfu / farenin daha düşük dozlarında oral yoldan verilmesi, T4 fajının 2 x 106 pfu'ya kıyasla bağırsakları kolonize etme yeteneğini azaltmamıştır (Şekil 2D). Benzer şekilde, T4 aşılamasının E. coli seviyeleri üzerinde doza bağlı bir etkisi gözlenmemiştir (Şekil 2E).

Daha da önemlisi, numuneler arasındaki kaplamadaki tutarlılığın plak sayısı için çok önemli olduğu bulunmuştur. Örneğin, yumuşak agarın içine bakteri eklenirken, bakteri yoğunluğunun tahlilin sonucunu büyük ölçüde etkilediği belirlendi. 1 saat, 1.5 saat veya 2 saat boyunca alt kültürlenen E. coli ilavesi, 2.8 saat veya daha uzun süre alt kültürlenen E. coli ilavesinden daha düşük plak sayılarına neden oldu. Ayrıca, E. coli 2.8 saat ila 16 saat (gece boyunca) alt kültürlendiğinde plak miktarı ~ 1 x 109 pfu / mL'de stabilize edildi, bu da 1 saatlik bir alt kültürden hesaplanan değere kıyasla yaklaşık 5 kat artıştı (~ 2 x 108 pfu / ml) (Şekil 3A). Alt kültürlemeden ziyade, hedef bakteriler gece kültürlerinden yumuşak agarlara aşılanabilir. Burada, yumuşak agar'a aşılanan 16 saatlik (gece boyunca) E. coli kültürünün hacmi plak sayımlarını etkiledi (Şekil 3B). Bu sonuçlar, agar içindeki E. coli yoğunluğunun plak tahlil sayımlarını etkileyebileceğini göstermektedir. Her iki yaklaşımda da, faj miktar tayini sonuçları aynı değerde (109 pfu/ml) plato yaptı, bu da plak sayımı doğruluğunu sağlamak için hedef bakterilerin yumuşak agarda yeterince yüksek yoğunlukta olması gerektiğini düşündürdü.

Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar, deneysel manipülasyonlar gerçekleştirmeden önce in vitro ve in vivo pilot deneyler yoluyla faj-bakteri kinetiği hakkında bir anlayış geliştirmenin önemini vurgulamaktadır.

Figure 1
Şekil 1: Faj lizatlarının hazırlanması. (A) Yüksek titreli bir faj stoğundan bir faj lizatı başlatmak için iş akışı. Lizatlar çoğaltıldı, temizlendi, konsantre edildi ve endotoksinler uzaklaştırıldı. Kirletici 1-oktanol, hız vakumu ile uzaklaştırıldı. (B) Endotoksinler, bir kromojenik endotoksin miktar tayin kiti kullanılarak faj ve araç lizatlarında ölçüldü. Kesikli mavi çizgiler, ürün inhibisyon kontrolünde ürün inhibisyonunu çürütmek için üst ve alt sınırları gösterir (0,5 EU/mL ± %25). Her nokta, iki teknik kopyadan birini temsil eder. Çubuk yüksekliği, kopyalar arasındaki ortalamayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Monokolonize farelerin üretimi ve dışkı peletlerinde faj ve bakteri seviyelerinin izlenmesi. (A) Tek bir bakteri türüne sahip mikropsuz fareleri kolonize etmek ve F1 ve F2 monokolonize farelerin üretimi için iş akışı. (B-E) E. coli ile monokolonize olarak doğan ve 6-8 haftalıkken T4 faj ile aşılanan C57BL/6 farelerinin dışkı peletlerinde tespit edilen T4 faj ve E. coli seviyeleri. 0. günde (kolonizasyon öncesi) ve kolonizasyondan sonra belirtilen günlerde, T4 faj seviyeleri, tek agar tabakası yöntemi kullanılarak spot kaplama ve plak testleri ile ölçüldü. E. coli düzeyleri %1.5 LB agar üzerine spot kaplama ile ölçüldü. (B, C) 2 x 106 pfu T4 faj veya araç lizatı (hacim ve endotoksin seviyeleri için normalleştirilmiş) ile aşılamayı takiben geri kazanılmış dışkı peletlerinde (B) T4 faj ve (C) E. coli seviyelerinin kinetiği. (D, E) (D) T4 faj ve (E) E. 2 x 102 pfu, 2 x 104 pfu veya 2 x 106 pfu T4 faj ile aşılamayı takiben geri kazanılmış fekal peletlerde coli seviyeleri. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) ortalama ve standart hatasını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Plak tahlillerinde sorun giderme doğruluğu. (A) Yumuşak agar hazırlığı için E. coli gece kültürleri veya alt kültürleri kullanan T4 faj lizat titresi (% 0.5 agar, LB). Alt kültürler, gece boyunca E. coli kültürünün taze LB'ye 1:50 oranında seyreltilmesi kullanılarak yapıldı. 5 mL yumuşak agar preparatları, 100 μL E. coli ve 20 μL T4 faj ile aşılandı. Bu testler için yumuşak agarlara CaCl2 ve MgS04 eklenmemiştir, ancak istenirse eklenebilir. E. coli alt kültür süreleri 2.8 saatin altında, daha düşük görünür bir faj titresi ile sonuçlandı. (B) Yumuşak agar preparatında farklı E. coli yoğunlukları kullanan T4 faj lizat titresi. Bir gecede kültürden (A'da olduğu gibi alt kültürlenmemiş) yumuşak agarın içine farklı hacimlerde E. coli eklemek, farklı belirgin faj titreleri ile sonuçlandı. Hata çubukları, hesaplanan faj titresi belirsizliğini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrobiyomdaki fajların incelenmesi, bakteriyel muadillerine kıyasla önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Spesifik olarak, fajlar, sırasıyla prokaryotik ve ökaryotik türlerin dizilenmesinde ve tanımlanmasında kolaylık sağlayan 16S ve 18S ribozomal alt birimlerine benzer tüm fajlarda ortak olan korunmuş bir filogenetik belirteç içermez42. Bununla birlikte, artan okuma uzunlukları, verim ve azalan maliyetler dahil olmak üzere yeni nesil dizileme yaklaşımlarındaki ilerlemelerle birlikte, bakteriyofaj genom veritabanlarının hızlı bir şekilde genişlemesigeliyor 42,43,44. Faj keşfinde çok fazla temel çalışma devam ederken, faj araştırmaları artık her zamankinden daha erişilebilir. Bağırsak mikrobiyomunun kilit üyeleri ve dünyadaki genetik olarak en çeşitli organizmalar olan fajlar, mikrobiyomun karmaşıklığını araştıran yeni araştırmalar için heyecan verici bir açı sunuyor. Burada açıklanan protokoller, hedef bakterileri ile kolonize edilmiş farelerde bilinen faj türlerini araştırmaya odaklanmaktadır. Bu protokollerin in vivo fajı incelemek için bir kılavuz sağladığı ve alanın büyümesiyle genişletilebileceği unutulmamalıdır.

Bakteriyel enfeksiyonların terapötik tedavisi için bakteriyofaj araştırmaları, 1940'larda antibiyotiklerin ortaya çıkmasıyla büyük ölçüde modası geçti. Bununla birlikte, antibiyotiklerin aşırı reçetelenmesi ve yanlış kullanımı, çoklu ilaca dirençli patojenlerin önemli bir halk sağlığı sorunu olarak ortaya çıkmasını hızlandırmıştır3. Fajlar, yüksek derecede konakçı özgüllükleri nedeniyle antibiyotiklere çekici bir potansiyel alternatif sunar3. Daha da önemlisi, fajlar doğal olarak insan bağırsak mikrobiyomunun üyeleri olarak ikamet ettiklerinden, öncelikle fajların bu karmaşık ortamlarda oynadığı rolleri anlamak gerekir. Birçok çalışma, bir faj ile hedef bakterileri arasındaki ilişkiyi in vitro olarak araştırmış olsa da, bu ilişkilerin GI yolunun manzarası içinde nasıl durabileceğini düşünmek önemlidir. Mikrobiyotanın bakteriyel bileşenlerini araştıran keşif çalışmalarında olduğu gibi, GF ve monokolonize fareler gibi basitleştirilmiş fare modelleri, fajın hedef türleri üzerindeki etkilerini ve bu ilişkinin bağışıklık tepkisine nasıl katkıda bulunduğunu izole etmemize izin verir. Bu, faj tedavisine yönelik önemli bir adımdır, çünkü bazı fajlar bağırsaklara verildiğinde fayda sağlamayabilir. Örneğin, Pseudomonas aeruginosa fajı Pf4, hem anti-bakteriyel bağışıklık tepkilerini hem de keratinosit göçünü inhibe ederek konakçısının neden olduğu hastalığı şiddetlendirir ve yara iyileşmesinin bozulmasına neden olur18,45. Burada açıklanan prosedürler, murin mikrobiyotasının üyeleri olarak fajları incelemek için teknikleri standartlaştırmayı amaçlamaktadır. Mikrobiyotanın metazoan konakçı üzerindeki etkisini araştıran öncü çalışmaları yineleyerek, mikrobiyota bağlamında fajlarda devam eden araştırmalar, multibiyomun daha geniş bir şekilde anlaşılmasında heyecan verici ve önemli olabilir46.

Sınırlama
Burada açıklanan protokoller, T4 fajı E . coli monokolonize farelere oral gavaj yoluyla uygulandığında, T4 fajı ile hedef bakterileri E . coli arasındaki rekabeti incelemek için optimize edilmiştir. Bakteriler gibi, farklı faj türleri de birbirinden farklı davranır, farklı replikasyon sürelerine, patlama boyutlarına ve bakteri hedeflerinin aralıklarına sahiptir47. Bu nedenle, benzer hayvan modellerinde diğer faj-bakteri çiftlerini araştırırken, bu protokolleri her adımda optimize etmeye özen gösterilmelidir. Örneğin, daha uzun replikasyon süresine ve/veya daha küçük patlama boyutuna sahip fajlar, yüksek titreli bir lizat üretimi için bakteri hedefleriyle daha uzun bir inkübasyon gerektirebilir. Benzer şekilde, plak tahlilleri için plaka inkübasyon sürelerinin uzatılması gerekebilir. Ayrıca, kısa replikasyon süresine ve/veya yüksek patlama boyutuna sahip fajlar, gece boyunca inkübasyon plak büyümesine neden olabileceğinden, daha kısa plak inkübasyonları gerektirebilir. İlgilenilen belirli bir faj için yayılma koşulları bilinmiyorsa, in vivo çalışmaya başlamadan önce büyüme koşullarını belirlemek için zemin oluşturulmalıdır48.

T4 fajının Hoc kapsid proteinlerinde bulunan Ig benzeri alanlar, bağırsak mukusu11'e yapışmayı kolaylaştırır. Seçilen fajın mukus bağlama kapasitesine bağlı olarak, dışkı örneklerindeki faj-bakteri seviyelerinin kinetiği, Şekil 2B-E'de gösterilen sonuçlardan farklı olabilir. Örneğin, çip üzerinde bağırsak sistemlerinde, bozulmamış Hoc proteinleri içeren fajın, Hoc eksikliği olan faj11'e kıyasla E. coli öldürme kapasitesini arttırdığı gösterilmiştir. T4 fajlarının in vivo 11,12,13 mukus bağlanması yoluyla tutulduğundan şüphelenilse de, farelerin koprofajik davranışı yoluyla yeniden aşılamanın etkisi göz ardı edilemez. Bu etkiler, tel kafes tabanları kullanılarak veya kafesler sık sık değiştirilerek azaltılabilir. Ig benzeri alanlar ssDNA veya RNA fajlarındatanımlanmadığından 49, faj tarafından bağırsak mukozasında ikamet etmek için kullanılan diğer stratejileri ayırmak ilginç olacaktır.

Son olarak, bu keşif çalışmaları sadece homeostazda faj-bakteri-konak etkileşimlerini incelemiştir. İnsan hastalığının hayvan modellerinde, IBD'de olduğu gibi bağırsak bariyeri bütünlüğündeki değişikliklerin bu etkileşimleri nasıl etkileyebileceği bilinmemektedir. Son çalışmalar, Caudovirales fajlarının IBD 7,8'li hastalarda zenginliği ve çeşitliliği artırdığını göstermiştir. Fare modellerinde, sürekli faj tedavisinin dekstran sodyum sülfat (DSS) kaynaklı deneysel kolit8'i şiddetlendirdiği gösterilmiştir. Faj-bakteri-konakçı etkileşimlerinin enflamatuar ortamlarda nasıl ortaya çıktığı ve bozulmuş bariyer bütünlüğünün faj kaynaklı inflamasyonu kolaylaştırıp kolaylaştırmadığı henüz belirlenmemiştir.

Sorun giderme ve alternatif yöntemler

Fare modelleri
Monokolonize fare modelleri, konakçı fizyolojisi16 üzerinde tek bir bakteri türünün sorgulanmasına izin verir. Monokolonize fareleri içeren araştırmalar, mikrobiyotanın bağışıklık sistemini nasıl etkilediğini aydınlatmada çok önemli bir rol oynamıştır22. Model bir sistem olarak, monokolonize fareler, geleneksel mikrobiyota muadillerinin fizyolojisini özetlemezler. GF farelerine daha çok benzeyen E. coli monokolonize fareler, mukus üretimini azaltmıştır (GF farelerinebenzer 50) ve olgunlaşmamış bir bağışıklık sistemi23. Bununla birlikte, monokolonize fareler, bireysel türlerin GI yolu ve bağışıklık gelişimi üzerindeki mikroplara özgü etkilerini çözmek için paha biçilmez olmuştur. Klasik bir örnek, parçalı filamentli bakterilerin (SFB) farelerde24 CD4+ T yardımcı 17 hücrelerinin güçlü indükleyicileri olduğunun keşfidir. Mukus ile ilgili olarak, mukus-gen transkripsiyonu51ve mukus kalınlığı50 üzerinde mikroba özgü etkiler vardır. Sınırlı olmakla birlikte, monokolonize fareler, kontrollü bir modelde bir faj-bakteri çiftinin memeli konakçı üzerindeki etkisini araştırmak için fırsatlar sunar. Daha da önemlisi, fajlar karmaşık bir mikrobiyota bağlamında araştırılabilir ve araştırılmalıdır. Yazma sırasında, az sayıda çalışma, geleneksel bir mikrobiyom içindeki kommensal bakteri türlerinin faj predasyonunun etkilerini ele almıştır. Bu, bu yazıda sunulan protokollerin gelecekteki bir uygulamasıdır ve bu çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanabilir.

Uygun araç kontrollerinin kullanılması
Herhangi bir deneyde uygun kontroller esastır. Burada, T4 faj lizatlarının çok aşamalı temizlenmesi ve saflaştırılmasını kontrol eden farelere oral uygulama için uygun bir araç tanımlandı. Önemli bir gereklilik, herhangi bir endotoksin aracılı bağışıklık tepkisini kontrol etmek için araç kontrolünün faj lizatı ile eşit düzeyde bakteriyel endotoksin içermesidir. Kloroform ve 1-oktanol, saflaştırma işleminin bir parçası olarak lizata eklenir ve daha sonra çıkarılır. Bu kimyasalların eser seviyelerinde üretilebilecek potansiyel bağışıklık tepkilerini kontrol etmek için, bir araç kontrolü olarak faj içermeyen bir bakteri lizatı üretilebilir. T4 faj ve araç lizatları, içme suyunda izin verilen seviyelerin çok altında, çok düşük konsantrasyonda bakteriyel endotoksin içeriyordu25 (Şekil 1B). Alternatif kontroller kullanılabilir ve amaçlanan araştırma sorusuna uyacak şekilde değiştirilebilir. En basit olarak, eşdeğer miktarda endotoksin içeren faj tamponu kullanılabilir, ancak bu, çok aşamalı temizleme ve saflaştırma işlemlerini hesaba katmaz. Gogokhia ve ark.8, DNA'sız faj proteininin bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için yeterli olup olmadığının bir kontrolü olarak ısıyla inaktive edilmiş faj kullanımını bildirmiştir. Elimizde, ısıyla inaktive edilmiş faj, T4 faj lizatından daha düşük endotoksin seviyelerine sahipti (Şekil 1B) ve bu nedenle bu çalışmada endotoksin seviyelerini kontrol etmek için kullanılmadı. Bununla birlikte, bireysel deneysel amaçlar için hangi yöntemin en uygun olduğunu belirlemek için her iki protokolün de test edilmesini teşvik ediyoruz. Araç ve T4 faj lizatları mevcut endotoksin miktarında önemli ölçüde farklılık gösteriyorsa, daha düşük seviyeleri içeren lizat, saflaştırılmış endotoksin ile desteklenebilir. 1-Oktanol, saflaştırma işlemi sırasında lizatlara eklenir, ancak kromojenik endotoksin miktar tayin kiti testini etkisiz hale getirir. Endotoksin ölçümlerinin doğru olduğundan emin olmak için numuneye potansiyel olarak müdahale eden maddelerle ürün inhibisyonunu test etmek önemlidir. Ürün inhibisyonundan şüpheleniliyorsa, numunenin yeterince uzun süre hızlı vakumlanmamış olması mümkündür. Sorunlar devam ederse, kalan 1-oktanol25'i çıkarmak için diyaliz kullanılabilir.

Uygulama yolu ve dozu
T4 fajın mukus bağlama kabiliyeti nedeniyle, fare modelleri tek bir oral gavaj dozunda aşılandı. Bunun amacı, GI yolunun faj ve E. coli birlikte yaşama süresini izlemekti; Bununla birlikte, in vivo modellerde fajı incelemeye yönelik başka yaklaşımlar da bildirilmiştir. Örneğin, farelere sürekli bir faj kaynağı sağlamak için fajla zenginleştirilmiş içme suyu kullanılmıştır 8,20. Bu uygulama yönteminin yararı, Gogokhia ve arkadaşları tarafından gösterildiği gibi, bir bakteri konakçısının yokluğunda bile fajların sürekli olarak yenilenmesidir.8. Bu deneysel tasarım, bakteri yokluğunda fajlara karşı bağışıklık tepkisinin değerlendirilmesine izin verdi ve deney boyunca sürekli bağışıklık stimülasyonu sağladı. Fizyolojik olarak, bu yöntem doğal bir faj enfeksiyonu seyrini veya bağırsak ortamının faj kolonizasyonunu temsil etmez, ancak tekrarlanan faj maruziyetinin bağışıklık sistemini nasıl hazırlayabileceğine dair önemli bilgiler sağlar. Bu, faj terapisi gelişimi bağlamında önemlidir, çünkü faj kokteylleri, antibiyotik rejimlerine benzer şekilde bağırsak bakteriyel enfeksiyonlarını tedavi etmek için bir tedavi yöntemi olarak verilebilir. T4 faj-E. coli çifti bağlamında, monokolonize farelere oral yoldan uygulanan T4 faj dozunun azaltılmasının fekal faj veya bakteri düzeylerini değiştirmediği belirlenmiştir (Şekil 2D, E). Bu nedenle, bu durumda T4 fajının aşılama dozu, stabil T4 faj-E'nin sürdürülmesi için çok önemli değildir. bikolonize farelerin bağırsaklarında koli kolonizasyonu. Uygulanan en düşük dozun 200 pfu / fare olduğu ve en yüksek dozun 2 x 106 pfu / fare olduğu belirtilmektedir (Hsu ve ark. 2. Bu nedenle, bu aralığın dışındaki T4 faj-E. coli kinetiğini destekleyen veriler bu çalışmada mevcut değildir.

Spot ve tüm plaka faj titreleri
Dışkı ve dokulardaki T4 faj seviyelerini ölçmek için, burada özetlenen protokoller, fareler arasındaki faj seviyelerindeki değişkenliğe katkıda bulunabilecek tüm plaka plak tahlillerinden ziyade nokta kaplama tekniklerine dayanır (Şekil 2B). Tüm plaka tekniklerinde, plaklar daha geniş bir alanda sayılır ve daha doğru miktar tayinine izin verir. Bununla birlikte, her numunenin uygun bir seyreltilmesi genellikle nokta kaplama ile önceden belirlenmelidir. Numuneler, numunenin alındığı gün test edildiğinden, daha yüksek verimli bir yaklaşım için nokta kaplamanın en uygun yöntem olduğu kabul edildi. Bu nedenle, bu verilerin çözünürlüğü, her bir numunedeki fajın büyüklüğü sırasına göre en doğru şekilde temsil edilir. Hassas faj ölçümleri için, her faj için ek hususlar vardır. Tüm plaka tahlilleriyle veya her numune için daha küçük seri seyreltme aralıkları kullanılarak daha doğru ölçümler elde edilebilir. Bu yöntemler hala değişken faj veya hedef bakteri sayımları ile sonuçlanıyorsa, faj ve bakteriler arasındaki benzersiz etkileşimlerin, metagenomik dizileme veya birlikte evrimi ve direnci deneysel olarak değerlendirmek için diğer yöntemler yoluyla bireysel fareler arasındaki farklılıkları açıklayıp açıklayamayacağını değerlendirmek ihtiyatlı olacaktır. Bonilla ve ark.25'e göre, plak tahlilleri için yumuşak agar hazırlarken, eklenen bakteri konakçısı miktarı ile tutarlı olmak önemlidir25. Şekil 3'te gösterildiği gibi, bakteri kültürü sürelerindeki (Şekil 3A) ve yoğunluktaki (Şekil 3B) nispeten küçük değişiklikler bile plak tahlillerinin doğruluğunu etkileyebilir. Bu bulgular diğer faj-bakteri çiftleri için farklı olabilir ve yeni organizmalarla başlarken benzer deneyler önerilir. Ek olarak, yeni faj-bakteri çiftleri için, her birinin büyüme özelliklerini belirlemek için keşif deneyleri yapılmalıdır. Örneğin, bakterilerin gecikmesini, üstel ve durağan fazlarını ve büyüme hızını belirlemek için büyüme eğrileri gerçekleştirilebilir. Tek aşamalı büyüme deneyi, fajların gizli dönemini (parçalanma süresi) ve patlama boyutunu (bakteri lizisi üzerine salınan faj sayısı) belirlemek için kullanılabilir52,53.

qPCR ile alternatif T4 faj ölçümü
Fajın miktarının belirlenmesi, yukarıda belirtildiği gibi plak tahlilleri veya kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) yoluyla gerçekleştirilebilir. Bu iki yaklaşımın önemli bir ayrımı vardır: plak tahlilleri, bakteri konakçılarını enfekte edebilen ve öldürebilen canlı faj sayısını belirlerken, qPCR fajlara özgü genetik materyali (mevcut faj sayısının bir temsilcisi olarak) ölçer, ancak fajın canlılığı ve enfektivitesi hakkında bilgi sağlamaz. qPCR'ler, Hsu ve ark.2 tarafından tarif edilen primerler kullanılarak plak tahlillerinde oluşturulan plaklarla faj gen kopyalarının miktar tayinini karşılaştırmak için yapıldı (Şekil 4). T4 faj DNA'sı, T4 faj / E. coli bikolonize farelerin çekal içeriğinden ekstrakte edildi ve amplifiye edildi. Çoğu farede, qPCR ve plak testleri, çekal içeriklerde benzer seviyelerde T4 faj tespit etti (Şekil 4A, B). Araç ile aşılanan çekal içeriklerde bir miktar amplifikasyon tespit edilirken, hesaplanan gen kopyaları/g tespit sınırının (LOD) altındaydı (Şekil 4A). Bu örneklerde ölçülebilir fajın yokluğu jel elektroforezi ile doğrulandı. T4 faj gen ürünleri (96 bp), T4 ile aşılanmış farelerin çekal içeriğinden izole edilen DNA'da kolayca görüntülendi, ancak araç kontrollerinde yoktu (Şekil 4C).

Bu testlerde, aynı örnekten alınan plak tahlillerinde T4'ün tespit edilememesine rağmen (Şekil 4B, ok) qPCR ile T4 faj kolonize edilmiş bir farenin çekal içeriğinde T4 faj gen kopyaları tespit edildi (Şekil 4A, ok). Bu sonuçlar, plak oluşturmayan viral partiküllerin, kusurlu viral partiküllerin üretimi veya faj ve/veya bakterilerin birlikte evrimi nedeniyle in vivo olarak ortaya çıkabileceğini düşündürmektedir. Dışkı bakterilerinin faj14'e duyarlılığını belirlemek için sert agar üzerinde bakteri kaplama teknikleri kullanılabilir. qPCR aracılı tespitin, kısa, korunmuş gen dizilerini hedeflediği göz önüne alındığında, bağırsak ortamında faj evrimi için daha sağlam olabileceğinden, in vivo faj iş akışlarına değerli bir katkı olabileceğini öne sürüyoruz. Metagenomik gibi önyargısız yaklaşımlar, faj-bakteri birlikte evrimini ve nispi bollukları incelemek için değerlidir, ancak sonuçta daha maliyetli olabilir.

Figure 4
Şekil 4: qPCR ile T4 fajının tespiti. (A,B) T4 faj yükleri, T4 faj veya araç ile aşılamadan sonraki 29. günde E. coli kolonize C57BL/6 farelerinin çekal içeriğinde (A) mutlak qPCR veya (B) plak testi ile ölçüldü. Ok, saptanabilir T4 genom kopyalarına sahip olan ancak çekal içeriğinde plaquable virüsü olmayan tek bir fareden elde edilen sonuçları gösterir. (C) T4 faj aşılanmış çekal numunelerinde 96 bp bandının varlığını gösteren, ancak araç ile aşılanmış numunelerde olmayan PCR ürünlerinin jel elektroforezi. 100 bp'lik bir DNA merdiveni kullanıldı. LOD = algılama sınırı. Hata çubukları ortalama ve SEM'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Uygulama
Bakteriyofajlar, mikrobiyomda bulunan virüs benzeri parçacıkların %90'ından fazlasını temsil eder44; Bununla birlikte, fajların bağırsak mikrobiyomu üzerindeki etkisi tam olarak anlaşılamamıştır. Mikrobiyomun bakteriyel bileşenini araştıran ilk çalışmalar, belirli türleri izole ederek ve bağışıklık olgunlaşması üzerindeki etkilerini inceleyerek bunu yaptı22,24. Phageom'un benzer sorgulamaları, göz korkutucu ama gerekli bir görev ve multibiyom46 hakkında kapsamlı bir anlayış kazanmak için bir gereklilik sunar. Faj tedavisi gelişiminin odak noktası septik bakteriyel enfeksiyonları iyileştirmeye yönelik olma eğiliminde olsa da, GI yoluna bir faj kokteyli eklenmesinin bağırsak ekosistemini nasıl değiştirebileceğini anlamak önemlidir. Ayrıca, terapötik faj kokteyllerinin güvenliği, bir bağışıklık profili oluşturularak değerlendirilmelidir. Fajlar, C. difficile5 ve Salmonella enterica serovar Typhimurium54 gibi bağırsak bakteriyel enfeksiyonları için potansiyel tedaviler olarak araştırılmıştır. Son çalışmalar ayrıca FFT'lerin preterm domuzlarda nekrotizan enterokolit tedavisinde eşit veya daha etkili olduğunu göstermiştir9, bu da fekal mikrobiyota nakillerinin (FMT'ler) viral bileşeninin hastalığın azaltılmasında aktif bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Fajların mikrobiyomdaki rolünü araştıran devam eden çalışmalar, bağırsak patojenlerine karşı faj tedavilerinin geliştirilmesini ilerletmek ve aynı zamanda FMT'leri hastalık tedavisi olarak daha iyi bilgilendirmek için garanti edilmektedir. Fajların in vivo olarak incelenmesi için yöntemleri standartlaştırarak, faj araştırmalarında şeffaflık ve tekrarlanabilirlik artırılacak ve çalışmalarını fare modellerine genişletenler için rehberlik sağlanacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar, bu araştırmayı yaptıkları arazinin xwməθkwəy̓əm (Musqueam) Ulusunun geleneksel, atalarından kalma ve işlenmemiş toprakları olduğunu kabul ediyorlar. Üzerinde bulunduğu arazi, binlerce yıldır kültürlerini, tarihlerini ve geleneklerini bu sitede bir nesilden diğerine aktaran Musqueam halkı için her zaman bir öğrenme yeri olmuştur. Diğerlerini, https://native-land.ca'da yaşadıkları ve çalıştıkları yerel topraklar hakkında daha fazla bilgi edinmeye teşvik ediyoruz. Yazarlar, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi (NSERC) Kanada Yüksek Lisans Bursları - Yüksek Lisans (NP), Michael Smith Sağlık Araştırmaları BC Stajyer Ödülü (RT-2023-3174, MH'ye), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Keşif Hibeleri Programı (RGPIN-2019-04591'den CT'ye, RGPIN-2016-04282'den LCO'ya), Kanada İleri Araştırma Enstitüsü / İnsanlar ve Mikrobiyom (FL-001253 Appt 3362, CT'ye), Michael Smith Sağlık Araştırmaları Vakfı Burs Ödülü (18239, CT'ye), Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (PJT-159458'den LCO'ya) ve Kanada İnovasyon Vakfı (34673'ten LCO'ya ve 38277'den CT'ye). UBC GREx Biyolojik Dayanıklılık Girişimi tarafından desteklenen UBC Hastalık Modelleme Merkezi ve ubcFLOW'un teknik desteği için ve makalenin eleştirel tartışmaları ve değerlendirilmesi için Osborne ve Tropini laboratuvarlarının üyelerine minnettarız. Şekil 1A ve Şekil 2A , Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octanol (99%) Thermofisher CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units Millipore Sigma  SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) Fisher BioReagents  BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 Millipore Sigma UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST BD Medical 365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)  Techiplast 1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BioRad 1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) Fisher BioReagents BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk Andwin Scientific  16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) Fisher C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm) Crosman Corporation 0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) Thermo Scientific  69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific  K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O Sigma Aldrich E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™  Fisher Bioreagents BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox  Fisher Bioreagents BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific  SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns QuantaBio 95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED Techiplast UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher BioReagents BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker Thermo Scientific  8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox Fisher BioReagents BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml Fisher 14-666-315
Parafilm sealing film Bemis PM-996
Phage stocks Carolina Biological Supply  n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT LabDiet 5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit Thermo Scientific  A39552S
RNase A (17,500 U) Qiagen 19101
RNase-free DNase Set Qiagen  79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) Fisher Chemical BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher Chemical S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) Fisher scentific  n/a
Sterile flexible film isolator  Class Biologically Clean  n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102
T100 Thermal Cycler  BioRad 1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) IDT n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) IDT n/a
TissueLyser II  Qiagen  85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure Thermo Scientific  AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free) Fisher BioReagents BP2484100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
  2. Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
  3. Gordillo Altamirano, F. L., Barr, J. J. Phage Therapy in the postantibiotic era. Clinical Microbiology Reviews. 32 (2), (2019).
  4. Schooley, R. T., et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
  5. Ott, S. J., et al. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology. 152 (4), 799-811.e7 (2017).
  6. Zuo, T., et al. Bacteriophage transfer during faecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection is associated with treatment outcome. Gut. 67 (4), 634-643 (2018).
  7. Norman, J. M., et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell. 160 (3), 447-460 (2015).
  8. Gogokhia, L., et al. Expansion of bacteriophages is linked to aggravated intestinal inflammation and colitis. Cell Host & Microbe. 25 (2), 285-299.e8 (2019).
  9. Brunse, A., et al. Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis. The ISME Journal. 16 (3), 686-694 (2022).
  10. Duerkop, B. A., Clements, C. V., Rollins, D., Rodrigues, J. L. M., Hooper, L. V. A composite bacteriophage alters colonization by an intestinal commensal bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17621-17626 (2012).
  11. Barr, J. J., et al. Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (26), 10771-10776 (2013).
  12. Nguyen, S., et al. Bacteriophage Transcytosis provides a mechanism to cross epithelial cell layers. mBio. 8 (6), (2017).
  13. Bichet, M. C., et al. Bacteriophage uptake by mammalian cell layers represents a potential sink that may impact phage therapy. iScience. 24 (4), 102287 (2021).
  14. Buttimer, C., et al. Impact of a phage cocktail targeting Escherichia coli and Enterococcus faecalis as members of a gut bacterial consortium in vitro and in vivo. Frontiers in Microbiology. 13, 936083 (2022).
  15. Li, Y., et al. Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model. Cell Reports Methods. 2 (11), 100324 (2022).
  16. Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20236-20241 (2013).
  17. Federici, S., et al. Targeted suppression of human IBD-associated gut microbiota commensals by phage consortia for treatment of intestinal inflammation. Cell. 185 (16), 2879-2898.e4 (2022).
  18. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science (New York, N.Y.). 363 (6434), (2019).
  19. Fluckiger, A., et al. Cross-reactivity between tumor MHC class I-restricted antigens and an enterococcal bacteriophage. Science (New York, N.Y.). 369 (6506), 936-942 (2020).
  20. Majewska, J., et al. Induction of Phage-Specific Antibodies by Two Therapeutic Staphylococcal Bacteriophages Administered per os. Frontiers in Immunology. 10, 2607 (2019).
  21. Weiss, M., et al. In vivo replication of T4 and T7 bacteriophages in germ-free mice colonized with Escherichia coli. Virology. 393 (1), 16-23 (2009).
  22. Thomson, C. A., Morgan, S. C., Ohland, C., McCoy, K. D. From germ-free to wild: modulating microbiome complexity to understand mucosal immunology. Mucosal Immunology. 15 (6), 1085-1094 (2022).
  23. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  24. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  25. Bonilla, N., et al. Phage on tap-a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks. PeerJ. 4, e2261 (2016).
  26. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2001).
  27. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 501, 69-76 (2009).
  28. Manikantha, B., Karthika, R., Murugadas, V., Vishnuvinayagam, S., Rao, B. M. Comparison of the single agar and double agar layer methods for enumeration of bacteriophages. Fishery Technology. 59, 60-63 (2022).
  29. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  30. Louten, J. Chapter 7 - Detection and diagnosis of viral infections. Essential Human Virology. , 111-132 (2016).
  31. Richter, Ł, et al. Adsorption of bacteriophages on polypropylene labware affects the reproducibility of phage research. Scientific Reports. 11 (1), 7387 (2021).
  32. Merck KGaA. Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices. , Darmstadt, Germany. https://www.emdmillipore.com/CA/en/product/Amicon-Ultra-15-Centrifugal-Filter-Unit,MM_NF-UFC901024#documentation (2018).
  33. Hecker, W., Witthauer, D., Staerk, A. Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 48 (4), 197-204 (1994).
  34. Jakočiūnė, D., Moodley, A. A Rapid bacteriophage DNA extraction method. Methods and Protocols. 1 (3), 27 (2018).
  35. Zucoloto, A. Z., Yu, I. L., McCoy, K. D., McDonald, B. Generation, maintenance, and monitoring of gnotobiotic mice. STAR Protocols. 2 (2), 100536 (2021).
  36. Ng, K. M., et al. Single-strain behavior predicts responses to environmental pH and osmolality in the gut microbiota. mBio. 14 (4), e0075323 (2023).
  37. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nature Reviews. Microbiology. , (2023).
  38. Bergstrom, K., Xia, L. The barrier and beyond: Roles of intestinal mucus and mucin-type O-glycosylation in resistance and tolerance defense strategies guiding host-microbe symbiosis. Gut Microbes. 14 (1), 2052699 (2022).
  39. Askar, M., Ashraf, W., Scammell, B., Bayston, R. Comparison of different human tissue processing methods for maximization of bacterial recovery. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 149-155 (2019).
  40. Redanz, S., Podbielski, A., Warnke, P. Improved microbiological diagnostic due to utilization of a high-throughput homogenizer for routine tissue processing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 82 (3), 189-193 (2015).
  41. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. 72, e50222 (2013).
  42. Reyes, A., Semenkovich, N. P., Whiteson, K., Rohwer, F., Gordon, J. I. Going viral: next-generation sequencing applied to phage populations in the human gut. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 607-617 (2012).
  43. Camarillo-Guerrero, L. F., Almeida, A., Rangel-Pineros, G., Finn, R. D., Lawley, T. D. Massive expansion of human gut bacteriophage diversity. Cell. 184 (4), 1098-1109.e9 (2021).
  44. Reyes, A., et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers. Nature. 466 (7304), 334-338 (2010).
  45. Bach, M. S., et al. Filamentous bacteriophage delays healing of Pseudomonas-infected wounds. Cell Reports. Medicine. 3 (6), 100656 (2022).
  46. Filyk, H. A., Osborne, L. C. The multibiome: The intestinal ecosystem's influence on immune homeostasis, health, and disease. EBioMedicine. 13, 46-54 (2016).
  47. Rohwer, F., Merry, Y., Maughan, H., Hisakawa, N. Heather Life in Our Phage World: A Centennial Field Guide to the Earth's Most Diverse Inhabitants. Wholon. , San Diego. (2014).
  48. Glonti, T., Pirnay, J. P. In Vitro techniques and measurements of phage characteristics that are important for phage therapy success. Viruses. 14 (7), 1490 (2022).
  49. Fraser, J. S., Yu, Z., Maxwell, K. L., Davidson, A. R. Ig-like domains on bacteriophages: a tale of promiscuity and deceit. Journal of Molecular Biology. 359 (2), 496-507 (2006).
  50. Li, H., et al. The outer mucus layer hosts a distinct intestinal microbial niche. Nature Communications. 6, 8292 (2015).
  51. Bergström, A., et al. Nature of bacterial colonization influences transcription of mucin genes in mice during the first week of life. BMC Research Notes. 5, 402 (2012).
  52. Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers. https://books.google.co.uk/books?id=3wVrAAAAMAAJ (1959).
  53. Kutter, E., Sulakvelidze, A. Bacteriophages: Biology and Applications. , CRC Press. https://books.google.co.uk/books?id=flHOvAEACAAJ (2004).
  54. Bao, H., et al. Dysbiosis and intestinal inflammation caused by Salmonella Typhimurium in mice can be alleviated by preadministration of a lytic phage. Microbiological Research. 260, 127020 (2022).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 203 Bakteriyofajlar fare modelleri gnotobiyotik mikrobiyota konak-patojen etkileşimleri T4 faj E. coli
Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve <i>E. coli</i> Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pett, N., Hunter, M., Carranza… More

Pett, N., Hunter, M., Carranza García, N. A., Seo, J. H., Collins, S. R., Rohwer, F., Osborne, L. C., Tropini, C. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (203), e65906, doi:10.3791/65906 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter