Summary
Protein-protein-interaktioner er vigtige for at belyse funktionen af målproteiner, og co-immunudfældning (co-IP) kan let bekræfte PPI'er. Vi transfekterede forbigående et plasmid, der koder for et epitopmærket protein i HEK-293-celler og udviklede en immunudfældningsmetode til let at bekræfte bindingen af to målproteiner.
Abstract
Protein-proteininteraktioner (PPI'er) spiller en central rolle i biologiske fænomener, såsom cellulær organisation, intracellulær signaltransduktion og transkriptionel regulering. Derfor er forståelse af PPI et vigtigt udgangspunkt for yderligere undersøgelse af målproteinets funktion. I denne undersøgelse foreslår vi en simpel metode til at bestemme bindingen af to målproteiner ved at indføre pattedyrekspressionsvektorer i HEK-293-celler ved hjælp af polyethylenaminmetoden, lysere cellerne i hjemmelavet proteinlysebuffer og trække målproteinerne ned på en epitopmærkeaffinitetsgel. Derudover kan PPI mellem de forskellige epitopmærkesmeltede proteiner bekræftes ved at bruge affinitetsantistoffer mod hvert mærke i stedet for epitoptag-affinitetsgelen. Denne protokol kan også bruges til at verificere forskellige PPI'er, herunder nukleare ekstrakter, fra andre cellelinjer. Derfor kan den bruges som en grundlæggende metode i en række PPI-eksperimenter. Proteiner nedbrydes ved forlænget tidsforløb og gentagne fryse-optøningscyklusser. Derfor bør cellelyse, immunudfældning og immunoblotting udføres så problemfrit som muligt.
Introduction
Proteiner spiller en vigtig rolle i alle cellulære funktioner, herunder informationsbehandling, metabolisme, transport, beslutningstagning og strukturel organisation. Proteiner medierer deres funktioner ved at interagere fysisk med andre molekyler. Protein-proteininteraktioner (PPI'er) er vigtige for formidling af cellulære funktioner, såsom formidling af signaltransduktion, sensing af miljøet, omdannelse af energi til fysisk bevægelse, regulering af aktiviteten af metaboliske og signalenzymer og opretholdelse af cellulær organisation1. PPI'er kan således bruges til at belyse ukendte funktioner2. Metoder til påvisning af PPI'er kan klassificeres i tre typer: in vitro, in vivo og in silico. Co-immunudfældning (co-IP), affinitetskromatografi, tandemaffinitetsoprensning, proteinarrays, fagvisning, proteinfragmentkomplementaritet, røntgenkrystallografi og kernemagnetisk resonansspektroskopi er blevet anvendt til in vitro PPI-detektion3. Blandt disse metoder anvendes co-IP i vid udstrækning på grund af dets enkelhed.
Fusionsmærket FLAG består af otte aminosyrer (AspTyrLysAspAspAspLys: DYKDDDDK), herunder et enterokinase spaltningssted, og blev specielt designet til immunoaffinitetskromatografi4. DYKDDDDK-mærkede proteiner genkendes og fanges ved hjælp af et anti-DYKDDDDK-antistof. Derfor trækkes de effektivt ned ved hjælp af DYKDDDDK bindende agaroseperler5 for at bekræfte deres binding til specifikke proteiner på en enkel måde. Immunudfældning kan udføres i en række celler, og en bred vifte af PPI'er kan bekræftes ved hjælp af antistoffer mod proteinet af interesse. Immunudfældning og peptideluering med anti-DYKDDDDK agaroseperler er tidligere rapporteret5.
Her giver vi en simpel immunudfældningsmetode, hvor et plasmid, der koder for et DYKDDDDK-mærket protein, forbigående indføres i HEK-293-celler for at bekræfte sammenhængen mellem to proteiner af interesse. Visse DYKDDDDK-antistoffer kan binde til både fusionsproteinernes N-terminus og C-terminal, men ikke andre6. For at undgå forvirring bør derfor det antistof, der genkender mærket smeltet sammen med både N- og C-terminalen, vælges. Ved indsættelse af et epitopmærke kan det være muligt at undgå konformationelle ændringer i proteinet ved at indsætte 3 til 12 basepar mellem epitopmærket og målproteinet. Den indsatte sekvens skal dog være et basepar i multipla af 3 for at undgå frameshift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1 viser en oversigt over protokollen.
1. Fremstilling af opløsninger og buffere
- Proteinlysebuffer: Forbered proteinlysebufferen efter en tidligere offentliggjort rapport7 (tabel 1).
- Proteinlysebuffer + proteasehæmmer (PI): Der tilsættes proteasehæmmer (se materialetabel) til ovennævnte buffer (trin 1.1). Opbevares ved -20 °C.
- Prøvebuffer: Bland 900 μL 4x Laemmli prøvebuffer (se materialetabel) og 100 μL 2-mercaptoethanol. Opbevares ved -20 °C.
- Fosfatbufret saltvand (PBS) med polyoxyethylen (20) sorbitanmonolaurat (PBS-P): Bland 1,998 l PBS og 2 ml polyoxyethylen (20) sorbitanmonolaurat (se materialetabel). Opbevares ved stuetemperatur.
- 1x Tris/glycin/SDS-buffer: Bland 450 ml DDW og 50 ml 10x Tris/glycin/SDS. Forbered ved stuetemperatur på brugsdagen.
2. Plasmidtransfektion
- Kultur HEK-293-celler i en 10 cm kollagenbelagt skål til subsammenløb (80% -95%) ved hjælp af Dulbeccos modificerede ørnemedium indeholdende 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin (10.000 enheder / ml penicillin G og 10.000 μg / ml streptomycin) (se materialetabel).
- Forbered 1-10 μg plasmid7 , der skal transfekteres pr. Skål, og lav en transfektionsblanding. Tilsæt 150 mM NaCl til et slutvolumen på 250 μL pr. Skål. Vortex og spin ned blandingen.
- Der tilsættes 60 μL 1 mg/ml polyethylenimin (PEI, se materialetabel) pr. skål, efterfulgt af 150 mM NaCl til et slutvolumen på 250 μL PEI-opløsning.
- Tilsæt PEI-opløsningen til transfektionsblandingen for at lave en blandet opløsning. Umiddelbart hvirvel (ved tophastighed i 3-5 s, udfør det samme derefter) og drej ned.
- Inkuber ved stuetemperatur i 15-30 min. I løbet af denne tid skal du ændre mediet af HEK-293-celler.
- Drys 500 μL / skål blandet opløsning over skålen med HEK-293-celler og inkuber natten over (13-14 timer).
- Udfør medium udveksling den næste dag.
3. Cellelyse og prøveforberedelse
BEMÆRK: For at undgå proteinnedbrydning skal efterfølgende trin udføres uden konservering eller fryse-optøning af prøven så meget som muligt.
- Ca. 48 timer efter transfektion vaskes cellerne tre gange med iskold PBS, tilsættes 500 μL/skål proteinlysebuffer + PI, og cellerne opsamles med celleskraber og pipette i et rør med lavproteinadsorption på is.
- Vortex hvert 5. minut og inkuber prøverne på is i 10 min.
- Der centrifugeres ved 16.400 x g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten opsamles og overføres til et frisk 1,5 ml glas med lavt proteinindhold. Prøverne kan opbevares ved -80 °C.
- Bestem proteinkoncentrationen af prøverne med et målesæt til proteinkoncentration i henhold til producentens protokol (se materialetabel).
- Der adskilles 200-1000 μg af samme mængde protein i hver prøve, og tilsæt derefter proteinlysebuffer + PI for at justere det samlede volumen til 500-1000 μL.
BEMÆRK: Følgende trin udføres på is.
4. Forberedelse af gylle
BEMÆRK: Forbered en 1: 1 opslæmning af protein G gel og epitope tag affinitetsgel dagen før eller på dagen for immunudfældning.
- Fremstilling af en protein G gel
- Brug en spids med enden afskåret, bland godt og adskil derefter proteinet G-gel (se materialetabel), således at der fremstilles 20 μL perler pr. prøve.
- Der centrifugeres ved 12.000 x g i 20 s ved 4 °C, og perlerne lægges på is i 1 min. for at lade perlerne flade ud. Supernatanten kasseres med en pipette.
- Der tilsættes 1 ml proteinlysebuffer + PI til protein G-gelen fremstillet i trin 4.1.2 og blandes ved at banke og invertere. Der centrifugeres ved 12.000 x g i 20 s ved 4 °C, perlerne lægges på is i 1 min., så perlerne kan udjævnes, og supernatanten kasseres.
- Gentag trin 4.1.3 tre gange.
- Tilsæt en lige så stor mængde proteinlysebuffer til protein G-gelen for at lave en 1: 1 protein G-gelopslæmning. Proteinet G gel opslæmning kan opbevares ved 4 °C i ca. 1 døgn.
- Fremstilling af en epitopmærke affinitetsgel
- Brug en spids med enden afskåret, omrør godt og adskil derefter epitopmærkeaffinitetsgelen (se materialetabel), således at der fremstilles 10-15 μL perler pr. prøve.
- Der centrifugeres ved 5.000 x g i 30 s ved 4 °C, og der ventes 1 min på isen, så perlerne kan flade ud. Supernatanten kasseres med en pipette.
- Der tilsættes 1 ml proteinlysebuffer + PI til epitopmærkeaffinitetsgelen fremstillet i trin 4.2.2 og blandes ved at banke og invertere. Der centrifugeres ved 5 000 x g i 30 s ved 4 °C, perlerne lægges på is i 1 min. for at lade perlerne udjævne, og supernatanten kasseres med en pipette.
- Gentag trin 4.2.3 to gange.
- Der tilsættes 500 μL 0,1 M glycin (pH 3,5) til epitopmærkeaffinitetsgelen fremstillet i trin 4.2.4 og blandes ved at banke og invertere. Dette trin udføres for at fjerne frie epitopmærkeantistoffer. Inden for 20 minutter efter tilsætning af glycin centrifugeres ved 5.000 x g i 30 s ved 4 °C, perlerne lægges på is i 1 minut, så perlerne kan udjævnes, og supernatanten kasseres.
- Der tilsættes 500 μL proteinlysebuffer + PI til epitopmærkeaffinitetsgelen fremstillet i trin 4.2.5 og blandes ved at banke og invertere. Der centrifugeres ved 5 000 x g i 30 s ved 4 °C, perlerne lægges på is i 1 min. for at lade perlerne udjævne, og supernatanten kasseres.
- Gentag trin 4.2.6 tre gange.
- Tilsæt en lige så stor mængde proteinlysebuffer til epitoptag-affinitetsgelen for at forberede en 1:1 epitop-tag-affinitetsgelopslæmning. Epitopmærket affinitetsgelopslæmning kan opbevares ved 4 °C i ca. 1 dag.
5. Forrensning med protein G-gelen og indfangning af proteinkomplekser med epitopmærkeaffinitetsgelen
- 1:1 protein G-opslæmning (fremstillet i trin 4) blandes med en pipette forsynet med en afskåret spids, og prøven tilsættes 40 μL ad gangen.
- Prøven roteres i 1 time på en rotator (se materialetabellen) i ca. 30 s pr. cyklus i et kølekammer (4 °C).
- Der centrifugeres ved 12.000 x g i 20 s ved 4 °C, og perlerne lægges på is i 1 min. for at lade perlerne flade ud.
- Supernatanten opsamles og overføres til et nyt 1,5 ml glas med lavt proteinadsorption.
- Udskil prøven til input fra prøven i trin 5.4, og overfør den til et nyt 1,5 ml rør.
- Der tilsættes 20-30 μL 1:1 epitopmærke gelopslæmning til prøven.
- Rotator roteres i ca. 30 sek. pr. cyklus i et kølekammer (4 °C) i 2 timer.
- Der tilsættes prøvebuffer til inputtet fremstillet i trin 5.5 for at fortynde det til 4x, og opvarm det ved 98 °C i 10 minutter. Indgangen kan opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: På grund af muligheden for proteinnedbrydning på grund af frysning og optøning bør efterfølgende trin udføres uden at bevare proteinet så meget som muligt.
6. Vask og eluering af de udfældede proteiner
- Indstil varmeblokkens temperatur til 98 °C.
- Der centrifugeres ved 5.000 x g i 30 s ved 4 °C, og der ventes 1 min på isen, så perlerne kan flade ud. Supernatanten kasseres med en pipette.
- Tilsæt 1 ml proteinlysebuffer + PI og bland ved at banke og invertere. Rotator roteres i ca. 30 sek. pr. cyklus i et kølekammer (4 °C) i 5 min. Der centrifugeres ved 5.000 x g i 30 s ved 4 °C, mens isen tisses i 1 minut, så perlerne kan udjævne sig, og supernatanten kasseres.
- Gentag trin 6.3 5-10 gange.
- Der tilsættes 10 μL prøvebuffer til prøven fremstillet i trin 6.4. Kog ved 98 °C i 10 min.
- Der centrifugeres ved 5.000 x g ved 4 °C i 30 s.
- Anbring en søjle i et nyt rør med lavt proteinadsorption, og overfør gelen til søjlen ved hjælp af en pipette med en skåret spids. En søjle bruges til at undgå forurening af gelen.
- Der centrifugeres ved 9,730 x g i 1 min ved 4 °C. Indsaml gennemstrømningen. Prøven kan opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: Hvis prøvenedbrydning er et problem, skal følgende immunblotting udføres uden frysning.
7. Immunblotting
BEMÆRK: Immunblottingprocedurer er baseret på tidligere rapporter 7,8.
- Læg hele prøver på en natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel (SDS-PAGE, se materialetabel).
BEMÆRK: Brug om nødvendigt geler med store brønde, så hele prøven kan overføres. Geler med 50 μL brønde blev brugt her. - Sæt gelerne i elektroforesekammeret og tilsæt 1x Tris / glycin / SDS buffer (se tabel over materialer) op til det passende volumen omkring gelerne.
- Elektroforese geler ved 100 V og 400 mA.
- Overfør til polyvinylidenfluorid (PVDF, se materialetabel) membraner.
- Bloker PVDF-membranblotterne med 5% skummetmælk i PBS-P i 1 time ved stuetemperatur.
- Membranen vaskes tre gange med PBS-P på en ryster ved tophastighed i 5 min. Udfør derefter den samme procedure ved vask.
- Der inkuberes natten over på en ryster med det primære antistof (se materialetabel) ved 4 °C.
- Vask membranen tre gange med PBS-P den næste dag.
- Inkuber i 1 time med det sekundære antistof på en ryster ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Hvis molekylvægten af målproteinet er tæt på den tunge IgG-kæde, som har en molekylvægt på ca. 50 kDa, kan et let kædespecifikt sekundært antistof anvendes for at undgå overlapning af målbåndet med den tunge IgG-kæde. Denne undersøgelse anvendte lyskædespecifikke antistoffer7 eller Veriblot som IP-detektionsreagens (se materialetabel). - Identificer bånd af proteiner med peroxidase selvlysende substrater. Membranen kan gemmes i PBS efter vask to gange med PBS-P.
- Strip i 10 minutter med en strippeopløsning (se Materialetabel).
- Vask tre gange og bloker med 5% skummetmælk i PBS-P. Protokollen er derefter den samme som i trin 7.6 og fremefter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Termogeniske adipocytter, også kendt som brune og beige adipocytter, har potentielle anti-fedme og anti-glucose intolerance virkninger. PR (PRD1-BF1-RIZ1 homolog) domæneindeholdende 16 (PRDM16) er en transkriptionscofaktor, der spiller en vigtig rolle i bestemmelsen af termogen adipocytidentitet 9,10.
EHMT1 (eukromatisk histon-lysin N-methyltransferase 1), også kendt som GLP, katalyserer primært mono- og dimethylering af lysin 9 af histon H3 (H3K9) ved anvendelse af cofaktoren S-adenosylmethionin 11. En tidligere rapport viste, at EHMT1 er en essentiel methyltransferase i PRDM16-komplekset, der styrer termogen fedtcelleskæbne gennem histonmethylering12,13. Desuden har vi tidligere rapporteret, at ekspressionsniveauerne for PRDM16 og EHMT1 er signifikant korreleret med niveauerne for termogene gener i humant perirenal brunt fedtvæv (BAT), hvilket tyder på, at både PRDM16 og EHMT1 spiller vigtige roller i human BAT-udvikling8.
For at demonstrere effektiviteten af denne protokol som en metode til bekræftelse af PPI'er transfekterede vi DYKDDDDK-PRDM16 og HA-EHMT1 til HEK-293-celler og immunudfældede DYKDDDDK-PRDM16 ved hjælp af ovenstående protokol. DYKDDDDK-mærket PRDM16 og HA-mærket EHMT1 blev indsat i kloningsstederne for pattedyrekspressionsvektoren pcDNA3.1 (se materialetabel). Immunoblotting bekræftede sammenhængen mellem DYKDDDDK-PRDM16 og HA-EHMT1 i grupper transfekteret med DYKDDDDK-PRDM16 og HA-EHMT1 (figur 2).
Figur 1: Skematisk repræsentation af co-immunudfældning. Skemaet over protokollen er vist her. Højre side viser protokollens arbejdsgang; Venstre side viser en grafisk gengivelse af reaktionerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: PRDM16 associeres med EHMT1. HEK-293-celler blev transfekteret med vektor (negativ kontrol), DYKDDDDK-PRDM16 eller DYKDDDDK-PRDM16 og HA-EHMT1. Co-immunudfældning blev efterfølgende udført ved anvendelse af en DYKDDDDK tag affinitetsgel, efterfulgt af immunoblotting. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Proteinlysebuffer 250 ml (0,22 μm filtrering, opbevares ved 4 °C) | ||
| Ml | Endelig koncentration | |
| 1 M Tris pH 8,0 | 12.5 | 50 mM |
| 5 m NaCl | 7.5 | 150 mM |
| 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre | 0.5 | 1 mM |
| Glycerol | 25 | 10% |
| Polyoxyethylen(10)Octylphenylether | 2.5 | 1% |
| DDW | 202 | |
| Total | 250 | |
Tabel 1: Sammensætning af proteinlysebuffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er næsten som tidligere rapporterede protokoller 5,7,14,15. Det vigtige punkt i denne protokol er, at vi aldrig stopper eksperimentet fra cellelysetrinnet til immunudfældningstrinnet. Proteinnedbrydning hindrer PPI-detektion. Forlænget tidsforløb og gentagne fryse-optøningscyklusser nedbryder proteiner. Elektroforese i SDS-PAGE bør også udføres samme dag som immunudfældning, ikke kun for at minimere proteinnedbrydning, men også for at maksimere PPI-detektion.
I termogene adipocytter blev interaktionen mellem EHMT1 og PRDM16 rapporteret i en tidligere undersøgelse13. EHMT1 - PRDM16-komplekset regulerer brun adipocytcelleskæbne og termogenese13. EHMT1 får PRDM16 til at stabilisere sig ved at afbryde interaktionen mellem PRDM16 - Amyloid proteinbindende protein (APPBP) 216. Denne PRDM16-stabilisering reguleres af cullin(CUL) 2-APPBP2 og EHMT116.
I denne undersøgelse blev HEK-293-celler brugt, fordi HEK-293-celler i vid udstrækning anvendes til produktion af rekombinante proteiner17. Andre cellelinjer, der er lette at transfektere med plasmider, kan anvendes, såsom Cos-7-celler og Hela-celler. PEI blev brugt til transfektion, fordi PEI er mere økonomisk og enklere sammenlignet med konventionel lipofektion.
Forrensning, rotation i en epitopmærkeaffinitetsgel og vask er særligt vigtige trin i denne metode. Preclearing kan fjerne de proteiner, der binder uspecifikt til gelen. Derudover er rotationstiden med epitoptag-affinitetsgelen vigtig, fordi overdreven tid kan resultere i uspecifik proteindetektion, og utilstrækkelig tid kan hindre påvisning af målproteinerne.
Følgende punkter skal bemærkes. HEK-293-celler løsnes let; Derfor bør kollagenbelagte retter anvendes ved tilberedning af prøverne. PEI-opløsning er cytotoksisk; Derfor bør mediet udskiftes efter transfektion uden at forlade cellerne i længere tid. Hvis PPI ikke overholdes, kan mængden af transfekterede plasmider være utilstrækkelig, og/eller mængden af protein, der bringes ind i undersøgelsesperioden, kan være lav. Derudover, hvis antallet af vaske er for stort, kan interaktionerne gå glip af. For at løse disse kan følgende overvejes: øge mængden af plasmid, der indføres i HEK-293-celler, øge mængden af protein, der anvendes til IP, og reducere antallet af vaske. Hvis der er for meget supernatant tilbage i den endelige vask, vil det desuden løbe over fra hullerne i natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelen. Hvis der observeres uspecifikke bånd, kan mængden af plasmid/protein, der anvendes til IP, være for høj, eller antallet eller intensiteten af vaskene kan være utilstrækkelig. Disse kan løses ved at reducere mængden af plasmid/protein, der anvendes til IP, øge antallet af vaske eller øge vaskeevnen ved at øge saltkoncentrationen i vaskebufferen.
Almindeligt anvendte vaske- og rengøringsmidler såsom polyoxyethylenoctylphenylether (10) kan forstyrre funktionelt signifikante PPI18. Mildere rengøringsmidler kan øge genvindingen af funktionelt vigtige komplekser, mens de kan give et uacceptabelt niveau af uspecifikke interaktioner på grund af ufuldstændig opløselighed. Den proteinlysebuffer, der anvendes i den aktuelle undersøgelse, indeholder 1% polyoxyethylen (10) octylphenylether. Denne buffer lyserer cytoplasmatiske proteiner med store mængder proteiner, der overudtrykkes af de transfekterede plasmider. Når immunudfældning udføres på prøver fremstillet ved adskillelse af kerner og cytoplasma, formindskes baggrunden sammenlignet med prøver fremstillet ved helcellelyse, og klare målbånd kan identificeres17. Hvis immunudfældning udføres med proteiner i kernen, kan nukleare proteiner ekstraheres ved hjælp af et kommercielt nukleært ekstraktionssæt eller ved at ødelægge og fjerne cytoplasma med lavt saltbufferholdigt vaskemiddel og efterfølgende ekstrahere nukleare proteiner med høj saltbuffer19. Udviklingstiden ved immunblotting bør justeres ikke kun for at undgå baggrund, men også for at detektere visse bånd.
Denne metode havde flere begrænsninger. For det første brugte vi en PPI, der meget forventes at opdage. For det andet, fordi ekspressionen af hvert gen afhænger af kombinationen af plasmider, kan der opnås utilstrækkeligt protein, og interaktionen kan derfor ikke detekteres.
Sammenfattende kan PPI'er ved hjælp af denne metode bekræftes økonomisk og let sammenlignet med massespektrometri. PPI mellem de forskellige epitopmærkesmeltede proteiner kan også bekræftes ved at bruge affinitetsantistoffer mod hvert mærke i stedet for epitoptag-affinitetsgelen. Lignende immunudfældningsmetoder kan udføres i andre celletyper ved at indføre et plasmid, der udtrykker ethvert protein, der er smeltet sammen med DYKDDDDK-mærket. Desuden gør brug af endogene antistoffer i stedet for en epitopmærkeaffinitetsgel det muligt at bekræfte endogene PPI'er i forskellige celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi erklærer, at ingen af forfatterne har nogen interessekonflikter relateret til denne undersøgelse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) og MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA (pH8.0) | Nippon gene | 311-90075 | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL | Biorad | 4561034 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Biorad | 1610772 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep | GE Healthcare | NA931-1ML | |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey | GE Healthcare | NA934-1ML | |
| Cell Scraper M | Sumitomo Bakelite | MS-93170 | |
| Collagen I Coat Dish 100 mm | IWAKI | 4020-010 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Invitrogen | 10565042 | |
| D-PBS (-) | FUJIFILM Wako | 045-29795 | |
| Glycerol | FUJIFILM Wako | 072-00626 | |
| Glycine | FUJIFILM Wako | 077-00735 | |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 | Cell Signaling | C29F4 | |
| Laemmli Sample buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Biorad | 7326204 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels | Biorad | 1658004JA | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma | F3165 | |
| NaCl | FUJIFILM Wako | 191-01665 | |
| pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-HA-EHMT1 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-vector | This paper | N/A | |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride | PSI | 24765 | |
| Penicillin-streptomycin solution | FUJIFILM Wako | 168-23191 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 23227 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | FUJIFILM Wako | 168-11805 | |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako | 167-11515 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs | Cytiva | 17061801 | |
| Protein LoBind Tubes | eppendorf | 30108442 | |
| ROTATOR RT-5 | TAITEC | RT-5 | |
| skim milk | Morinaga | 0652842 | |
| Stripping Solution | FUJIFILM Wako | 193-16375 | |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack | Biorad | 1704156B03 | |
| Trans-Blot Turbo System | Biorad | N/A | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30910.03 | |
| Veriblot | Abcam | ab131366 | |
| β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 | Cell Signaling | 4970S |
References
- Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
- Yanagida, M.
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Hopp, T. P., et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Gerace, E., Moazed, D. Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads. Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).
- Einhauer, A., Jungbauer, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).
- Egusa, G., et al. Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes. iScience. 26 (7), 107143 (2023).
- Nagano, G., et al. Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression. PLoS One. 10 (3), e0122584 (2015).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
- Shinkai, Y., Tachibana, M. H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP. Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).
- Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1). Biology. 12 (5), 674 (2023).
- Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).
- Bian, W., et al. Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (3), 101569 (2022).
- Cristea, I. M., Chait, B. T.
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Holden, P., Horton, W. Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines. BMC Research Notes. 2, 243 (2009).
- Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins. Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).
- Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175 (2017).
