Ensaio de pontos leves: um método para investigar o comportamento fototático Drosophila

Overview

As larvas de drosophila são sensíveis à luz e respondem a mudanças na luz circundante. Este vídeo descreve um ensaio que testa sua capacidade de evitar a luz, chamado de ensaio de ponto de luz. O protocolo em destaque demonstra como configurar o ensaio com um LED de luz azul e mostra como registrar o comportamento do animal em resposta ao encontro de luz.

Protocol

Este texto protocolar é um trecho de Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. (2019).

1. Configuração do sistema de imagem

1. Aperte uma câmera web de alta resolução com um clipe de ferro, a cerca de 10 cm acima do ponto de luz na área de trabalho(Figura 1).
2. Ajuste a orientação da lente da câmera em direção à área de trabalho. Conecte a câmera a um computador através de uma interface USB.
3. Coloque uma placa de ágar na área de trabalho bem abaixo da câmera.
4. Abra o software "Amcap9.22" no computador com o Windows 7, e o ponto de luz será mostrado automaticamente na janela do AMcap. Mova a câmera ligeiramente para a esquerda ou para a direita para garantir que o ponto de luz esteja perto do centro da janela. Certifique-se de que a câmera não bloqueie o caminho da luz. O ponto de luz deve ser completo e redondo.
   NOTA: O software pode ser encontrado em http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fixar um filtro de banda de 850 nm ± 3 nm com um clipe de 5-7 mm logo abaixo da câmera.
   NOTA: O diâmetro do filtro é de cerca de 2,5 cm, e a lente da câmera tem menos de 1 cm de diâmetro, de modo que o filtro pode cobrir o campo visual da câmera. Com o filtro abaixo da câmera, o ponto de luz não deve ser visto na janela do AMcap.
6. Coloque três LEDs geradores de luz infravermelha (comprimento de onda central = 850 nm) uniformemente ao redor da placa de ágar. Cada LED deve estar a cerca de 5 cm de distância da borda da placa de ágar, e a face da lente do LED deve estar em um ângulo de 70° para baixo em direção à placa de ágar. Conecte os LEDs à potência através do conversor AC-to-DC.
   NOTA: É melhor corrigir as posições e ângulos dos LEDs de luz infravermelha para garantir a consistência do brilho do campo em vários ensaios experimentais e facilitar o processamento posterior de vídeo.
7. Coloque uma placa preta entre o computador e o dispositivo. Defina o brilho da tela do computador para evitar que a luz da tela do computador afete o experimento.
   NOTA: Mantenha o ambiente escuro ao medir o comprimento de onda ou a intensidade da luz.

2. Definir parâmetros de imagem

1. No menu do software AMcap, escolha Opções | | do dispositivo de vídeo Formato de captura, e definir o tamanho do pixel do vídeo capturado para 800 x 600 e taxa de quadros para 60 fps.
2. Remova o filtro por baixo da câmera, coloque uma régua sob a câmera e ajuste o foco da câmera para deixar a linha de escala clara e paralela à largura do campo de visão de vídeo.
3. Clique em Capturar | Monta | Captura de vídeo para selecionar o caminho de salvamento, clique em Iniciar a gravação,gravar a distância real correspondente a 600 pixels e calcular a proporção de cada pixel para a distância real.

3. Gravação de vídeo do comportamento de prevenção de luz

1. Mantenha uma temperatura de 25,5 °C em todos os experimentos. Controle a temperatura ambiente com um ar condicionado, se necessário. Mantenha a umidade constantemente em 60% com um umidificador.
2. Faça um pequeno vídeo da posição do ponto de luz chamado "lightarea1". Em seguida, mova o filtro de 850 nm ± 3 nm para cobrir a lente da câmera.
   NOTA: Ao gravar o comportamento larval, a lente da câmera é coberta pelo filtro de 850 nm ± 3 nm para que o ponto de luz não seja mostrado no vídeo. O ponto de luz pode ser reconstruído em vídeos com larvas mais tarde com Matlab. Não altere a posição da câmera e evite alterar a proporção de cada pixel para a distância real medida na etapa 2.3.
3. Acenda uma luz (ou seja, uma luz de quarto) longe do dispositivo experimental. Abaixe a luz o mais baixo possível, desde que as larvas possam ser claramente vistas com os olhos. Retire as larvas do meio de cultura com uma colher, escolha delicadamente uma larva de terceira instar e lave-a limpa com água destilada. Tenha cuidado para lavar larvas uma de cada vez para evitar interferências da fome. Um único experimento requer pelo menos 20 larvas.
4. Transfira a larva para o centro da placa de ágar colocada sob a câmera durante a etapa 1.3. Remova suavemente o excesso de água da larva com uma escova ou use papel manchador para remover água da larva para evitar o reflexo da luz sob a lente. Desligue a luz do quarto e deixe a larva se aclimatar por 2 minutos no ambiente escuro.
5. Acenda a luz LED para gerar luz infravermelha e escove suavemente a larva para o centro da placa. Quando a larva começar a rastejar em linha reta, gire a placa para fazer a larva ir em direção ao ponto de luz. Certifique-se de que ele rasteja diretamente desde o início, ou então ele pode não obter acesso ao ponto de luz.
6. Clique em Capturar | Monta | Captura de vídeo para selecionar o caminho salvar e, em seguida, clique em Iniciar a gravação para gravar. Deixe a larva rastejar em direção ao ponto de luz, entrar no ponto de luz e, em seguida, deixar o ponto de luz até que esteja quase fora do campo de visão. Clique em Parar de gravar. Se a larva se afastar do ponto de luz antes de chegar perto, clique diretamente em Parar de gravar.
7. Afaste o filtro da câmera. Faça um pequeno vídeo da posição do ponto de luz chamado "lightarea2" e compare-o com "lightarea1" para garantir que a posição do ponto de luz não seja alterada. Se for observada uma mudança de posição óbvia, descarte os dados.

Representative Results

Figura 1: Configuração experimental. (A) Representação esquemática da configuração para o ensaio de fototaxis rápidos larval à base de luz. As linhas azuis representam os caminhos da luz visível usado como estimulação visual, e as linhas vermelhas representam os caminhos da luz infravermelha. As setas indicam a direção da luz. O filtro de passe de banda de 850 nm permite que a luz infravermelha passe, mas bloqueia a luz visível. (B) Uma imagem da configuração para o ensaio de ponto de luz. Deve-se notar que a imagem foi tirada sob condições leves para melhor visualização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%