Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

T4 बैक्टीरियोफेज और ई. murine आंत में कोलाई बातचीत: विवो में मेजबान-बैक्टीरियोफेज गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोटाइप मॉडल

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65906
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1,3,4
1Department of Microbiology and Immunology, Life Sciences Institute, University of British Columbia, 2Department of Biology, San Diego State University, 3School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 4Humans and the Microbiome Program, Canadian Institute for Advanced Research

Summary

बैक्टीरियोफेज (फेज), वायरस जो बैक्टीरिया को संक्रमित करते हैं, आंत माइक्रोबायोम का एक अभिन्न अंग हैं। हालांकि ये सहजीवी निवासी बैक्टीरियल फिटनेस और जनसंख्या की गतिशीलता को चलाते हैं, लेकिन इस बारे में बहुत कम समझा जाता है कि वे आंत होमियोस्टेसिस और बीमारी को कैसे प्रभावित करते हैं। यह प्रोटोकॉल एक माउस मॉडल के भीतर अलग-थलग टी 4 फेज का अध्ययन करता है, जो अन्य फेज-बैक्टीरियल जोड़े के अनुकूल है।

Abstract

बैक्टीरियोफेज (फेज) वायरस हैं जो प्रजातियों के साथ बैक्टीरिया को संक्रमित करते हैं- और तनाव-स्तर की विशिष्टता और सभी ज्ञात पारिस्थितिक तंत्रों में सबसे प्रचुर मात्रा में जैविक संस्थाएं हैं। जीवाणु समुदायों के भीतर, जैसे कि आंत माइक्रोबायोटा में पाए जाते हैं, फेज को माइक्रोबायोटा जनसंख्या गतिशीलता को विनियमित करने और बैक्टीरिया के विकास को चलाने में फंसाया जाता है। पिछले दशक में फेज अनुसंधान में नए सिरे से रुचि रही है, आंशिक रूप से लिटिक फेज की मेजबान-विशिष्ट हत्या क्षमताओं के कारण, जो रोगाणुरोधी प्रतिरोधी बैक्टीरिया के बढ़ते खतरे का मुकाबला करने के लिए एक आशाजनक उपकरण प्रदान करते हैं। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि फेज आंतों के बलगम का पालन करते हैं, सुझाव देते हैं कि अंतर्निहित उपकला में बैक्टीरिया के आक्रमण को रोकने में उनकी सुरक्षात्मक भूमिका हो सकती है। महत्वपूर्ण रूप से, बैक्टीरियल माइक्रोबायोम की तरह, बाधित फेजोम सूजन आंत्र रोग जैसी बीमारियों में खराब परिणामों से जुड़े हुए हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि फेज फेकल फिल्ट्रेट प्रत्यारोपण के माध्यम से जानवरों और मनुष्यों के माइक्रोबायोम को संशोधित कर सकते हैं, जिससे मेजबान के स्वास्थ्य को लाभ होता है। अनुसंधान की इस हालिया लहर के साथ आंत माइक्रोबायोम के संदर्भ में फेज का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल स्थापित करने और मानकीकृत करने की आवश्यकता आती है। यह प्रोटोकॉल murine जठरांत्र संबंधी मार्ग के संदर्भ में पृथक T4 फेज और उनके जीवाणु मेजबान, Escherichia कोलाई का अध्ययन करने के लिए प्रक्रियाओं का एक सेट प्रदान करता है। यहां वर्णित विधियां बताती हैं कि फेज लाइसेट से कैसे शुरू किया जाए, इसे चूहों को प्रशासित किया जाए और बैक्टीरिया के मेजबान और फेज के स्तर पर प्रभाव का आकलन किया जाए। इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया जा सकता है और अन्य फेज-बैक्टीरियल जोड़े पर लागू किया जा सकता है और विवो में मेजबान-फेज गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है।

Introduction

बैक्टीरियोफेज, या फेज, वायरस हैं जो प्रजातियों और तनाव-स्तर विशिष्टता के साथ बैक्टीरिया को संक्रमित और मारते हैं1. फेज जटिल जीवाणु समुदायों जैसे आंत माइक्रोबायोटा के भीतर महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जहां उन्हें जनसंख्या की गतिशीलता को विनियमित करने और बैक्टीरिया फिटनेस2 चलाने में फंसाया गया है। पिछले दशक के दौरान, रोगाणुरोधी प्रतिरोधी रोगजनकों3 के उदय और वैकल्पिक उपचार रणनीति के रूप में फेज थेरेपी की क्षमता के कारण फेज अनुसंधान में नए सिरे से रुचि रही है। हाल के वर्षों में, लिटिक फेज कॉकटेल का उपयोग मनुष्यों में गंभीर, एंटीबायोटिक प्रतिरोधी जीवाणु सेप्टिक संक्रमण में कुछ सफलता के साथ अंतःशिरा रूप से किया गया है 3,4. आंतों के संक्रमण और सूजन के इलाज के लिए मौखिक फेज थेरेपी को एंटीबायोटिक दवाओं के संभावित विकल्प के रूप में भी प्रस्तावित किया गया है। इसके अलावा, फेज फेकल छानना प्रत्यारोपण (एफएफटी), जो फेकल माइक्रोबायोटा तैयारी है कि बैक्टीरिया को हटाने के लिए फ़िल्टर किया गया है की सफलता में फंसाया गया है, आवर्तक Clostridioides difficile संक्रमण (rCDI)5,6, सूजन आंत्र विकारों के उपचार में (आईबीडी)7,8 और पूर्व अवधि सूअरों में enterocolitis नेक्रोटाइज़िंग 9. इन परिणामों को देखते हुए, यह फेज और आंत माइक्रोबायोटा, और फेज और स्तनधारी मेजबान दोनों के बीच बातचीत पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में एक preexisting समुदाय में उपन्यास चरणों के अलावा एक पूरे के रूप में समुदाय पर अप्रत्यक्ष प्रभाव हो सकता है, और न केवल अपने लक्ष्य बैक्टीरिया 2,10.

इन विट्रो में उनके लक्ष्य बैक्टीरिया के साथ फेज इंटरैक्शन का अध्ययन आंत में फेज और बैक्टीरिया इंटरैक्शन के तंत्र और प्रभावों को समझने के लिए उपयोगी साबित हुआ है। इस सेटिंग में, यह दिखाया गया है कि आदेश Caudovirales के Escherichia कोलाई-विशिष्ट T4 चरणों को आंतों के बलगम11 का पालन करने के लिए विषाणु सतह पर अत्यधिक एंटीजेनिक बाहरी कैप्सिड (Hoc) प्रोटीन के भीतर स्थित इम्युनोग्लोबुलिन (Ig) जैसे डोमेन की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, ट्रांसवेल परख से पता चला है कि टी 4 फेज उपकला सेल संस्कृतियों के साथ बातचीत करने और मैक्रोपिनोसाइटोसिस12,13द्वारा सेल परतों के माध्यम से अनुवाद करने में सक्षम हैं। ये परिणाम इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि फेज अपने मेटाज़ोअन होस्ट के साथ बातचीत कर सकते हैं, भले ही वे यूकेरियोटिक कोशिकाओं को संक्रमित करने में असमर्थ हों। ये मॉडल, उपयोगी होते हुए, जटिल इंटरैक्शन की पूरी श्रृंखला का अभाव है जो एक आंत पारिस्थितिकी तंत्र में होते हैं जो फेज, बैक्टीरिया और मेटाज़ोन होस्ट के बीच त्रिपक्षीय बातचीत के व्यापक अन्वेषण के लिए आवश्यक होते हैं।

माउस मॉडल जटिल वातावरण के भीतर फेज की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं। फेज प्रशासन का एक वांछनीय अनुप्रयोग रोगाणुरोधी प्रतिरोधी संक्रमण या आईबीडी सहित पुरानी सूजन संबंधी बीमारियों से जुड़े पैथोबियोन्ट्स के इलाज के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में है। हालांकि, उभरते साहित्य से पता चलता है कि इन विट्रो में फेज व्यवहार पूरी तरह से विवो कार्यों में प्रतिनिधित्व नहीं करता है। Buttimer एट al.14 ने प्रदर्शित किया कि एक फेज कॉकटेल इन विट्रो में एक सरलीकृत मानव माइक्रोबायोटा कंसोर्टियम में लक्षित बैक्टीरिया को समाप्त करने में सक्षम था, लेकिन एक ही बैक्टीरिया-फेज कंसोर्टियम के साथ उपनिवेशित ग्नोटोबायोटिक चूहों में विवो में दोहराया नहीं जा सकता था। इसके अलावा, एक पारंपरिक माउस माइक्रोबायोम में, टी 7 फेज ने अपने लक्ष्य आंत बैक्टीरिया की चयनात्मक कमी का नेतृत्व किया, हालांकि समय के साथ क्रमिक वसूली देखी गई, विकसित प्रतिरोध15 का संकेत। अन्य अध्ययनों ने मौखिक रूप से प्रशासित फेज के सह-अस्तित्व और विवो 2,16 में उनके लक्ष्य जीवाणु उपभेदों का प्रदर्शन किया है। दरअसल, फेज / बैक्टीरिया सह-अस्तित्व से परे, फेज प्रशासन समग्र माइक्रोबायोटा समुदाय संरचना औरसमारोह 2,16 में व्यापक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व. यह रोग सेटिंग्स में प्रासंगिक है क्योंकि कई अध्ययनों में कॉडोविरल्स और आईबीडी 7,8,17 की बढ़ी हुई सापेक्ष बहुतायत के बीच संबंध पाए गए हैं जो बैक्टीरिया बहुतायत7 में परिवर्तन से स्वतंत्र थे। यह अज्ञात है कि यह रोग रोगजनन का चालक या परिणाम है या नहीं।

फेज जांच का ऐतिहासिक फोकस एक फेज और उसके लक्ष्य जीवाणु के बीच संबंधों के आसपास रहा है। हालांकि, फेज और म्यूकोसा, एपिथेलियम और मेटाज़ोअन होस्ट की प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच संभावित बातचीत पर विचार करना भी महत्वपूर्ण है। ये इंटरैक्शन सभी आंतों के फेज संक्रमण की समग्र प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसे प्रदर्शित करने के लिए, रोगाणु मुक्त (जीएफ) चूहों का उपयोग करके चरणों का अध्ययन किया गया है ताकि माइक्रोबायोटा8 द्वारा हस्तक्षेप के बिना प्रतिरक्षा प्रणाली पर उनके प्रभाव को स्पष्ट किया जा सके। इस प्रणाली में, फेज न्यूक्लिक एसिड का पता टोल-जैसे रिसेप्टर्स (टीएलआर) द्वारा लगाया गया था, जो फागोसाइटिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं (मैक्रोफेज और डेंड्राइटिक कोशिकाओं) के एंडोसोम के भीतर स्थित था। इसने डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग को सक्रिय किया और इंटरफेरॉन (IFN) -γ8 या टाइप I IFNs18 के टी सेल निर्भर उत्पादन को उत्तेजित किया। इसके अलावा, Fluckiger et al.19 ने फेज-एन्कोडेड (प्रोफ़ेज) एंटीजन की मान्यता में मेमोरी CD8+ T कोशिकाओं को फंसाया, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर एंटीजन के साथ टी सेल क्रॉस-रिएक्टिविटी हुई, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर का बोझ कम हो गया। अंत में, फेज विशिष्ट एंटीबॉडी उत्पादन माउस अध्ययन जहां फेज पीने के पानी 8,20 के माध्यम से एक निरंतर तरीके से पशु मॉडल के लिए वितरित किया गया था, या कई महीनों20 से अधिक मौखिक नलिका द्वारा प्रलेखित किया गया है, हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए फेज प्रोटीन के लिए क्षमता का प्रदर्शन. यद्यपि फेज इनोक्यूलेशन के ये तरीके प्रतिरक्षा प्रणाली के इष्टतम और निरंतर भड़काना की अनुमति देते हैं, वे फेज और आंतों के वातावरण के बीच स्वाभाविक रूप से होने वाली बातचीत का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं, न ही मौखिक रूप से लागू फेज थेरेपी के कैनेटीक्स। इस प्रकार अब तक, अध्ययनों की एक सीमित संख्या monocolonized माउस मॉडल21 में एक एकल जीवाणु प्रजातियों के साथ फेज की बातचीत की जांच की है. हालांकि, मोनोकोलोनाइज्ड चूहों ने गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ और प्रतिरक्षा विकास 22,23,24पर व्यक्तिगत प्रजातियों के सूक्ष्मजीव-विशिष्ट प्रभावों को समझने में महत्वपूर्ण साबित किया, और वे अभी तक फेज, उनके लक्ष्य बैक्टीरिया और मेटाज़ोन होस्ट के बीच त्रिपक्षीय बातचीत को समझने में उपयोगी साबित हो सकते हैं।

रोमांचक रूप से, आंतों के फेज और आंत कॉमेंसल बैक्टीरिया के बीच बातचीत के बारे में जानने के लिए अभी भी बहुत कुछ है, साथ ही मेटाज़ोअन होस्ट और इसके भीतर रहने वाले फेज के बीच होने वाली बातचीत भी है। यह प्रोटोकॉल एक ग्नोटोबायोटिक माउस मॉडल का उपयोग करके पृथक टी 4 फेज और इसके जीवाणु समकक्ष, ई कोलाई (के -12, BW25113) का अध्ययन करने के लिए प्रक्रियाओं का एक सेट प्रदान करता है। ये मानकीकृत प्रक्रियाएं ब्याज के जोड़े के लिए विकास मापदंडों को अनुकूलित करके अन्य फेज / बैक्टीरिया रंगों के अनुकूलन के लिए एक आधार भी प्रदान करती हैं। विधियों यहाँ रूपरेखा वर्णित: (1) चूहों के मौखिक नलिका के लिए T4 फेज और वाहन lysates की तैयारी; (2) ई कोलाई मोनोकोलोनाइज्ड ग्नोटोबायोटिक चूहों को टी 4 फेज का मौखिक प्रशासन; (3) समय के साथ माउस मल और ऊतकों में टी 4 फेज के स्तर की निगरानी।

यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणामों के लिए, शुद्ध टी 4 फेज लाइसेट्स को रोहवर लैब द्वारा बनाए गए फेज बैंक स्टॉक से प्रचारित किया गया था। T4 फेज के प्रचार के लिए फेज-ऑन-टैप विधिको 25 अनुकूलित किया गया था, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में संदर्भित है। विधि तीन दिनों के भीतर उच्च टिटर, एंडोटॉक्सिन-कम फेज स्टॉक पैदा करती है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, < 0.5 एंडोटॉक्सिन इकाइयों (ईयू)/एमएल के साथ टी 4 फेज के ≥10 10 पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) / एमएल के 10 एमएल नियमित रूप से एकत्र किए गए थे। चूहों में मौखिक या अंतःशिरा प्रशासन के लिए अनुशंसित एंडोटॉक्सिन का स्तर क्रमशः 20 ईयू / एमएल और ≤ 5 ईयू / किग्रा / एच (या 0.1 ईयू 20 ग्राम माउस के लिए 1 घंटे से अधिक प्रशासित) ≤ है, जिससे यह एक उपयुक्त तरीका है विवो टीकाकरण के लिए फेज तैयारी में। सभी फेज स्टॉक खारा मैग्नीशियम (एसएम) फेज बफर (चरण 1.1.5.1 में प्रदान की गई नुस्खा) में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे। एलबी मीडिया में ई कोलाई की खेती की गई थी। विभिन्न फेज बैक्टीरिया जोड़े के लिए, विविध संस्कृति मीडिया और विकास की स्थिति इस प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया जा सकता है. फेज को पर्यावरण से भी प्राप्त किया जा सकता है, जैसे अपशिष्ट जल, समुद्री पानी, मिट्टी और आंतों की सामग्री और प्रत्येक फेज-होस्ट जोड़ी के लिए उचित विकास और प्रसार की स्थिति का उपयोग करके तैयारी से पहले26 के अनुसार पृथक और शुद्ध किया जा सकताहै। वैकल्पिक रूप से, फेज वाणिज्यिक स्रोतों ( सामग्री की तालिकादेखें) या फेज बैंकों से प्राप्त किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रयोगों यूबीसी पशु देखभाल समिति और जैव सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल (A23-0113, B19-0038) द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे. चूहों को ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय में रोग मॉडलिंग केंद्र में रोगजनक मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था। C57BL/6 चूहों को एक बाँझ लचीली फिल्म आइसोलेटर में सुविधा के भीतर प्रतिबंधित किया गया था, जो बाँझ माउस आहार, पानी, बिस्तर और घोंसले के शिकार सामग्री के साथ प्रदान किया गया था। चूहों एक 12 घंटे दिन / रात चक्र पर बनाए रखा गया. प्रायोगिक चूहों, दोनों पुरुष और महिला, उम्र के 6 से 12 सप्ताह की उम्र के बीच लेकर, प्रत्येक प्रयोग के भीतर उम्र मिलान और सभी प्रयोगों के लिए 15-30 ग्राम वजन.

1. चूहों में मौखिक नलिका के लिए फेज और वाहन lysates की तैयारी

  1. फेज शुद्धिकरण और स्टॉक जनरेशन
    नोट: इस अध्ययन में, टी 4 फेज उगाए जाते हैं और नीचे वर्णित एकल अगर परत विधि का उपयोग करके बैक्टीरिया के लॉन पर चढ़ाना द्वारा टिटर किया जाता है। डबल अगर परत विधि पहले वर्णित किया गया है25,27और समान प्रभावकारिता के साथ भी इस्तेमाल किया जा सकता है। एकल अगर परत विधि इस प्रोटोकॉल के लिए चुना गया था के रूप में यह बेहतर पट्टिका दृश्यता प्रदान करता है28.
    1. बाँझ पॉलीस्टायर्न या ग्लास कल्चर ट्यूब (कैप के साथ) में बाँझ एलबी मीडिया के 5 एमएल में ई कोलाई उगाएं। स्थिर चरण तक पहुंचने तक, रात भर 200 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    2. पूरकता से पहले 0.5% अगर के साथ एलबी autoclaving और 50 डिग्री सेल्सियस या नीचे (जबकि एक तरल शेष) करने के लिए ठंडा करके एक गिलास मीडिया की बोतल में नरम अगर तैयार करें. प्लेट प्रति 15 एमएल के लिए पर्याप्त नरम अगर तैयार करें।
    3. प्रत्येक के लिए 1 मिमी की अंतिम एकाग्रता के लिए MgSO4 और CaCl2 के साथ नरम अगर पूरक. नरम अगर के हर 3 एमएल के लिए रात भर ई कोलाई संस्कृति के 100 माइक्रोन जोड़ें। नरम अगर में पूरक और संस्कृति homogenize करने के लिए एक चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग धीरे हिलाओ.
      नोट: ई की मात्रा और घनत्व में स्थिरता नरम अगर तैयारी करने के लिए जोड़ा जाता है कि महत्वपूर्ण है (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उल्लिखित).
    4. नरम अगर + ई कोलाई पेट्री डिश प्रति (15 सेमी व्यास) एक सीरोलॉजिकल विंदुक का उपयोग कर के 15 एमएल जोड़ें. प्लेटों को उसी दिन उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर सेट करने दें।
      नोट: प्लेटें खुली ढक्कन के साथ लगभग 20 मिनट में सेट हो जाएगा. अगर नरम रहेगा लेकिन प्लेटों उलटा कर रहे हैं जब शिफ्ट नहीं होगा.
    5. एसएम बफर में पतला करके 10 के कारकों में स्रोत टी 4 फेज के 8-10 धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करें। प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के स्पॉट 5 माइक्रोन। धब्बे सूखी, पलटा और 37 डिग्री सेल्सियस रात भर प्लेटों सेते करने के लिए अनुमति दें.
      1. खारा मैग्नीशियम (एसएम) फेज बफर तैयार करने के लिए, विआयनीकृत एच2ओ के 1 एल में, 100 एमएम एनएसीएल, 8 एमएम एमजीएसओ4·7एच2ओ, और 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4) को भंग कर दें। आटोक्लेव और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
        नोट: अगले दिन, ई. कोलाई नरम एलबी अगर भर में एक लॉन में विकसित किया जाना चाहिए था. सजीले टुकड़े, या ई कोलाई लॉन में दिखाई देने वाले विकास के साफ किए गए क्षेत्र, दिखाई देंगे जहां संक्रमित ई कोलाई मेजबानों की फेज हत्या हुई। प्रत्येक पट्टिका एक पट्टिका बनाने की इकाई (पीएफयू) का प्रतिनिधित्व करती है।
    6. टिप के अंत में एक अगर प्लग बनाने, पट्टिका के केंद्र में एक बाँझ विंदुक टिप धक्का द्वारा नरम अगर थाली से एक एकल पट्टिका उठाओ. एक 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एसएम बफर के 1 एमएल में पट्टिका प्लग को फिर से निलंबित करें। भंवर मिश्रण करने के लिए 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर ट्यूब.
    7. लाइसेट से किसी भी मलबे को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 4000 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला एक नई microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण.
    8. पृथक फेज प्रचार करने के लिए, 1.1.1-1.1.3 कदम दोहराएँ. एक शंक्वाकार ट्यूब में ई कोलाई युक्त नरम अगर के 15 एमएल विभाज्य के लिए पृथक फेज के 100 माइक्रोन जोड़ें। मिश्रण और एक पेट्री डिश में अगर डालना करने के लिए ट्यूब तीन बार पलटना.
    9. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर उलटने और इनक्यूबेट करने से पहले सूखने दें। ई कोलाई व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए फेज के बिना एक लॉन नियंत्रण प्लेट तैयार करें।
      नोट: रात भर इनक्यूबेशन के बाद, नियंत्रण प्लेट में ई.कोलाई का लॉन होना चाहिए, जबकि फेज युक्त प्लेट को पूरी तरह से lysed किया जाना चाहिए।
    10. थाली से फेज निकालने के लिए, फेज मंजूरी दे दी थीली की सतह के लिए एसएम बफर के 5 एमएल जोड़ने के लिए और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए एक घुमाव पर 70 आरपीएम पर हिला.
    11. अगर प्लेट से किसी भी मलबे को गोली देने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 50 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब और 4000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र में प्लेट से बफर एकत्र करें।
    12. T4 फेज स्टॉक लाइसेट को एक नई ट्यूब में इकट्ठा करें और अनुमापन और प्रसार तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: टी 4 फेज 10 साल25 से अधिक के लिए स्थिर हैं; हालांकि, स्थिरता फेज और भंडारण की स्थिति के प्रकार पर निर्भर करेगी। फेज टिटर भी भंडारण समय के साथ अलग-अलग होगा। फेज ठंड के प्रति संवेदनशील हैं। इसलिए, क्रायोप्रेज़र्वेशन तरल नाइट्रोजन में अनुशंसित है और फ्रीज-पिघलना चक्रों से परहेज करता है क्योंकि यह फेज को नुकसान पहुंचा सकता है, फेज टिटर25 को कम कर सकता है।
    13. पीएलयू / एमएल में एकाग्रता निर्धारित करने के लिए टी 4 फेज स्टॉक लाइसेट को टिटर करें, जैसा कि पहले 25,29,30 वर्णित था। एक उच्च टिटर T4 फेज स्टॉक में 108 pfu/mL या अधिक होगा।
  2. प्रयोगात्मक फेज lysates की तैयारी
    1. संस्कृति ई. बाँझ polystyrene या ग्लास संस्कृति ट्यूबों में एलबी मीडिया के 5 एमएल में कोलाई (टोपी के साथ). स्थिर चरण तक पहुंचने तक, 200 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    2. उपसंस्कृति रातोंरात ई. कोलाई संस्कृति 1:50 में 100 एमएल एलबी मीडिया एक गिलास शंक्वाकार फ्लास्क में. 200 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक बैक्टीरिया मध्य घातीय चरण (लगभग 1.5 एच) के लिए जल्दी तक पहुंच गए हैं.
      नोट: 600 एनएम (आयुध डिपो600) रेंज पर ऑप्टिकल घनत्व निर्धारित करने के लिए एक प्रारंभिक विकास वक्र किया जा सकता है, जिस पर जीवाणु संस्कृति घातीय चरण में है। एक ग्लास शंक्वाकार ट्यूब में संस्कृति का सुझाव दिया गया है क्योंकि हाल के सबूतों में पाया गया है कि फेज पॉलीप्रोपाइलीन31 जैसे प्लास्टिक का पालन करने में सक्षम हैं।
    3. ई कोलाई उपसंस्कृति में चरण 1.1 से उच्च अनुमापांक टी 4 फेज स्टॉक के 100 माइक्रोन जोड़ें और 3 घंटे के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, या जब तक कि नया लाइसेट अब बादल न हो। 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में टी 4 फेज lysate लीजिए और या तो सफाई कदम के लिए सीधे आगे बढ़ना या, यदि आवश्यक हो, अगले दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
      नोट: एक बड़ा फेज फट आकार (प्रतिकृति चक्र प्रति जारी विषाणु की एक उच्च औसत संख्या का संकेत) कदम 1.2.2 में जीवाणु उपसंस्कृति के लिए एक लंबी इनक्यूबेशन अवधि की आवश्यकता है. यह फेज स्टॉक के साथ स्पाइकिंग से पहले बैक्टीरिया घनत्व में वृद्धि प्रदान करता है।
    4. अपकेंद्रित्र किसी भी शेष बैक्टीरिया और सेलुलर मलबे को गोली देने के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4000 x ग्राम पर lysates है। एक 0.22 माइक्रोन नायलॉन फिल्टर का उपयोग कर जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला फिल्टर बाँझ और नए 50 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए छानना स्थानांतरण.
    5. किसी भी शेष बैक्टीरिया को मारने और बैक्टीरिया के विकास को रोकने के लिए फ़िल्टर्ड टी 4 फेज लाइसेट की प्रत्येक मात्रा में क्लोरोफॉर्म की 0.1 मात्रा जोड़ें। भंवर संक्षेप में मिश्रण और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
      नोट: लिपिड लिफाफे फेज क्लोरोफॉर्म, जो फेज अनुमापांक25 को कम कर सकते हैं के प्रति संवेदनशील हैं. यदि आवश्यक हो तो इस चरण को छोड़ दें।
      सावधानी: क्लोरोफॉर्म एक जहरीला कार्बनिक विलायक है जो त्वचा के माध्यम से श्वास, अंतर्ग्रहण या अवशोषित होने पर खतरनाक होता है। क्लोरोफॉर्म के साथ काम करते समय एक धूआं हुड और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करें। क्लोरोफॉर्म के साथ काम करते समय पॉलीस्टाइनिन सीरोलॉजिकल पिपेट के बजाय ग्लास का उपयोग करें, क्योंकि यह अधिकांश प्लास्टिक के साथ संगत नहीं है। क्लोरोफॉर्म को 1.2.5-1.2.6 चरणों के लिए पॉलीप्रोपाइलीन शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूबों में रखा जा सकता है, लेकिन प्लास्टिक ट्यूबों में लंबे समय तक संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए।
    6. क्लोरोफॉर्म को लाइसेट से अलग करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 4000 x ग्राम पर लाइसेट को सेंट्रीफ्यूज करें। अंतर्निहित क्लोरोफॉर्म परत को परेशान किए बिना शीर्ष लाइसेट परत को एक नई 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। क्लोरोफॉर्म कचरे को उपयुक्त खतरनाक तरल अपशिष्ट कंटेनर में फेंक दें। स्टोर lysates 4 डिग्री सेल्सियस पर एकाग्रता और बफर विनिमय अगले दिन जब तक.
    7. डिवाइस के ऊपरी जलाशय में फेज लाइसेट के 13 एमएल जोड़कर और 5 मिन के लिए 4000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके, या जब तक अधिकांश लाइसेट निचले जलाशय में फिल्टर के माध्यम से पारित नहीं हो जाता, तब तक 100 केडीए केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस (सामग्री की तालिकादेखें) में फेज lysates को केंद्रित करें।
      नोट: स्पिन समय के अंत में लगभग 2 एमएल लाइसेट रखने का लक्ष्य रखें। चूंकि लाइसेट के अतिरिक्त फिल्टर में फेज एकाग्रता बढ़ जाती है, स्पिन समय की संभावना बढ़ जाएगी। केन्द्रापसारक फिल्टर उपकरणों एक भौतिक मृत बंद हो गया है उन्हें कताई सूखी32 से रोकने के लिए है. फिल्टर झिल्ली को सूखने न दें यदि निरंतर उपयोग का इरादा है (यानी, ऊपरी जलाशय से सभी तरल को हटाकर)। फेज प्रकार और अनुमापांक के आधार पर स्पिन समय भिन्न हो सकते हैं।
    8. एक P200 या P1000 विंदुक का प्रयोग, धीरे प्रत्येक स्पिन के बाद फिल्टर झिल्ली खोलना करने के लिए ऊपरी जलाशय के भीतर ऊपर और नीचे lysate के शेष ~ 2 एमएल विंदुक. निचले जलाशय से छानना एक अपशिष्ट कंटेनर में त्यागें, ऊपरी जलाशय में केंद्रित फेज को छोड़ दें।
    9. दोहराएँ चरण 1.2.7-1.2.8 जब तक फेज lysate की पूरी मात्रा फिल्टर डिवाइस के माध्यम से पारित किया गया है, प्रत्येक स्पिन के बाद ऊपरी जलाशय में बनाए रखा ध्यान केंद्रित फेज के ~ 2 एमएल के साथ.
    10. ऊपरी जलाशय में ऊपर और नीचे शेष lysate (~ 2 एमएल) pipetting द्वारा अंतिम स्पिन के बाद फिल्टर झिल्ली अनलॉग. ऊपरी जलाशय में एसएम बफर के 12 एमएल जोड़कर फेज (बफर एक्सचेंज) को धोएं और 10 मिन के लिए 4000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें, या जब तक कि अधिकांश बफर फिल्टर से गुजर न जाए।
    11. छानना त्यागें और धोने कदम (1.2.10 कदम) दोहराएँ. लंबी अवधि के भंडारण के लिए 10 एमएल (या उससे कम) की अंतिम मात्रा में एसएम बफर में शेष 2 एमएल लाइसेट को फिर से निलंबित करें। लाइसेट को 50 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और एंडोटॉक्सिन हटाने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए इस स्तर पर फेज को टिटर करना वैकल्पिक है कि फेज लाइसेट केंद्रित किया गया है (>10 8 पीएफयू / एमएल), और एंडोटॉक्सिन हटाने की प्रक्रिया के दौरान फेज हानि का निर्धारण करने के लिए।
    12. लाइसेट की कुल मात्रा में 1-ऑक्टानॉल ( सामग्री की तालिकादेखें) के 0.4 वॉल्यूम जोड़कर टी 4 फेज लाइसेट से दूषित एंडोटॉक्सिन निकालें।
      नोट: एंडोटॉक्सिन को हटा दिया जाता है क्योंकि वे अत्यधिक इम्युनोस्टिमुलेटरी होते हैं, और इसलिए उनकी उपस्थिति से फेज-स्वतंत्र जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया25 को शामिल किया जा सकता है।
      सावधानी: 1-ऑक्टेनॉल एक मजबूत गंध के साथ एक सुगंधित, कार्बनिक, ज्वलनशील यौगिक है और एक आंख अड़चन है। 1-ऑक्टानॉल के साथ काम करते समय उपयुक्त पीपीई पहनें। वाष्प साँस लेना से बचने के लिए एक धूआं हुड में सभी काम करें। धूआं हुड के बाहर काम करते समय ट्यूबों के रिसाव को रोकने के लिए सीलिंग फिल्म का उपयोग करें।
    13. लीक को रोकने के लिए सीलिंग फिल्म के साथ शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब के ढक्कन को सील करें। एक मंच पर 120 आरपीएम पर हिलाएं या 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रॉकिंग शेकर, इसके बाद 1.5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद, बिना हिलाए।
    14. 1-ऑक्टानॉल से एंडोटॉक्सिन-क्लियर लाइसेट को अलग करने के लिए 10 मिनट के लिए 4000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। 1-ऑक्टानॉल परत लाइसेट के ऊपर तैरती रहेगी। जितना संभव हो उतना 1-ऑक्टानॉल को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए P1000 विंदुक का उपयोग करें और उपयुक्त खतरनाक/ज्वलनशील तरल अपशिष्ट कंटेनर में त्यागें।
    15. शेष 1-ऑक्टानॉल परत के नीचे फेज लाइसेट को इकट्ठा करने के लिए 18 जी सुई और 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करें, ध्यान रखें कि 1-ऑक्टानॉल परत एकत्र न करें। स्पीड वैक्यूम तक 4 डिग्री सेल्सियस पर लाइसेट स्टोर करें।
    16. टी 4 फेज लाइसेट के 1 एमएल एलिकोट को बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 4000 x ग्राम पर खुले ढक्कन के साथ स्पीड वैक्यूम लाइसेट से अवशिष्ट 1-ऑक्टानॉल को वाष्पित करने के लिए। 3 घंटे के लिए स्पीड वैक्यूम या जब तक फेज lysate मात्रा 30% 25 से कम कर दिया गया है. अनुमापन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    17. pfu/mL में एकाग्रता निर्धारित करने के लिए फेज lysate टिटर. वांछित एकाग्रता के लिए एसएम बफर में परिणामी टी 4 फेज लाइसेट को पतला करें और पुष्टि करने के लिए फिर से टिटर करें।
    18. निर्माता निर्देशों के अनुसार क्रोमोजेनिक एंडोटॉक्सिन क्वांटिटेशन किट का उपयोग करके टी 4 फेज लाइसेट में मौजूद एंडोटॉक्सिन की मात्रा निर्धारित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। एक पूर्व एंडोटॉक्सिन हटाने के नमूने, वाहन नियंत्रण, बफर, और माउस पीने के पानी के साथ अंतिम फेज lysate में एंडोटॉक्सिन के स्तर की तुलना करें.
      नोट: क्रोमोजेनिक एंडोटॉक्सिन मात्रा का ठहराव किट 1-ऑक्टानॉल25 द्वारा निष्क्रिय है। एंडोटॉक्सिन की मात्रा निर्धारित करने से पहले 1-ऑक्टानॉल (चरण 1.2.16) को हटाने के लिए गति वैक्यूम कदम करें। आसुत जल के लिए एंडोटॉक्सिन सामग्री 20 ईयू / एमएल25 पर अनुमानित है; हालांकि, माउस पीने के पानी की एंडोटॉक्सिन सामग्री सुविधाओं के बीच भिन्न हो सकती है। यदि फेज लाइसेट में एंडोटॉक्सिन का स्तर पीने के पानी में मौजूद मात्रा से अधिक है, तो एंडोटॉक्सिन हटाने के चरणों (1.2.12-1.2.16) को दोहराने पर विचार करें।
    19. स्टोर केंद्रित, एंडोटॉक्सिन-साफ़ टी 4 फेज 4 डिग्री सेल्सियस पर एसएम बफर में lysates है।
  3. वाहन नियंत्रण के लिए फेज मुक्त बैक्टीरियल लाइसेट की तैयारी
    नोट: एक फेज मुक्त बैक्टीरियल लाइसेट को चरण 1.2 में फेज लाइसेट के उत्पादन में उत्पन्न बैक्टीरियल दूषित पदार्थों (जैसे, एंडोटॉक्सिन) के कारण किसी भी प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए एक वाहन के रूप में तैयार किया जा सकता है, जो चूहों में टीका लगाए जाने पर प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकता है।
    1. ई कोलाई की रातोंरात संस्कृति से, एलबी मीडिया के 100 एमएल में ई कोलाई 1:50 उपसंस्कृति। फेज जोड़ने के बिना, 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए बैक्टीरिया संस्कृति के लिए जारी रखें, या चरण 1.2 में उत्पादित फेज लाइसेट के लिए इनक्यूबेशन समय से मेल खाते हैं।
    2. मैन्युअल रूप से बैक्टीरिया कोशिकाओं को लाइज़ करने के लिए 30 एस दालों (3x) के लिए 30 किलोहर्ट्ज़ पर बर्फ पर एक सोनिकेटर जांच (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों और लाइज़ कोशिकाओं को ई कोलाई संस्कृति स्थानांतरित करें।
    3. चरण 1.2 के अनुसार प्रोटोकॉल के बाकी का पालन करें, कदम 1.2.4 पर शुरू, सभी सफाई सहित, धोने और endotoxin हटाने कदम.
      नोट: केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस का उपयोग एकाग्रता के दौरान, फेज की अनुपस्थिति के कारण, वाहन लाइसेट फेज लाइसेट की तुलना में फिल्टर के माध्यम से अधिक तेज़ी से बहेगा। इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए 5 मिनट से 2-5 मिनट तक सेंट्रीफ्यूजेशन समय छोटा करें कि अल्ट्राफिल्टर झिल्ली लंबे समय तक सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान सूख नहीं जाती है।
    4. यह पुष्टि करने के लिए वाहन लाइसेट को टिटर करें कि इसमें फेज नहीं है।
    5. वाहन लाइसेट में एंडोटॉक्सिन के स्तर को मापने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्रोमोजेनिक एंडोटॉक्सिन क्वांटिटेशन किट का उपयोग करें। फेज लाइसेट में एंडोटॉक्सिन के स्तर से मेल खाने के लिए एसएम बफर में वाहन लाइसेट को पतला करें।
  4. वैकल्पिक प्रयोगात्मक नियंत्रण: गर्मी निष्क्रिय फेज lysate की तैयारी
    नोट: फेज मुक्त बैक्टीरियल लाइसेट का एक विकल्प एक गर्मी-निष्क्रिय फेज लाइसेट है। गर्मी-निष्क्रियता फेज विषाणुओं को अलग करती है, जबकि अवशिष्ट एंडोटॉक्सिन जैसे लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) गर्मीस्थिर 8,33 हैं। इस विधि का उपयोग गोगोखिया एट अल.8 द्वारा यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि प्रतिरक्षा सक्रियण के लिए बरकरार, व्यवहार्य फेज विषाणुओं की आवश्यकता थी या नहीं। शोधकर्ताओं को दोनों तरीकों (फेज-मुक्त बनाम गर्मी-निष्क्रिय) का परीक्षण करने और यह निर्धारित करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है कि उनकी प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के लिए कौन सा नियंत्रण सबसे उपयुक्त है। जो भी चुना जाता है, यह स्वीकार करना महत्वपूर्ण है कि फेज स्टॉक को ध्यान केंद्रित करने और साफ करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण हेरफेर के कारण एक बफर नियंत्रण उपयुक्त होने की संभावना नहीं है।
    1. ढक्कन ताले के साथ लगे बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के लिए चरण 1.2 (माउस प्रति 100 माइक्रोन) से साफ, शुद्ध और पतला टी 4 फेज लाइसेट की आवश्यक मात्रा स्थानांतरित करें।
    2. 15 मिनट16 के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हीट ब्लॉक पर हीट लाइसेट्स।
    3. वैकल्पिक: यदि फेज/बैक्टीरियल न्यूक्लिक एसिड को हटाने की आवश्यकता है, तो जैकोसियुनी और मूडली34 के अनुसार डीएनएसई I और RNase A उपचार करें। संक्षेप में:
      1. गर्मी-निष्क्रिय फेज लाइसेट के 450 माइक्रोन में 50 माइक्रोन डीएनएसई I 10x बफर, 1μL DNase I (1 U/μL) और 1 μL RNase A (10 मिलीग्राम/एमएल) ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
      2. एक गर्मी ब्लॉक में 1.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर lysates सेते हैं, मिलाते बिना.
      3. 20 माइक्रोन 0.5 एम एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए)34जोड़कर डीनेस आई और आरएनएसई ए को निष्क्रिय करें।
    4. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर lysates पकड़ो ठंडा करने के लिए और lysates गठबंधन अगर कई ट्यूबों का उपयोग किया जाता है. अनुमापन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. यह पुष्टि करने के लिए एक फेज टिटर करें कि लाइसेट में कोई व्यवहार्य टी 4 फेज मौजूद नहीं है। 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी-निष्क्रिय lysates स्टोर करें।
    6. गर्मी-निष्क्रिय लाइसेट में एंडोटॉक्सिन के स्तर को मापने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्रोमोजेनिक एंडोटॉक्सिन क्वांटिटेशन किट का उपयोग करें। मिलान फेज lysate में मौजूद एंडोटॉक्सिन के स्तर के अनुसार एसएम बफर में गर्मी निष्क्रिय lysate पतला.

2. प्रशासन और ई में T4 फेज की निगरानी monocolonized चूहों

  1. ई कोलाई के साथ चूहों का एकाधिकार
    1. जीएफ चूहों8 में प्रशासन के लिए ई कोलाई तैयार ई. कोलाई एलबी मीडिया में एक ही कॉलोनी से उठाया रात भर.
    2. सख्त, बाँझ शर्तों35 के तहत, ई कोलाई संस्कृति के 200 माइक्रोन जीएफ चूहों को या तो बाँझ विनाइल आइसोलेटर्स या मौखिक नलिका द्वारा bioexclusion वायुरोधी पिंजरों में रखे प्रशासन करते हैं। यदि एरोटॉलरेंट बैक्टीरिया का उपयोग करते हैं, तो चूहों को प्रत्येक माउस के पीछे बैक्टीरिया संस्कृति के 200 माइक्रोन के आवेदन द्वारा उपनिवेशित किया जा सकता है।
      नोट: टीकाकरण खुराक तनाव निर्भर होगा, क्योंकि विभिन्न बैक्टीरिया अलग-अलग पीएच जीवित रहने कीक्षमता36,37प्रदर्शित करते हैं। ज़ुकोलोटो एट अल.35 प्रति जानवर 1 x 108 सीएफयू के साथ टीकाकरण की सलाह देते हैं। यहां दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम रातोंरात संस्कृति के साथ टीका लगाए गए चूहों से उत्पन्न हुए थे (सीएफयू निर्धारित नहीं किया गया था)। पायलट प्रयोगों ब्याज की माउस तनाव के विश्वसनीय उपनिवेशण में परिणाम है कि एक खुराक निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है. मौखिक नलिका द्वारा प्रशासित किया जा करने के लिए बैक्टीरिया की मात्रा उम्र और चूहों के वजन से प्रभावित हो सकता है. अधिकतम स्वीकार्य खुराक के लिए व्यक्तिगत प्रयोगशाला या संस्थागत पशु नैतिकता प्रोटोकॉल से परामर्श करें। यहाँ सुझाव मात्रा माउस शरीर के वजन के 10% की एक नलित्र भत्ता पर आधारित है (उदाहरण के लिए, 200 माइक्रोन एक 20 ग्राम माउस के लिए अधिकतम). कुछ जीवाणु प्रजातियां पेट की अम्लता को बर्दाश्त नहीं करेंगी और आंत को उपनिवेश बनाने में विफल रहेंगी। पेट एसिड2 को बेअसर करने के लिए 1 एम NaHCO3 के 100 माइक्रोन के साथ पहले gavaging पर विचार करें. यदि उपनिवेश बनाने के लिए सख्त एनारोब का उपयोग किया जाता है, तो सूक्ष्म जीव को एनारोबिक परिस्थितियों में उगाया जाना चाहिए और व्यक्तिगत रूप से तैयार एयर-टाइट कंटेनरों (प्रत्येक माउस के लिए 1) में ग्नोटोबायोटिक पशु सुविधा में स्थानांतरित करना होगा। ऑक्सीजन एक्सपोजर के कारण माइक्रोबियल व्यवहार्यता के नुकसान को सीमित करने के लिए कंटेनर खोले जाने के बाद प्रत्येक नलिका को जल्दी से करें।
    3. प्रतिकूल स्वास्थ्य प्रभाव के लिए चूहों की निगरानी.
      नोट: प्रतिकूल स्वास्थ्य प्रभावों की स्थिति में, संबंधित पशु देखभाल सुविधा द्वारा निर्धारित मानकों को देखें। संभावित प्रतिकूल स्वास्थ्य प्रभावों में शामिल हैं, लेकिन इन तक सीमित नहीं हैं: (1) नलिका द्रव की आकांक्षा: लक्षणों में नाक के माध्यम से बुलबुले का निष्कासन, "खुला मुंह" सांस लेना / हांफना शामिल है। (2) अन्नप्रणाली का छिद्र: लक्षणों में तेजी से बीमार स्वास्थ्य, कूबड़, सुस्ती शामिल है, जिससे 24 घंटे के भीतर जानवर की मृत्यु हो जाती है। (3) बार-बार गैवेज के कारण अन्नप्रणाली की सूजन: लक्षणों में गैवेज सुई डालने में कठिनाई शामिल है। (4) माइक्रोबायोम में परिवर्तन के कारण दस्त।
    4. प्रति सप्ताह कम से कम एक बार संवर्धन करके और / या 16 एस आरआरएनए अनुक्रमण35 द्वारा फेकल छर्रों में बैक्टीरियल उपनिवेशण की पुष्टि करें।
      नोट: यदि प्रयोगात्मक चूहों के उत्पादन के लिए एक ग्नोटोबायोटिक आइसोलेटर के भीतर प्रजनकों का उपनिवेश करना, तो 6 सप्ताह पुरानी पहली पीढ़ी की संतानों (एफ 1) प्रयोगात्मक चूहों की पीढ़ी के लिए कम से कम 9 सप्ताह पहले योजना बनाएं। वैकल्पिक रूप से, GF वयस्क चूहों monocolonized किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण में, फेज टीका से पहले 7 सप्ताह के बाद उपनिवेशीकरण की प्रतीक्षा करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह जीएफ चूहों38 में एक जटिल माइक्रोबायोटा की शुरूआत के बाद आंतों के श्लेष्म को स्थिर करने के लिए आवश्यक समय है।
  2. ई में T4 फेज का मौखिक टीकाकरण . कोलाई monocolonized चूहों
    1. पतला T4 फेज lysates और वाहन नियंत्रण एसएम बफर में एक पूर्व निर्धारित एकाग्रता के लिए. एचएसयू एट अल.2 के अनुसार, 2 x 106 पीएफयू प्रति माउस2 के प्रशासन की अनुमति देने के लिए फेज lysates पतला.
      नोट: फेज की एक उच्च या निम्न एकाग्रता विवो में फेज की स्थिरता के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रति माउस टी 4 फेज के 2 x 102, 2 x 104 और 2 x 106 pfu की खुराक के परिणामस्वरूप आंत में स्थिर और दीर्घकालिक उपनिवेशण हुआ जो खुराक पर निर्भर नहीं था (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में दिखाया गया है)। इसलिए फेज-बैक्टीरिया कैनेटीक्स को बड़े पैमाने पर प्रयोगों से पहले विवो में पायलट किया जाना चाहिए।
    2. बाँझ, ग्नोटोबायोटिक स्थितियों के तहत, पेट एसिड को बेअसर करने के लिए आटोक्लेव्ड 1 एम NaHCO3 के 100 माइक्रोन के साथ प्रत्येक माउस को गैवेज करें। 10 मिनट प्रतीक्षा करें, फिर टी 4 फेज लाइसेट या वाहन नियंत्रण के 100 माइक्रोन के साथ नलिहा।
    3. प्रतिकूल स्वास्थ्य प्रभाव के लिए चूहों की निगरानी.

3. विवो में T4 फेज के स्तर की निगरानी

नोट: एक बार चूहों को फेज के साथ टीका लगाया गया है, दोनों फेज और लक्ष्य बैक्टीरिया की एकाग्रता को फेकल या ऊतक के नमूनों में मापा जा सकता है। यह फेज संक्रमण के कैनेटीक्स और दोनों जीवों के उपनिवेशण गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

  1. स्पॉट चढ़ाना T4 फेज फेकल छर्रों में एकाग्रता निर्धारित करने के लिए
    1. प्रत्येक माउस से बाँझ में फेकल छर्रों लीजिए, पूर्व तौला, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों टी 4 फेज और ई कोलाई के स्तर को मापने के लिए. चढ़ाना तक बर्फ पर स्टोर ट्यूबों.
      नोट: एयरोटॉलरेंट बैक्टीरिया के विकास को धीमा करने के लिए संग्रह और चढ़ाना के बीच अंतरिम में बर्फ पर नमूने रखें। कई घंटों तक, अभी भी एरोबिक बैक्टीरिया की वृद्धि हो सकती है, या ऑक्सीजन एक्सपोजर के कारण एनारोबिक बैक्टीरिया की कुछ मृत्यु हो सकती है जिससे विषम बैक्टीरिया की गिनती हो सकती है। इसलिए, नमूना संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके बैक्टीरिया और फेज चढ़ाना किया जाना चाहिए। एनारोबिक बैक्टीरिया ऑक्सीजन एक्सपोजर को बर्दाश्त नहीं करेंगे। नमूने को संरक्षित करने के लिए, नमूनों को सीलबंद ट्यूबों में इकट्ठा करें और संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके ट्यूबों को एनारोबिक कक्ष में स्थानांतरित करें। यदि फेकल नमूनों में कोई वृद्धि नहीं पाई जाती है, तो बैक्टीरिया की मात्रा का ठहराव के लिए 16S rRNA qPCR जैसे विकल्पों पर विचार करें।
    2. प्रत्येक ट्यूब के अंतिम वजन रिकॉर्ड करें और प्रारंभिक ट्यूब वजन घटाकर नमूना वजन की गणना करें। इसका उपयोग T4 फेज और ई कोलाई एकाग्रता को नमूना वजन (क्रमशः पीएफयू/जी या सीएफयू/जी) को सामान्य करने के लिए किया जाएगा।
    3. प्रत्येक ट्यूब और भंवर अच्छी तरह से अधिकतम गति (>1 मिनट) पर भंवर के 1 एमएल जोड़ें fecal छर्रों homogenize करने के लिए. यदि नमूना 15 मिलीग्राम से कम है, तो एसएम बफर की एक छोटी मात्रा जोड़ी जा सकती है। नमूने के सीएफयू/जी या पीएफयू/जी की गणना के लिए प्रत्येक नमूने में जोड़े गए एसएम बफर की मात्रा रिकॉर्ड करें।
    4. 10 के कारकों में, 180 माइक्रोन एसएम बफर में प्रत्येक नमूने के 20 माइक्रोन के 8 (या अपेक्षित फेज एकाग्रता के आधार पर अधिक) धारावाहिक कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला तैयार करें। भंवर प्रत्येक समरूप नमूना संक्षेप में मिश्रण करने के लिए पहले ट्यूब / प्रत्येक जोड़ के बीच मिश्रण करने के लिए पिपेट और प्रत्येक कमजोर पड़ने के बीच युक्तियों को बदलने के लिए फुलाए हुए फेज या बैक्टीरिया को रोकने के लिए नमूना कैरीओवर के माध्यम से मायने रखता है।
      नोट: यदि नमूना में मौजूद फाइबर और मलबे पाइपिंग में बाधा डालते हैं, तो स्टॉक नमूने को और पतला करने के लिए फेकल घोल में अतिरिक्त बफर जोड़ें।
    5. प्रत्येक नमूने में टी 4 फेज और ई कोलाई एकाग्रता निर्धारित करने के लिए ई कोलाई (फेज पट्टिका परख के लिए) या एलबी अगर प्लेटों (बैक्टीरियल कॉलोनी परख के लिए 1.5% अगर) युक्त एलबी नरम अगर प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 5 माइक्रोन स्पॉट। सटीकता के लिए, प्रत्येक नमूने को तीन प्रतियों में स्पॉट करें।
      नोट: यदि 96-अच्छी तरह से प्लेट में धारावाहिक कमजोर पड़ने की तैयारी कर रहे हैं, तो प्लेटों पर क्रमिक रूप से पतला नमूना के प्रत्येक स्तंभ को पिपेट करने के लिए 8-चैनल पी 20 मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग किया जा सकता है। प्रत्येक कमजोर पड़ने के बीच युक्तियाँ बदलें, भले ही सबसे अधिक पतला से सबसे अधिक केंद्रित करने के लिए चलती है, के रूप में फेज विंदुक टिप की दीवारों का पालन करें और प्रत्येक नए अच्छी तरह से31 करने के लिए जोड़ा फेज की मात्रा में परिवर्तन कर सकते हैं.
    6. प्लेट पलटना और इनक्यूबेटर में रखने से पहले सूखी करने के लिए प्रत्येक स्थान की अनुमति दें. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं.
    7. प्रत्येक नमूने के लिए, कमजोर पड़ने का चयन करें जिस पर प्रति स्थान 3-30 गणनीय सजीले टुकड़े हैं। स्पॉट में सजीले टुकड़े की संख्या और इस्तेमाल किए गए कमजोर पड़ने की गणना और रिकॉर्ड करें।
    8. pfu/μL देने के लिए प्रत्येक स्थान पर चढ़ाया मात्रा से सजीले टुकड़े की संख्या को विभाजित करके नमूने के pfu/g की गणना करें। इसे कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करें और pfu/नमूना देने के लिए प्रत्येक नमूने में जोड़े गए SM बफर की मात्रा से। अंत में, pfu/g30 देने के लिए नमूना वजन से विभाजित करें।
      Equation 1
      Equation 2
  2. प्रयोगात्मक समापन बिंदुओं पर ऊतक का नमूना
    1. प्रत्येक चयनित समय बिंदु पर, अनुमोदित संस्थागत पशु नैतिकता प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों को इच्छामृत्यु और सेकल सामग्री, छोटे और बड़े आंतों की सामग्री, और बाँझ में ब्याज के किसी भी ऊतकों, पूर्व वजन 2 एमएल दौर नीचे microcentrifuge ट्यूबों इकट्ठा.
    2. नमूना वजन की गणना करने के लिए प्रत्येक ट्यूब के अंतिम वजन रिकॉर्ड करें। उसी दिन चढ़ाना तक बर्फ पर ऊतकों और सेकल सामग्री स्टोर करें।
    3. प्रत्येक ट्यूब के लिए बाँझ एसएम बफर जोड़ें और मात्रा जोड़ा रिकॉर्ड.
    4. सेकल और आंतों की सामग्री के लिए, भंवर के नमूने अच्छी तरह से (>1 मिनट) चरण 3.1.3 के अनुसार।
    5. ऊतक के नमूनों के लिए, प्रत्येक ट्यूब में एक बाँझ धातु मनका जोड़ें। 5 मिनट के लिए 20 हर्ट्ज पर एक ऊतक लेसर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके ऊतकों को समरूप करें या जब तक ऊतकों को अलग नहीं किया जाता है और निलंबन समरूप होता है।
      नोट: यदि नमूने अच्छी तरह से समरूप नहीं होते हैं, तो एसएम बफर की मात्रा बढ़ाने, समरूपीकरण समय बढ़ाने, या समरूपता आवृत्ति को 30 हर्ट्ज तक बढ़ाने पर विचार करें। एक ऊतक homogenizer भी बैक्टीरिया और फेज वसूली39,40 के लिए अनुमति देते हुए ऊतकों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बैक्टीरिया की अखंडता को बनाए रखते हुए होमोजेनाइज़र ऊतक लाइसर की तुलना में उच्च आवृत्तियों पर संचालित होते हैं।
    6. 10 के कारकों में प्रत्येक नमूने के धारावाहिक कमजोर पड़ने को तैयार करें और प्रत्येक नमूने में ई कोलाई और टी 4 फेज सांद्रता निर्धारित करने के लिए स्पॉट चढ़ाना करें, जैसा कि चरण 3.1.4-3.1.841 में वर्णित है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

मूत्र आंत में टी 4 फेज / ई कोलाई डाईड के बीच बातचीत की जांच करने के लिए, टी 4 फेज और वाहन lysates तैयार, साफ और शुद्ध (चित्रा 1 ए) थे। T4 फेज lysates पट्टिका परख द्वारा titered थे और एसएम बफर में 2 x 107 pfu/mL (2 x 106 pfu/माउस) को पतला किया. वाहन lysates भी कोई व्यवहार्य फेज उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए titered थे और T4 फेज lysate के रूप में एसएम बफर की एक ही मात्रा में पतला. क्रोमोजेनिक एंडोटॉक्सिन क्वांटिफिकेशन किट का उपयोग करके पतला लाइसेट्स में एंडोटॉक्सिन के स्तर को निर्धारित किया गया था। टी 4 फेज, गर्मी-निष्क्रिय फेज, और वाहन लाइसेट्स में पीने के पानी (<20 ईयू / एमएल)25(चित्रा 1बी)के लिए स्वीकार्य स्तर से नीचे एंडोटॉक्सिन का स्तर था। चूंकि वाहन लाइसेट में टी 4 फेज लाइसेट के समान एंडोटॉक्सिन की मात्रा थी, इसलिए इसे एक उपयुक्त नियंत्रण माना जाता था। गर्मी-निष्क्रिय फेज लाइसेट (गर्मी उपचार से पहले 2 x 107 पीएफयू / एमएल) में वाहन और टी 4 फेज लाइसेट दोनों की तुलना में कम एंडोटॉक्सिन था। किट निर्देशों के अनुसार, नमूने है कि 1-octanol-इलाज किया गया था परख निषेध के लिए परीक्षण किया गया वाहन lysate के लिए एक एंडोटॉक्सिन मानक के अलावा (नुकीला वाहन), 0.5 यूरोपीय संघ / एमएल की एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए. नुकीले वाहन एंडोटॉक्सिन स्तर माइनस वाहन एंडोटॉक्सिन स्तर को निर्माता की सिफारिशों (चित्रा 1बी) के अनुसार 0.5 ईयू / एमएल ±25% मापा गया। इससे पता चला कि 1-ऑक्टानॉल को सफलतापूर्वक हटा दिया गया था और यह कि लाइसेट्स के कारण कोई परख निषेध नहीं था जो परख के परिणामों में हस्तक्षेप कर सकता था।

ई. कोलाई K-12 (BW25113) मोनोकोलोनाइज्ड C57BL/6 चूहों को ग्नोटोबायोटिक स्थितियों(चित्रा 2ए)के तहत एक बाँझ लचीली फिल्म विनाइल आइसोलेटर के भीतर पैदा किया गया था। F0 पीढ़ी के चूहों को उनके पर्यावरण और सह-आवास के अतिरिक्त के माध्यम से ई कोलाई के साथ उपनिवेशित किया गया था। केवल संतति (एफ 1 और एफ 2 पीढ़ी) जो ऊर्ध्वाधर संचरण और सह-आवास के माध्यम से जन्म से ई कोलाई के साथ उपनिवेशित थे, प्रयोगों के लिए उपयोग किए गए थे। यह रणनीति प्रतिरक्षा प्रणाली, बलगम उत्पादन, और जीआई पथ के विकास में परिवर्तन के लिए नियंत्रित होती है जो बैक्टीरियल टीकाकरण 22,37के जवाब में होती है, इसलिए केवल फेज परिचय के कारण होने वाले परिवर्तनों के माप की अनुमति देती है। एक बार परिपक्व, प्रयोगात्मक चूहों बाँझ isocages, जहां वे प्रत्येक टी 4 फेज के 2 एक्स10 6 pfu या उम्र के 6-8 सप्ताह में मौखिक नलिका द्वारा वाहन lysate के बराबर मात्रा प्राप्त करने के लिए स्थानांतरित कर रहे थे. T4 फेज और ई. कोलाई बहुतायत या तो 0.5% (नरम) अगर या 1.5% अगर पर मल छर्रों और स्पॉट चढ़ाना assays के संग्रह द्वारा चार सप्ताह से अधिक की निगरानी की गई थी, क्रमशः. इस प्रयोग के दौरान, टी 4 फेज और ई कोलाई या तो जनसंख्या समाप्त होने के बिना सह-अस्तित्व में सक्षम थे (चित्रा 2 बी, सी)। माउस की कम खुराक पर टी 4 फेज के मौखिक प्रशासन 2 एक्स 102 और 2 एक्स 104 पीएफयू / माउस 2 एक्स 10 6 पीएफयू (चित्रा 2 डी) की तुलना में आंत उपनिवेश करने के लिए टी 4 फेज की क्षमता को कम नहीं किया। इसी तरह, ई कोलाई के स्तर पर टी 4 टीकाकरण की खुराक पर निर्भर प्रभाव (चित्रा 2ई) नहीं देखा गया था।

महत्वपूर्ण बात, नमूनों के बीच चढ़ाना में स्थिरता पट्टिका गिनती के लिए महत्वपूर्ण पाया गया था. उदाहरण के लिए, नरम अगर में बैक्टीरिया जोड़ते समय, यह निर्धारित किया गया था कि बैक्टीरिया के घनत्व ने परख के परिणाम को बहुत प्रभावित किया है। कोलाई के अलावा जो 1 घंटे, 1.5 घंटे, या 2 घंटे के लिए उपसंस्कृति किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप 2.8 घंटे या उससे अधिक के लिए ई कोलाई उपसंस्कृति के अतिरिक्त की तुलना में कम पट्टिका की गिनती हुई। इसके अलावा, पट्टिका मात्रा का ठहराव ~ 1 x 109 पीएफयू / एमएल पर स्थिर हो गया जब ई कोलाई 2.8 घंटे से 16 घंटे (रातोंरात) के लिए उपसंस्कृति थी, जो 1 घंटे उप-संस्कृति (~ 2 x 108 पीएफयू / एमएल) (चित्रा 3 ए) से गणना किए गए मूल्य की तुलना में लगभग 5 गुना वृद्धि थी। उप-संवर्धन के बजाय, लक्ष्य बैक्टीरिया को रातोंरात संस्कृतियों से नरम अगर में टीका लगाया जा सकता है। यहाँ, 16 घंटे (रात भर) ई कोलाई संस्कृति की मात्रा है कि नरम अगर प्रभावित पट्टिका मायने रखता है (चित्रा 3 बी) में टीका लगाया गया था. इन परिणामों से संकेत मिलता है कि अगर के भीतर ई कोलाई का घनत्व पट्टिका परख मायने रखता है प्रभावित कर सकते हैं. दोनों दृष्टिकोणों में, फेज मात्रा का ठहराव परिणाम एक ही मूल्य (109 पीएफयू / एमएल) पर पठार किया गया है, यह सुझाव देते हुए कि लक्ष्य बैक्टीरिया पट्टिका गिनती सटीकता सुनिश्चित करने के लिए नरम अगर में पर्याप्त उच्च घनत्व का होना चाहिए।

एक साथ लिया गया, ये परिणाम प्रयोगात्मक जोड़तोड़ करने से पहले इन विट्रो और विवो पायलट प्रयोगों के माध्यम से फेज-बैक्टीरिया कैनेटीक्स की समझ विकसित करने के महत्व को उजागर करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: फेज lysates की तैयारी। (ए) एक उच्च टिटर फेज स्टॉक से फेज लाइसेट शुरू करने के लिए वर्कफ़्लो। Lysates प्रचारित, साफ, केंद्रित और endotoxins हटा दिया गया. दूषित 1-ऑक्टानॉल को गति वैक्यूम द्वारा हटा दिया गया था। (बी) एंडोटॉक्सिन को क्रोमोजेनिक एंडोटॉक्सिन क्वांटिफिकेशन किट का उपयोग करके फेज और वाहन लाइसेट्स में मात्रा निर्धारित की गई थी। धराशायी नीली रेखाएं उत्पाद निषेध नियंत्रण (0.5 ईयू/एमएल ± 25%) में उत्पाद निषेध को अस्वीकार करने के लिए ऊपरी और निचली सीमाओं को इंगित करती हैं। प्रत्येक बिंदु दो तकनीकी प्रतिकृतियों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। बार ऊंचाई प्रतिकृति भर में मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मोनोकोलोनाइज्ड चूहों की पीढ़ी और फेकल छर्रों में फेज और बैक्टीरिया के स्तर की निगरानी। (ए) एक एकल बैक्टीरिया प्रजातियों और एफ 1 और एफ 2 मोनोकोलोनाइज्ड चूहों की पीढ़ी के साथ रोगाणु मुक्त चूहों के उपनिवेशण के लिए वर्कफ़्लो। (बी-ई) T4 फेज और E. कोलाई के स्तर C57BL/6 चूहों के फेकल छर्रों में पाए गए जो E. कोलाई के साथ एकउपनिवेशित पैदा हुए थे और 6-8 सप्ताह की उम्र में T4 फेज के साथ टीका लगाया गया था। दिन 0 (पूर्व उपनिवेश) और संकेत दिनों के बाद उपनिवेशीकरण में, टी 4 फेज के स्तर एकल अगर परत विधि का उपयोग कर स्पॉट चढ़ाना और पट्टिका assays द्वारा मापा गया. ई. कोलाई का स्तर 1.5% पौंड अगर पर स्पॉट चढ़ाना द्वारा मापा गया. (बी, सी) (बी) टी 4 फेज और (सी) के कैनेटीक्स टी 4 फेज या वाहन लाइसेट (मात्रा और एंडोटॉक्सिन के स्तर के लिए सामान्यीकृत) के 2 x 106 पीएफयू के साथ टीकाकरण के बाद बरामद फेकल छर्रों में कोलाई का स्तर। (डी, ई) (डी) टी 4 फेज और (ई) ई कोलाई स्तर 2 x 102 पीएफयू, 2 x 104 पीएफयू या टी 4 फेज के 2 x 106 पीएफयू के साथ टीकाकरण के बाद बरामद फेकल छर्रों में। त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की माध्य और मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पट्टिका परख में समस्या निवारण सटीकता। (ए) टी 4 फेज लाइसेट टिटर नरम अगर तैयारी (0.5% अगर, एलबी) के लिए ई कोलाई रातोंरात संस्कृतियों या उपसंस्कृतियों का उपयोग कर रहा है। उपसंस्कृतियों को रातोंरात ई कोलाई संस्कृति के 1:50 कमजोर पड़ने का उपयोग करके ताजा एलबी में बनाया गया था। नरम अगर तैयारी के 5 एमएल को ई कोलाई के 100 माइक्रोन और टी 4 फेज के 20 माइक्रोन के साथ टीका लगाया गया था। CaCl2 और MgSO4 इन परीक्षणों के लिए नरम अगर करने के लिए नहीं जोड़ा गया, लेकिन अगर वांछित जोड़ा जा सकता है. ई. कोलाई उपसंस्कृति समय 2.8 घंटे से नीचे एक कम स्पष्ट फेज अनुमापांक में हुई. (बी)नरम अगर तैयारी में विभिन्न ई कोलाई घनत्व का उपयोग करके टी 4 फेज लाइसेट टिटर। के विभिन्न संस्करणों को जोड़ना ई. कोलाई एक रातोंरात संस्कृति से (उप-सुसंस्कृत नहीं, जैसा कि ए में है) नरम अगर में अलग-अलग स्पष्ट फेज टाइटर्स के परिणामस्वरूप हुआ। त्रुटि पट्टियाँ परिकलित फेज टिटर अनिश्चितता का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

माइक्रोबायोम में फेज का अध्ययन उनके जीवाणु समकक्षों की तुलना में एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रस्तुत करता है। विशेष रूप से, फेज में 16S और 18S राइबोसोमल सबयूनिट्स के समान सभी फेज के लिए आम तौर पर एक संरक्षित फ़ाइलोजेनेटिक मार्कर नहीं होता है जो क्रमशः42 प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक प्रजातियों के अनुक्रमण और पहचान में आसानी की अनुमति देता है। हालांकि, अगली पीढ़ी अनुक्रमण दृष्टिकोण में प्रगति के साथ, पढ़ने की लंबाई, थ्रूपुट और घटती लागत में वृद्धि सहित, बैक्टीरियोफेज जीनोम डेटाबेस42,43,44का तेजी से विस्तार आता है. फेज खोज में बहुत अधिक आधारभूत कार्य अच्छी तरह से चल रहा है, फेज अनुसंधान अब पहले से कहीं अधिक सुलभ है। आंत माइक्रोबायोम के प्रमुख सदस्यों के रूप में, और पृथ्वी पर सबसे आनुवंशिक रूप से विविध जीव, फेज माइक्रोबायोम की जटिलता की जांच करने वाले नए शोध के लिए एक रोमांचक कोण प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित चूहों में ज्ञात फेज प्रजातियों उनके लक्ष्य बैक्टीरिया के साथ उपनिवेशित की जांच पर ध्यान केंद्रित. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ये प्रोटोकॉल विवो में फेज का अध्ययन करने के लिए एक दिशानिर्देश प्रदान करते हैं और क्षेत्र के विकास के साथ इसका विस्तार किया जा सकता है।

जीवाणु संक्रमण के चिकित्सीय उपचार के लिए बैक्टीरियोफेज अनुसंधान 1940 के दशक में एंटीबायोटिक दवाओं के आगमन के साथ काफी हद तक फैशन से बाहर हो गया। तथापि, अधिक नुस्खे और एंटीबायोटिक दवाओं के दुरुपयोग ने एक प्रमुख जन स्वास्थ्य चिंता के रूप में बहु-औषध प्रतिरोधी रोगजनकों के उद्भव को तेज कर दियाहै। फेज एंटीबायोटिक दवाओं के लिए एक आकर्षक संभावित विकल्प पेश करते हैं, मेजबान विशिष्टता 3 की उच्च डिग्री केकारण। महत्वपूर्ण रूप से, जैसा कि फेज स्वाभाविक रूप से मानव आंत माइक्रोबायोम के सदस्यों के रूप में निवास करते हैं, पहले उन भूमिकाओं को समझना आवश्यक है जो इन जटिल वातावरणों में फेज निभाते हैं। जबकि कई अध्ययनों ने इन विट्रो में एक फेज और इसके लक्ष्य बैक्टीरिया के बीच संबंधों की जांच की है, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि ये संबंध जीआई पथ के परिदृश्य के भीतर कैसे पकड़ सकते हैं। माइक्रोबायोटा के जीवाणु घटकों की जांच करने वाले खोजपूर्ण अध्ययनों के रूप में, जीएफ और मोनोकोलोनाइज्ड चूहों जैसे सरलीकृत माउस मॉडल हमें अपनी लक्षित प्रजातियों पर फेज के प्रभावों को अलग करने की अनुमति देते हैं, और यह संबंध प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में कैसे योगदान देता है। यह फेज थेरेपी की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि आंत में पेश किए जाने पर कुछ फेज लाभ प्रदान नहीं कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा फेज Pf4 एंटी-बैक्टीरियल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और केराटिनोसाइट माइग्रेशन दोनों को रोककर, अपने मेजबान के कारण होने वाली बीमारी को बढ़ाता है, जिसके परिणामस्वरूप बिगड़ा हुआ घाव भरना18,45 होता है। यहां वर्णित प्रक्रियाओं का उद्देश्य म्यूरिन माइक्रोबायोटा के सदस्यों के रूप में फेज का अध्ययन करने के लिए तकनीकों को मानकीकृत करना है। मेटाज़ोन होस्ट पर माइक्रोबायोटा के प्रभाव की जांच करने वाले अग्रणी अध्ययनों की गूंज, माइक्रोबायोटा के संदर्भ में फेज में निरंतर शोध मल्टीबायोम46 की व्यापक समझ में रोमांचक और महत्वपूर्ण साबित हो सकता है।

सीमाओं
यहां वर्णित प्रोटोकॉल टी 4 फेज और उसके लक्ष्य बैक्टीरिया, ई कोलाई, के बीच प्रतियोगिता का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है, जब टी 4 फेज ई कोलाई monocolonized चूहों के लिए मौखिक नलिका द्वारा प्रशासित कर रहे हैं. बैक्टीरिया की तरह, अलग फेज प्रजातियों एक दूसरे से अलग व्यवहार करते हैं, अलग-अलग प्रतिकृति समय, फट आकार, और बैक्टीरिया लक्ष्य47 की पर्वतमाला होने. इसलिए, जब इसी तरह के पशु मॉडल में अन्य फेज बैक्टीरियल जोड़े की जांच, एक सभी चरणों में इन प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए ध्यान रखना चाहिए. उदाहरण के लिए, लंबे समय तक प्रतिकृति समय और/या छोटे फट आकार वाले फेज को उच्च टिटर लाइसेट के उत्पादन के लिए अपने जीवाणु लक्ष्य के साथ लंबे समय तक इनक्यूबेशन की आवश्यकता हो सकती है। इसी तरह, प्लेट इनक्यूबेशन बार पट्टिका परख के लिए बढ़ाया जा करने की आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, एक छोटी प्रतिकृति समय और / या उच्च फट आकार के साथ फेज कम प्लेट ऊष्मायन की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि रात भर इनक्यूबेशन पट्टिका अतिवृद्धि में परिणाम हो सकता है. यदि प्रसार की स्थिति ब्याज की एक विशिष्ट फेज के लिए अज्ञात हैं, तो विकास की स्थिति निर्धारित करने के लिए आधार विवो काम48 में शुरुआत से पहले स्थापित किया जाना चाहिए।

टी 4 फेज के हॉक कैप्सिड प्रोटीन के भीतर पाए जाने वाले आईजी जैसे डोमेन आंतों के बलगम11 के पालन की सुविधा प्रदान करते हैं। पसंद के फेज की बलगम-बाध्यकारी क्षमता के आधार पर, फेकल नमूनों में फेज-बैक्टीरिया के स्तर के कैनेटीक्स चित्रा 2बी-ई में दिखाए गए परिणामों से भिन्न हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, यह आंत-ऑन-ए-चिप सिस्टम में दिखाया गया था कि बरकरार हॉक प्रोटीन युक्त फेज ने एचओसी-कमी फेज11 की तुलना में ई कोलाई हत्या क्षमता में वृद्धि की थी। हालांकि यह संदेह है कि टी 4 फेज विवो 11,12,13 में बलगम बाध्यकारी के माध्यम से बनाए रखा जाता है, चूहों के coprophagic व्यवहार के माध्यम से फिर से टीकाकरण के प्रभाव से इंकार नहीं किया जा सकता. इन प्रभावों को तार पिंजरे की बोतलों का उपयोग करके, या अक्सर पिंजरों को बदलकर कम किया जा सकता है। चूंकि आईजी जैसे डोमेन को एसएसडीएनए या आरएनए फेज49 में पहचाना नहीं गया है, इसलिए आंत म्यूकोसा के भीतर निवास बनाए रखने के लिए फेज द्वारा उपयोग की जाने वाली अन्य रणनीतियों को अलग करना दिलचस्प होगा।

अंत में, इन खोजपूर्ण अध्ययनों ने केवल होमियोस्टेसिस में फेज-बैक्टीरिया-होस्ट इंटरैक्शन की जांच की है। मानव रोग के पशु मॉडल में, यह अज्ञात है कि आंतों की बाधा अखंडता में परिवर्तन, जैसे कि आईबीडी में, इन इंटरैक्शन को कैसे प्रभावित कर सकता है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि Caudovirales फेज आईबीडी 7,8 के साथ रोगियों में समृद्धि और विविधता में वृद्धि हुई है. माउस मॉडल में, यह दिखाया गया था कि निरंतर फेज उपचार डेक्सट्रान सोडियम सल्फेट (डीएसएस) प्रेरित प्रयोगात्मक कोलाइटिस8 exacerbated. यह निर्धारित किया जाना बाकी है कि फेज-बैक्टीरिया-होस्ट इंटरैक्शन भड़काऊ वातावरण में कैसे खेलते हैं, और क्या बिगड़ा हुआ बाधा अखंडता फेज-प्रेरित सूजन की सुविधा प्रदान करती है।

समस्या निवारण और वैकल्पिक तरीके

माउस मॉडल
मोनोकोलोनाइज्ड माउस मॉडल मेजबान शरीर विज्ञान16 पर बैक्टीरिया की एक प्रजाति की पूछताछ के लिए अनुमति देते हैं। मोनोकोलोनाइज्ड चूहों से जुड़े अनुसंधान ने यह स्पष्ट करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है कि माइक्रोबायोटा प्रतिरक्षा प्रणाली को कैसे प्रभावित करता है22. एक मॉडल प्रणाली के रूप में, मोनोकोलोनाइज्ड चूहे अपने पारंपरिक माइक्रोबायोटा समकक्षों के शरीर विज्ञान को पुन: व्यवस्थित नहीं करते हैं। अधिक GF चूहों के समान, ई. कोलाई monocolonized चूहों बलगम उत्पादन (GF चूहों50 के समान) कम कर दिया है, और एक अपरिपक्व प्रतिरक्षा प्रणाली23. हालांकि, जीआई पथ और प्रतिरक्षा विकास पर व्यक्तिगत प्रजातियों के सूक्ष्मजीव-विशिष्ट प्रभावों को उजागर करने के लिए मोनोकोलोनाइज्ड चूहे अमूल्य रहे हैं। एक क्लासिक उदाहरण यह खोज है कि खंडित फिलामेंटस बैक्टीरिया (एसएफबी) चूहों24 में सीडी 4 + टी हेल्पर 17 कोशिकाओं के शक्तिशाली प्रेरक हैं। बलगम के संदर्भ में, बलगम-जीन प्रतिलेखन51और बलगम मोटाई50 पर सूक्ष्मजीव-विशिष्ट प्रभाव होते हैं। जबकि सीमित, मोनोकोलोनाइज्ड चूहे एक नियंत्रित मॉडल में स्तनधारी मेजबान पर एक फेज-बैक्टीरिया जोड़ी के प्रभाव की जांच करने के अवसर प्रदान करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, फेज कर सकते हैं, और एक जटिल माइक्रोबायोटा के संदर्भ में जांच की जानी चाहिए. लेखन के समय, कुछ अध्ययनों ने एक पारंपरिक माइक्रोबायोम के भीतर कॉमेंसल जीवाणु प्रजातियों के फेज भविष्यवाणी के प्रभावों को संबोधित किया है। यह इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का भविष्य का अनुप्रयोग है, जिसे इन अध्ययनों को सुविधाजनक बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

उपयुक्त वाहन नियंत्रण का उपयोग
किसी भी प्रयोग में उचित नियंत्रण आवश्यक हैं। यहां, चूहों को मौखिक प्रशासन के लिए एक उपयुक्त वाहन परिभाषित किया गया था जो टी 4 फेज लाइसेट्स की बहु-चरण सफाई और शुद्धि के लिए नियंत्रण करता है। एक महत्वपूर्ण आवश्यकता यह है कि वाहन नियंत्रण में किसी भी एंडोटॉक्सिन-मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को नियंत्रित करने के लिए फेज लाइसेट के रूप में बैक्टीरिया एंडोटॉक्सिन का एक समान स्तर होता है। क्लोरोफॉर्म और 1-ऑक्टानॉल को शुद्धिकरण प्रक्रिया के हिस्से के रूप में लाइसेट में जोड़ा जाता है और बाद में हटा दिया जाता है। इन रसायनों के स्तर का पता लगाने के लिए उत्पन्न होने वाली संभावित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए, एक फेज मुक्त बैक्टीरियल लाइसेट को वाहन नियंत्रण के रूप में उत्पादित किया जा सकता है। टी 4 फेज और वाहन lysates बैक्टीरियल endotoxins, अच्छी तरह से पीने के पानी25 (चित्रा 1 बी) में अनुमति के स्तर से नीचे की एक बहुत कम एकाग्रता निहित. वैकल्पिक नियंत्रणों का उपयोग किया जा सकता है और इच्छित शोध प्रश्न के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है। सबसे बस, एंडोटॉक्सिन के बराबर मात्रा वाले फेज बफर का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि यह बहु-चरण सफाई और शुद्धिकरण प्रक्रियाओं के लिए जिम्मेदार नहीं है। गोगोखिया एट अल 8ने गर्मी-निष्क्रिय फेज के उपयोग को नियंत्रण के रूप में बताया कि क्या डीएनए के बिना फेज प्रोटीन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए पर्याप्त था। हमारे हाथों में, गर्मी-निष्क्रिय फेज में टी 4 फेज लाइसेट(चित्रा 1बी)की तुलना में एंडोटॉक्सिन का स्तर कम था, और इसलिए इस अध्ययन में एंडोटॉक्सिन के स्तर को नियंत्रित करने के लिए उपयोग नहीं किया गया था। हालांकि, हम यह निर्धारित करने के लिए दोनों प्रोटोकॉल के परीक्षण को प्रोत्साहित करते हैं कि कौन सी विधि व्यक्तिगत प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए सबसे उपयुक्त है। यदि वाहन और टी 4 फेज लाइसेट्स मौजूद एंडोटॉक्सिन की मात्रा में काफी भिन्न होते हैं, तो निचले स्तर वाले लाइसेट को शुद्ध एंडोटॉक्सिन के साथ पूरक किया जा सकता है। 1-ऑक्टेनॉल को शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान लाइसेट्स में जोड़ा जाता है लेकिन क्रोमोजेनिक एंडोटॉक्सिन क्वांटिफिकेशन किट परीक्षण को निष्क्रिय कर देता है। यह सुनिश्चित करने के लिए नमूने में संभावित रूप से हस्तक्षेप करने वाले पदार्थों द्वारा उत्पाद निषेध का परीक्षण करना महत्वपूर्ण है कि एंडोटॉक्सिन माप सटीक हैं। यदि उत्पाद निषेध का संदेह है, तो संभव है कि नमूना लंबे समय तक वैक्यूम नहीं किया गया था। यदि समस्याएं बनी रहती हैं, तो डायलिसिस का उपयोग शेष 1-ऑक्टेनॉल25 को हटाने के लिए किया जा सकता है।

प्रशासन मार्ग और खुराक
टी 4 फेज के बलगम बाध्यकारी क्षमता के कारण, माउस मॉडल एक एकल मौखिक नलिका खुराक में टीका लगाया गया. इसका उद्देश्य जीआई पथ के फेज और ई कोलाई सह-निवास की अवधि की निगरानी करना था; हालांकि, विवो मॉडल में फेज का अध्ययन करने के अन्य तरीकों की सूचना दी गई है। उदाहरण के लिए, फेज समृद्ध पीने के पानी चूहों 8,20 के लिए फेज की एक निरंतर आपूर्ति प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. प्रशासन की इस पद्धति का लाभ यह है कि फेज लगातार फिर से भर जाते हैं, यहां तक कि एक जीवाणु मेजबान की अनुपस्थिति में भी, जैसा कि गोगोखिया एट अल द्वारा प्रदर्शित किया गया है।8. इस प्रयोगात्मक डिजाइन बैक्टीरिया की अनुपस्थिति में फेज के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए अनुमति दी और प्रयोग के पाठ्यक्रम पर निरंतर प्रतिरक्षा उत्तेजना प्रदान की. शारीरिक रूप से, यह विधि फेज संक्रमण या आंतों के वातावरण के फेज उपनिवेशण के प्राकृतिक पाठ्यक्रम का प्रतिनिधित्व नहीं करती है, लेकिन यह महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करती है कि बार-बार फेज एक्सपोजर प्रतिरक्षा प्रणाली को कैसे प्रमुख कर सकता है। फेज थेरेपी विकास के संदर्भ में इसका महत्व है, क्योंकि फेज कॉकटेल को एंटीबायोटिक रेजिमेंस के समान आंतों के जीवाणु संक्रमण के इलाज के लिए उपचार के एक कोर्स के रूप में वितरित किया जा सकता है। टी 4 फेज-ई कोलाई जोड़ी के संदर्भ में, यह निर्धारित किया गया था कि मोनोकोलोनाइज्ड चूहों के लिए मौखिक रूप से लागू टी 4 फेज की खुराक को कम करने से फेकल फेज या बैक्टीरिया के स्तर (चित्रा 2 डी, ई) में बदलाव नहीं हुआ। इसलिए, इस मामले में टी 4 फेज की टीका खुराक स्थिर टी 4 फेज-ई के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण नहीं है। यह ध्यान दिया जाता है कि प्रशासित सबसे कम खुराक 200 पीएफयू / माउस थी, और उच्चतम खुराक 2 x 106 पीएफयू / माउस (एचएसयू एट अल के अनुसार) थी। 2. इसलिए, इस सीमा के बाहर टी 4 फेज-ई कोलाई कैनेटीक्स का समर्थन करने वाला डेटा इस अध्ययन में अनुपलब्ध है।

स्पॉट और पूरी प्लेट फेज टाइटर्स
मल और ऊतकों में टी 4 फेज के स्तर को मापने के लिए, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल पूरे प्लेट पट्टिका परख के बजाय स्पॉट चढ़ाना तकनीकों पर भरोसा करते हैं, जो चूहों (चित्रा 2बी)के बीच फेज के स्तर में परिवर्तनशीलता में योगदान कर सकते हैं। पूरी प्लेट तकनीकों में, सजीले टुकड़े को एक बड़े क्षेत्र में गिना जाता है, जिससे अधिक सटीक मात्रा का ठहराव होता है। हालांकि, प्रत्येक नमूने का एक उचित कमजोर पड़ने आमतौर पर स्पॉट चढ़ाना द्वारा पूर्व निर्धारित किया जाना चाहिए. चूंकि नमूना संग्रह के दिन नमूनों की परख की गई थी, इसलिए स्पॉट प्लेटिंग को अधिक उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण के लिए सबसे उपयुक्त तरीका माना जाता था। इसलिए, इस डेटा के संकल्प को प्रत्येक नमूने में फेज के परिमाण के क्रम द्वारा सबसे सटीक रूप से दर्शाया गया है। सटीक फेज माप के लिए, प्रत्येक फेज के लिए अतिरिक्त विचार हैं। अधिक सटीक माप पूरे प्लेट परख द्वारा, या प्रत्येक नमूने के लिए छोटे धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रेणियों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। यदि इन विधियों के परिणामस्वरूप अभी भी परिवर्तनीय फेज या लक्ष्य बैक्टीरिया की गिनती होती है, तो यह आकलन करना विवेकपूर्ण होगा कि फेज और बैक्टीरिया के बीच अद्वितीय बातचीत मेटागेनोमिक अनुक्रमण या प्रयोगात्मक रूप से सह-विकास और प्रतिरोध का आकलन करने के लिए अन्य तरीकों के माध्यम से व्यक्तिगत चूहों के बीच अंतर के लिए जिम्मेदार हो सकती है या नहीं। बोनिला एट अल 25 के अनुसार, जब पट्टिका परख के लिए नरम अगर तैयारी, यह बैक्टीरियल मेजबान25 जोड़ा की राशि के साथ संगत होना महत्वपूर्ण है. जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, बैक्टीरिया संस्कृति समय (चित्रा 3 ए) और घनत्व (चित्रा 3 बी) में भी अपेक्षाकृत छोटे परिवर्तन पट्टिका परख की सटीकता को प्रभावित कर सकते हैं। ये निष्कर्ष अन्य फेज-बैक्टीरिया जोड़े के लिए भिन्न हो सकते हैं, और नए जीवों के साथ शुरू करते समय इसी तरह के प्रयोगों की सिफारिश की जाती है। इसके अतिरिक्त, नए फेज-बैक्टीरिया जोड़े के लिए, प्रत्येक की विकास विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए खोजपूर्ण प्रयोग किए जाने चाहिए। उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया के अंतराल, घातीय और स्थिर चरणों और विकास दर को निर्धारित करने के लिए विकास घटता किया जा सकता है। एक-चरण विकास प्रयोग का उपयोग फेज52,53 के अव्यक्त अवधि (लसीका का समय) और फट आकार (जीवाणु लसीका पर जारी फेज की संख्या) निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

qPCR द्वारा वैकल्पिक T4 फेज माप
फेज की मात्रा निर्धारित पट्टिका assays के साथ किया जा सकता है, के रूप में ऊपर उल्लिखित, या मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) के माध्यम से. इन दो दृष्टिकोणों में एक महत्वपूर्ण अंतर है: पट्टिका परख अपने जीवाणु मेजबानों को संक्रमित करने और मारने में सक्षम व्यवहार्य फेज की संख्या निर्धारित करते हैं, जबकि क्यूपीसीआर फेज-विशिष्ट आनुवंशिक सामग्री (मौजूद फेज की संख्या के प्रॉक्सी के रूप में) की मात्रा निर्धारित करता है, लेकिन व्यवहार्यता और संक्रामकता के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है फेज का। क्यूपीसीआर एचएसयू एट अल.2(चित्रा 4)द्वारा वर्णित प्राइमरों का उपयोग करके पट्टिका परख में गठित सजीले टुकड़े के साथ फेज जीन प्रतियों की मात्रा का ठहराव की तुलना करने के लिए किया गया था। T4 फेज डीएनए निकाला गया था और T4 फेज / ई कोलाई द्विउपनिवेशित चूहों की cecal सामग्री से प्रवर्धित किया गया था. अधिकांश चूहों में, क्यूपीसीआर और पट्टिका परख ने सेकल सामग्री(चित्रा 4ए,बी)में टी4फेज के समान स्तर का पता लगाया। जबकि वाहन-टीका सेकल सामग्री में कुछ प्रवर्धन का पता चला था, गणना की गई जीन प्रतियां/जी पता लगाने की सीमा (एलओडी)(चित्रा 4ए)से नीचे थीं। इन नमूनों में मात्रात्मक फेज की अनुपस्थिति जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पुष्टि की गई थी। टी 4 फेज जीन उत्पादों (96 बीपी) को आसानी से टी 4 टीका चूहों की सेकल सामग्री से अलग डीएनए में देखा गया था, लेकिन वाहन नियंत्रण(चित्रा 4सी)से अनुपस्थित थे।

इन परीक्षणों में, टी 4 फेज जीन प्रतियां एक ही नमूना(चित्रा 4बी, तीर)से पट्टिका परख में टी 4 का पता लगाने में असमर्थता के बावजूद क्यूपीसीआर (चित्रा 4ए, तीर) द्वारा एक टी 4 फेज-उपनिवेशित माउस की सेकल सामग्री में पाए गए थे। इन परिणामों से पता चलता है कि वायरल कण जो सजीले टुकड़े नहीं बनाते हैं, वे विवो में उत्पन्न हो सकते हैं, या तो दोषपूर्ण वायरल कणों के उत्पादन या फेज और / या बैक्टीरिया के सह-विकास के कारण। हार्ड अगर पर बैक्टीरियल चढ़ाना तकनीक फेज14 के लिए फेकल बैक्टीरिया संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम सुझाव देते हैं कि क्यूपीसीआर मध्यस्थता का पता लगाने विवो फेज वर्कफ़्लोज़ में एक मूल्यवान अतिरिक्त हो सकता है क्योंकि यह आंतों के वातावरण के भीतर फेज विकास के लिए अधिक मजबूत हो सकता है, यह देखते हुए कि यह छोटे, संरक्षित जीन अनुक्रमों को लक्षित करता है। मेटागेनोमिक्स जैसे गैर-पक्षपाती दृष्टिकोण फेज-बैक्टीरियल सह-विकास और सापेक्ष बहुतायत की जांच के लिए मूल्यवान हैं, लेकिन अंततः अधिक महंगा हो सकता है।

Figure 4
चित्रा 4: qPCR द्वारा टी 4 फेज का पता लगाना। (ए, बी) टी 4 फेज बोझ को (ए) पूर्ण क्यूपीसीआर या (बी) पट्टिका परख के माध्यम से मापा गया था, जो ई कोलाई उपनिवेशित सी 57 बीएल/6 चूहों की सेकल सामग्री में टी 4 फेज या वाहन के साथ दिन 29 पोस्ट-टीकाकरण में था। तीर एक व्यक्तिगत माउस से परिणामों को इंगित करता है जिसमें पता लगाने योग्य टी 4 जीनोम प्रतियां थीं लेकिन सेकल सामग्री में प्लेक्वेबल वायरस नहीं था। (सी)पीसीआर उत्पादों के जेल वैद्युतकणसंचलन टी 4 फेज-टीका सेकल नमूनों में 96 बीपी बैंड की उपस्थिति दिखा रहा है, लेकिन वाहन टीका नमूनों में नहीं। एक 100 बीपी डीएनए सीढ़ी का उपयोग किया गया था। LOD = पता लगाने की सीमा। त्रुटि पट्टियाँ माध्य और SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुप्रयोगों
बैक्टीरियोफेज माइक्रोबायोम44 में मौजूद वायरस जैसे कणों के 90% से ऊपर का प्रतिनिधित्व करते हैं; हालांकि, आंत माइक्रोबायोम पर फेज के प्रभाव को खराब समझा जाता है। माइक्रोबायोम के जीवाणु घटक की जांच प्रारंभिक अध्ययन विशेष प्रजातियों को अलग करके, और प्रतिरक्षा परिपक्वता22,24 पर उनके प्रभाव का अध्ययन करके ऐसा किया। फाजोम की इसी तरह की पूछताछ एक कठिन लेकिन आवश्यक कार्य प्रस्तुत करती है, और मल्टीबायोम46 की व्यापक समझ हासिल करने की आवश्यकता है। जबकि फेज थेरेपी विकास का ध्यान सेप्टिक बैक्टीरियल संक्रमण को ठीक करने की दिशा में सक्षम होता है, यह समझना महत्वपूर्ण है कि जीआई पथ में फेज कॉकटेल के अलावा आंतों के पारिस्थितिकी तंत्र को कैसे बदल सकता है। इसके अलावा, चिकित्सीय फेज कॉकटेल की सुरक्षा का मूल्यांकन प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल उत्पन्न करके किया जाना चाहिए। फेज आंतों के जीवाणु संक्रमण के लिए संभावित उपचार के रूप में जांच की गई है जैसे कि सी. डिफिसाइल5 और साल्मोनेला एंटरिका सेरोवर टाइफिम्यूरियम54. हाल के अध्ययनों से यह भी पता चला है कि एफएफटी प्री-टर्म सूअरों9 में नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस के इलाज में समान रूप से या अधिक प्रभावी हैं, यह सुझाव देते हुए कि फेकल माइक्रोबायोटा प्रत्यारोपण (एफएमटी) के वायरल घटक रोग में कमी में सक्रिय भूमिका निभा सकते हैं। माइक्रोबायोम में फेज की भूमिका की जांच करने वाले निरंतर अध्ययनों को आंतों के रोगजनकों के खिलाफ फेज थेरेपी के विकास को आगे बढ़ाने के लिए वारंट किया जाता है, लेकिन बीमारी के उपचार के रूप में एफएमटी को बेहतर ढंग से सूचित करने के लिए भी। विवो में फेज के अध्ययन के लिए तरीकों को मानकीकृत करके, फेज अनुसंधान में पारदर्शिता और प्रजनन क्षमता बढ़ाई जाएगी, साथ ही माउस मॉडल में अपने काम का विस्तार करने वालों के लिए मार्गदर्शन के साथ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक स्वीकार करते हैं कि जिस भूमि पर उन्होंने यह शोध किया है, वह xwməθkwəy̓əm (Musqueam) राष्ट्र का पारंपरिक, पैतृक और अविभाजित क्षेत्र है। यह जिस भूमि पर स्थित है, वह हमेशा मुस्कम लोगों के लिए सीखने का स्थान रहा है, जो सहस्राब्दियों से अपनी संस्कृति, इतिहास और परंपराओं में इस साइट पर एक पीढ़ी से दूसरी पीढ़ी तक चले गए हैं। हम दूसरों को उन मूल भूमि के बारे में अधिक जानने के लिए प्रोत्साहित करते हैं जिनमें वे रहते हैं और https://native-land.ca पर काम करते हैं। लेखक कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग परिषद (एनएसईआरसी) कनाडाई स्नातक छात्रवृत्ति - मास्टर (एनपी), माइकल स्मिथ हेल्थ रिसर्च बीसी ट्रेनी अवार्ड (आरटी-2023-3174, एमएच को), प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा (एनएसईआरसी) डिस्कवरी अनुदान कार्यक्रम (आरजीपिन-2019-04591 से सीटी, आरजीपीआईएन-2016-04282 से एलसीओ), कैनेडियन इंस्टीट्यूट फॉर एडवांस्ड रिसर्च/ह्यूमन एंड द माइक्रोबायोम (FL-001253 Appt 3362, सीटी), माइकल स्मिथ फाउंडेशन फॉर हेल्थ रिसर्च स्कॉलर अवार्ड (18239, सीटी को), कैनेडियन इंस्टीट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च (पीजेटी -159458 से एलसीओ) और कैनेडियन फाउंडेशन फॉर इनोवेशन (34673 से एलसीओ और 38277 से सीटी)। हम रोग मॉडलिंग और ubcFLOW के लिए UBC केंद्र से तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं, जो UBC GREx जैविक लचीलापन पहल द्वारा समर्थित है, और पांडुलिपि की महत्वपूर्ण चर्चा और मूल्यांकन के लिए Osborne और Tropini प्रयोगशालाओं के सदस्यों के लिए। चित्रा 1 ए और चित्रा 2 ए Biorender.com का उपयोग करके बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octanol (99%) Thermofisher CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units Millipore Sigma  SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) Fisher BioReagents  BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 Millipore Sigma UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST BD Medical 365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)  Techiplast 1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BioRad 1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) Fisher BioReagents BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk Andwin Scientific  16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) Fisher C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm) Crosman Corporation 0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) Thermo Scientific  69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific  K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O Sigma Aldrich E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™  Fisher Bioreagents BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox  Fisher Bioreagents BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific  SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns QuantaBio 95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED Techiplast UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher BioReagents BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker Thermo Scientific  8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox Fisher BioReagents BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml Fisher 14-666-315
Parafilm sealing film Bemis PM-996
Phage stocks Carolina Biological Supply  n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT LabDiet 5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit Thermo Scientific  A39552S
RNase A (17,500 U) Qiagen 19101
RNase-free DNase Set Qiagen  79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) Fisher Chemical BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher Chemical S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) Fisher scentific  n/a
Sterile flexible film isolator  Class Biologically Clean  n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102
T100 Thermal Cycler  BioRad 1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) IDT n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) IDT n/a
TissueLyser II  Qiagen  85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure Thermo Scientific  AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free) Fisher BioReagents BP2484100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
  2. Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
  3. Gordillo Altamirano, F. L., Barr, J. J. Phage Therapy in the postantibiotic era. Clinical Microbiology Reviews. 32 (2), (2019).
  4. Schooley, R. T., et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
  5. Ott, S. J., et al. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology. 152 (4), 799-811.e7 (2017).
  6. Zuo, T., et al. Bacteriophage transfer during faecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection is associated with treatment outcome. Gut. 67 (4), 634-643 (2018).
  7. Norman, J. M., et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell. 160 (3), 447-460 (2015).
  8. Gogokhia, L., et al. Expansion of bacteriophages is linked to aggravated intestinal inflammation and colitis. Cell Host & Microbe. 25 (2), 285-299.e8 (2019).
  9. Brunse, A., et al. Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis. The ISME Journal. 16 (3), 686-694 (2022).
  10. Duerkop, B. A., Clements, C. V., Rollins, D., Rodrigues, J. L. M., Hooper, L. V. A composite bacteriophage alters colonization by an intestinal commensal bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17621-17626 (2012).
  11. Barr, J. J., et al. Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (26), 10771-10776 (2013).
  12. Nguyen, S., et al. Bacteriophage Transcytosis provides a mechanism to cross epithelial cell layers. mBio. 8 (6), (2017).
  13. Bichet, M. C., et al. Bacteriophage uptake by mammalian cell layers represents a potential sink that may impact phage therapy. iScience. 24 (4), 102287 (2021).
  14. Buttimer, C., et al. Impact of a phage cocktail targeting Escherichia coli and Enterococcus faecalis as members of a gut bacterial consortium in vitro and in vivo. Frontiers in Microbiology. 13, 936083 (2022).
  15. Li, Y., et al. Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model. Cell Reports Methods. 2 (11), 100324 (2022).
  16. Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20236-20241 (2013).
  17. Federici, S., et al. Targeted suppression of human IBD-associated gut microbiota commensals by phage consortia for treatment of intestinal inflammation. Cell. 185 (16), 2879-2898.e4 (2022).
  18. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science (New York, N.Y.). 363 (6434), (2019).
  19. Fluckiger, A., et al. Cross-reactivity between tumor MHC class I-restricted antigens and an enterococcal bacteriophage. Science (New York, N.Y.). 369 (6506), 936-942 (2020).
  20. Majewska, J., et al. Induction of Phage-Specific Antibodies by Two Therapeutic Staphylococcal Bacteriophages Administered per os. Frontiers in Immunology. 10, 2607 (2019).
  21. Weiss, M., et al. In vivo replication of T4 and T7 bacteriophages in germ-free mice colonized with Escherichia coli. Virology. 393 (1), 16-23 (2009).
  22. Thomson, C. A., Morgan, S. C., Ohland, C., McCoy, K. D. From germ-free to wild: modulating microbiome complexity to understand mucosal immunology. Mucosal Immunology. 15 (6), 1085-1094 (2022).
  23. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  24. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  25. Bonilla, N., et al. Phage on tap-a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks. PeerJ. 4, e2261 (2016).
  26. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2001).
  27. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 501, 69-76 (2009).
  28. Manikantha, B., Karthika, R., Murugadas, V., Vishnuvinayagam, S., Rao, B. M. Comparison of the single agar and double agar layer methods for enumeration of bacteriophages. Fishery Technology. 59, 60-63 (2022).
  29. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  30. Louten, J. Chapter 7 - Detection and diagnosis of viral infections. Essential Human Virology. , 111-132 (2016).
  31. Richter, Ł, et al. Adsorption of bacteriophages on polypropylene labware affects the reproducibility of phage research. Scientific Reports. 11 (1), 7387 (2021).
  32. Merck KGaA. Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices. , Darmstadt, Germany. https://www.emdmillipore.com/CA/en/product/Amicon-Ultra-15-Centrifugal-Filter-Unit,MM_NF-UFC901024#documentation (2018).
  33. Hecker, W., Witthauer, D., Staerk, A. Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 48 (4), 197-204 (1994).
  34. Jakočiūnė, D., Moodley, A. A Rapid bacteriophage DNA extraction method. Methods and Protocols. 1 (3), 27 (2018).
  35. Zucoloto, A. Z., Yu, I. L., McCoy, K. D., McDonald, B. Generation, maintenance, and monitoring of gnotobiotic mice. STAR Protocols. 2 (2), 100536 (2021).
  36. Ng, K. M., et al. Single-strain behavior predicts responses to environmental pH and osmolality in the gut microbiota. mBio. 14 (4), e0075323 (2023).
  37. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nature Reviews. Microbiology. , (2023).
  38. Bergstrom, K., Xia, L. The barrier and beyond: Roles of intestinal mucus and mucin-type O-glycosylation in resistance and tolerance defense strategies guiding host-microbe symbiosis. Gut Microbes. 14 (1), 2052699 (2022).
  39. Askar, M., Ashraf, W., Scammell, B., Bayston, R. Comparison of different human tissue processing methods for maximization of bacterial recovery. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 149-155 (2019).
  40. Redanz, S., Podbielski, A., Warnke, P. Improved microbiological diagnostic due to utilization of a high-throughput homogenizer for routine tissue processing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 82 (3), 189-193 (2015).
  41. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. 72, e50222 (2013).
  42. Reyes, A., Semenkovich, N. P., Whiteson, K., Rohwer, F., Gordon, J. I. Going viral: next-generation sequencing applied to phage populations in the human gut. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 607-617 (2012).
  43. Camarillo-Guerrero, L. F., Almeida, A., Rangel-Pineros, G., Finn, R. D., Lawley, T. D. Massive expansion of human gut bacteriophage diversity. Cell. 184 (4), 1098-1109.e9 (2021).
  44. Reyes, A., et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers. Nature. 466 (7304), 334-338 (2010).
  45. Bach, M. S., et al. Filamentous bacteriophage delays healing of Pseudomonas-infected wounds. Cell Reports. Medicine. 3 (6), 100656 (2022).
  46. Filyk, H. A., Osborne, L. C. The multibiome: The intestinal ecosystem's influence on immune homeostasis, health, and disease. EBioMedicine. 13, 46-54 (2016).
  47. Rohwer, F., Merry, Y., Maughan, H., Hisakawa, N. Heather Life in Our Phage World: A Centennial Field Guide to the Earth's Most Diverse Inhabitants. Wholon. , San Diego. (2014).
  48. Glonti, T., Pirnay, J. P. In Vitro techniques and measurements of phage characteristics that are important for phage therapy success. Viruses. 14 (7), 1490 (2022).
  49. Fraser, J. S., Yu, Z., Maxwell, K. L., Davidson, A. R. Ig-like domains on bacteriophages: a tale of promiscuity and deceit. Journal of Molecular Biology. 359 (2), 496-507 (2006).
  50. Li, H., et al. The outer mucus layer hosts a distinct intestinal microbial niche. Nature Communications. 6, 8292 (2015).
  51. Bergström, A., et al. Nature of bacterial colonization influences transcription of mucin genes in mice during the first week of life. BMC Research Notes. 5, 402 (2012).
  52. Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers. https://books.google.co.uk/books?id=3wVrAAAAMAAJ (1959).
  53. Kutter, E., Sulakvelidze, A. Bacteriophages: Biology and Applications. , CRC Press. https://books.google.co.uk/books?id=flHOvAEACAAJ (2004).
  54. Bao, H., et al. Dysbiosis and intestinal inflammation caused by Salmonella Typhimurium in mice can be alleviated by preadministration of a lytic phage. Microbiological Research. 260, 127020 (2022).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 203 बैक्टीरियोफेज माउस मॉडल ग्नोटोबायोटिक माइक्रोबायोटा होस्ट-रोगज़नक़ इंटरैक्शन टी 4 फेज ई कोलाई
T4 बैक्टीरियोफेज और <i>ई. murine आंत में कोलाई</i> बातचीत: विवो में मेजबान-बैक्टीरियोफेज गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोटाइप मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pett, N., Hunter, M., Carranza… More

Pett, N., Hunter, M., Carranza García, N. A., Seo, J. H., Collins, S. R., Rohwer, F., Osborne, L. C., Tropini, C. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (203), e65906, doi:10.3791/65906 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter