Summary
Eiwit-eiwitinteracties zijn belangrijk voor het ophelderen van de functie van doeleiwitten, en co-immunoprecipitatie (co-IP) kan PPI's gemakkelijk bevestigen. We transfecteerden tijdelijk een plasmide dat codeert voor een epitoop-gelabeld eiwit in HEK-293-cellen en ontwikkelden een immunoprecipitatiemethode om de binding van twee doeleiwitten gemakkelijk te bevestigen.
Abstract
Eiwit-eiwitinteracties (PPI's) spelen een cruciale rol in biologische fenomenen, zoals cellulaire organisatie, intracellulaire signaaltransductie en transcriptieregulatie. Daarom is het begrijpen van PPI's een belangrijk startpunt voor verder onderzoek naar de functie van het doeleiwit. In deze studie stellen we een eenvoudige methode voor om de binding van twee doeleiwitten te bepalen door zoogdierexpressievectoren in HEK-293-cellen te introduceren met behulp van de polyethylenimine-methode, de cellen te lyseren in zelfgemaakte eiwitlysisbuffer en de doeleiwitten op een epitoop-tag-affiniteitsgel naar beneden te trekken. Bovendien kan de PPI tussen de verschillende gefuseerde eiwitten van de epitooptag worden bevestigd door affiniteitsantilichamen tegen elke tag te gebruiken in plaats van de affiniteitsgel van de epitooptag. Dit protocol kan ook worden gebruikt om verschillende PPI's, waaronder nucleaire extracten, van andere cellijnen te verifiëren. Daarom kan het als basismethode worden gebruikt in een verscheidenheid aan PPI-experimenten. Eiwitten worden afgebroken door een verlengd tijdsverloop en herhaalde vries-dooicycli. Daarom moeten cellyse, immunoprecipitatie en immunoblotting zo naadloos mogelijk worden uitgevoerd.
Introduction
Eiwitten spelen een belangrijke rol in alle cellulaire functies, waaronder informatieverwerking, metabolisme, transport, besluitvorming en structurele organisatie. Eiwitten bemiddelen hun functies door fysiek te interageren met andere moleculen. Eiwit-eiwitinteracties (PPI's) zijn belangrijk voor het bemiddelen van cellulaire functies, zoals het bemiddelen van signaaltransductie, het waarnemen van de omgeving, het omzetten van energie in fysieke beweging, het reguleren van de activiteit van metabole en signalerende enzymen en het handhaven van de cellulaire organisatie1. PPI's kunnen dus worden gebruikt om onbekende functies op te helderen2. Methoden voor het detecteren van PPI's kunnen worden ingedeeld in drie typen: in vitro, in vivo en in silico. Co-immunoprecipitatie (co-IP), affiniteitschromatografie, tandemaffiniteitzuivering, eiwitarrays, faagweergave, eiwitfragmentcomplementatie, röntgenkristallografie en nucleaire magnetische resonantiespectroscopie zijn gebruikt voor in vitro PPI-detectie3. Van deze methoden wordt co-IP veel gebruikt vanwege zijn eenvoud.
De fusietag FLAG bestaat uit acht aminozuren (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), waaronder een enterokinase-splitsingsplaats, en is speciaal ontworpen voor immunoaffiniteitschromatografie4. DYKDDDDK-gelabelde eiwitten worden herkend en vastgelegd met behulp van een anti-DYKDDDDK-antilichaam. Daarom worden ze efficiënt naar beneden getrokken met behulp van DYKDDDDK bindende agarosekorrels5 om hun binding aan specifieke eiwitten op een eenvoudige manier te bevestigen. Immunoprecipitatie kan worden uitgevoerd in een verscheidenheid aan cellen en een breed scala aan PPI's kan worden bevestigd met behulp van antilichamen tegen het eiwit van belang. Immunoprecipitatie en peptide-elutie met anti-DYKDDDDK agarosekorrels zijn eerder gerapporteerd5.
Hier bieden we een eenvoudige immunoprecipitatiemethode waarbij een plasmide dat codeert voor een DYKDDDDK-gelabeld eiwit tijdelijk in HEK-293-cellen wordt geïntroduceerd om de associatie van twee interessante eiwitten te bevestigen. Bepaalde DYKDDDDK-antilichamen kunnen binden aan zowel de N-terminus als de C-terminus van de fusie-eiwitten, maar niet aan andere6. Om verwarring te voorkomen, moet daarom het antilichaam worden gekozen dat de tag herkent die is gefuseerd met zowel N- als C-terminus. Bij het invoegen van een epitooptag kan het mogelijk zijn om conformatieveranderingen in het eiwit te voorkomen door 3 tot 12 basenparen tussen de epitooptag en het doeleiwit in te voegen. De ingevoegde sequentie moet echter een basenpaar in veelvouden van 3 zijn om frameshift te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figuur 1 geeft een overzicht van het protocol.
1. Bereiding van oplossingen en buffers
- Eiwitlysebuffer: Bereid de eiwitlysisbuffer voor volgens een eerder gepubliceerd rapport7 (tabel 1).
- Eiwitlysebuffer + proteaseremmer (PI): Voeg proteaseremmer (zie materiaaltabel) toe aan de hierboven voorbereide buffer (stap 1.1). Bewaren bij -20 °C.
- Monsterbuffer: Meng 900 μL 4x Laemmli monsterbuffer (zie Materiaaltabel) en 100 μL 2-mercaptoethanol. Bewaren bij -20 °C.
- Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met polyoxyethyleen (20) sorbitaanmonolauraat (PBS-P): Meng 1,998 L PBS en 2 ml polyoxyethyleen (20) sorbitaanmonolauraat (zie Materiaaltabel). Bewaren bij kamertemperatuur.
- 1x Tris/Glycine/SDS-buffer: Meng 450 ml DDW en 50 ml 10x Tris/Glycine/SDS. Bereid op kamertemperatuur op de dag van gebruik.
2. Plasmide transfectie
- Kweek HEK-293-cellen in een met collageen beklede schaal van 10 cm tot subconfluentie (80%-95%) met behulp van Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine (10.000 eenheden/ml penicilline G en 10.000 μg/ml streptomycine) (zie materiaaltabel).
- Bereid per gerecht 1-10 μg plasmide7 om te transfecteren en maak een transfectiemix. Voeg 150 mM NaCl toe aan een eindvolume van 250 μL per gerecht. Draai het mengsel om en draai het naar beneden.
- Voeg 60 μL 1 mg/ml polyethylenimine (PEI, zie materiaaltabel) per gerecht toe, gevolgd door 150 mM NaCl tot een eindvolume van 250 μl PEI-oplossing.
- Voeg de PEI-oplossing toe aan de transfectiemix om een gemengde oplossing te maken. Onmiddellijk vortex (op topsnelheid gedurende 3-5 s, voer daarna hetzelfde uit) en draai naar beneden.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15-30 min. Verander gedurende deze tijd het medium van HEK-293-cellen.
- Strooi 500 μL/schaaltje gemengde oplossing over de schaal met HEK-293-cellen en incubeer een nacht (13-14 uur).
- Voer de volgende dag een mediumwissel uit.
3. Cellyse en monstervoorbereiding
OPMERKING: Om eiwitafbraak te voorkomen, moeten de volgende stappen zoveel mogelijk worden uitgevoerd zonder conservering of vries-dooi van het monster.
- Was de cellen ongeveer 48 uur na transfectie driemaal met ijskoude PBS, voeg 500 μL/schaaltje eiwitlysisbuffer + PI toe en verzamel de cellen met een celschraper en een pipet in een buisje met lage eiwitadsorptie op ijs.
- Draai elke 5 minuten en broed de monsters 10 minuten op ijs uit.
- Centrifugeer bij 16.400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel het supernatans en breng het over in een vers buisje van 1,5 ml met een lage eiwitadsorptie. De monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C.
- Bepaal de eiwitconcentratie van de monsters met een meetkit voor de eiwitconcentratie volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Scheid 200-1000 μg van dezelfde hoeveelheid eiwit in elk monster en voeg vervolgens eiwitlysisbuffer + PI toe om het totale volume aan te passen tot 500-1000 μL.
OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd op ijs.
4. Bereiding van drijfmest
OPMERKING: Bereid de dag voor of op de dag van immunoprecipitatie een 1:1 brij van proteïne G-gel en epitoop-affiniteitgel voor.
- Bereiding van een proteïne G-gel
- Meng met behulp van een punt waarvan het uiteinde is afgesneden, goed en scheid vervolgens de proteïne G-gel (zie Materiaaltabel) zodat 20 μL korrels per monster wordt bereid.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 20 s bij 4 °C en leg de korrels 1 minuut op ijs om de korrels te laten egaliseren. Gooi het supernatans weg met een pipet.
- Voeg 1 ml eiwitlysisbuffer + PI toe aan de in stap 4.1.2 bereide proteïne G-gel en meng door te tikken en om te keren. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 20 s bij 4 °C, leg de korrels 1 minuut op ijs zodat de korrels waterpas kunnen worden en gooi de supernatant weg.
- Herhaal stap 4.1.3 driemaal.
- Voeg een gelijk volume eiwitlysisbuffer toe aan de proteïne G-gel om een 1:1 proteïne G-gelslurry te maken. De eiwit G-gelslurry kan ongeveer 1 dag bij 4 °C worden bewaard.
- Bereiding van een epitoop tag affiniteitsgel
- Gebruik een punt waarvan het uiteinde is afgesneden, schud goed en scheid vervolgens de affiniteitgel van de epitooptag (zie Materiaaltabel) zodat 10-15 μL kralen per monster wordt bereid.
- Centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C en wacht 1 minuut op ijs om de korrels af te vlakken. Gooi het supernatans weg met een pipet.
- Voeg 1 ml eiwitlysisbuffer + PI toe aan de in stap 4.2.2 bereide epitoop-affiniteitsgel en meng door te tikken en om te keren. Centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C, leg de korrels 1 minuut op ijs zodat de korrels waterpas kunnen worden en gooi het supernatans weg met een pipet.
- Herhaal stap 4.2.3 twee keer.
- Voeg 500 μL 0,1 M glycine (pH 3,5) toe aan de in stap 4.2.4 bereide epitoop-affiniteitsgel en meng door te tikken en om te keren. Deze stap wordt uitgevoerd om vrije epitoop-tag-antilichamen te verwijderen. Centrifugeer binnen 20 minuten na de toevoeging van glycine bij 5.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C, leg de korrels 1 minuut op ijs zodat de korrels waterpas kunnen worden en gooi de supernatant weg.
- Voeg 500 μL eiwitlysisbuffer + PI toe aan de in stap 4.2.5 bereide epitoop-tag-affiniteitsgel en meng door te tikken en om te keren. Centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C, leg de parels 1 minuut op ijs om de kralen glad te laten komen en gooi de supernatant weg.
- Herhaal stap 4.2.6 driemaal.
- Voeg een gelijk volume eiwitlysisbuffer toe aan de epitoop tag affiniteitsgel om een 1:1 epitope tag affiniteitsgel slurry te bereiden. De epitoop tag affinity gel slurry kan ongeveer 1 dag bij 4 °C worden bewaard.
5. Preclearing met de proteïne G-gel en het vastleggen van eiwitcomplexen met de epitoop tag affiniteitsgel
- Meng 1:1 eiwit G-suspensie (bereid in stap 4) met een pipet met een gesneden punt en voeg 40 μl per keer toe aan het monster.
- Draai het monster gedurende 1 uur op een rotator (zie Materiaaltabel) in ongeveer 30 s per cyclus in een gekoelde kamer (4 °C).
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 20 s bij 4 °C en leg de korrels 1 minuut op ijs om de korrels te laten egaliseren.
- Verzamel het supernatans en breng het over in een nieuwe tube van 1,5 ml met een lage eiwitadsorptie.
- Scheid het monster voor invoer van het monster in stap 5.4 en breng het over in een nieuw buisje van 1.5 ml.
- Voeg 20-30 μL 1:1 epitoop tag gel slurry toe aan het monster.
- Draai op een rotator gedurende ongeveer 30 s per cyclus in een gekoelde kamer (4 °C) gedurende 2 uur.
- Voeg monsterbuffer toe aan de in stap 5.5 voorbereide invoer om deze te verdunnen tot 4x en verwarm gedurende 10 minuten bij 98 °C. De input kan worden opgeslagen bij -80 °C.
OPMERKING: Vanwege de mogelijkheid van eiwitafbraak door invriezen en ontdooien, moeten de volgende stappen worden uitgevoerd zonder het eiwit zoveel mogelijk te conserveren.
6. Wassen en elueren van de neergeslagen eiwitten
- Stel de temperatuur van het warmteblok in op 98 °C.
- Centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C en wacht 1 minuut op ijs om de korrels af te vlakken. Gooi het supernatans weg met een pipet.
- Voeg 1 ml eiwitlysisbuffer + PI toe en meng door te tikken en om te keren. Draai op een rotator gedurende ongeveer 30 s per cyclus in een gekoelde kamer (4 °C) gedurende 5 min. Centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C, wacht 1 minuut op ijs om de korrels waterpas te laten worden en gooi het supernatant weg.
- Herhaal stap 6.3 5-10 keer.
- Voeg 10 μL monsterbuffer toe aan het in stap 6.4 bereide monster. Kook op 98 °C gedurende 10 min.
- Centrifugeer bij 5.000 x g bij 4 °C gedurende 30 s.
- Plaats een kolom in een nieuwe buis met een lage eiwitadsorptie en breng de gel over op de kolom met behulp van een pipet met een afgesneden punt. Een kolom wordt gebruikt om contaminatie van de gel te voorkomen.
- Centrifugeer bij 9.730 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Verzamel de doorstroom. Het monster kan worden bewaard bij -80 °C.
OPMERKING: Als de afbraak van het monster een probleem is, moet de volgende immunoblotting worden uitgevoerd zonder bevriezing.
7. Immunoblotting
OPMERKING: Immunoblotting-procedures zijn gebaseerd op eerdere rapporten 7,8.
- Laad hele monsters op een natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegel (SDS-PAGE, zie materiaaltabel).
OPMERKING: Gebruik indien nodig large-well gels zodat het hele monster kan worden overgebracht. Hier werden gels met putjes van 50 μL gebruikt. - Plaats de gels in de elektroforesekamer en voeg 1x Tris/Glycine/SDS-buffer toe (zie Materiaaltabel) tot het juiste volume rond de gels.
- Elektroforese gels bij 100 V en 400 mA.
- Overbrengen op membranen van polyvinylideenfluoride (PVDF, zie Tabel met materialen).
- Blokkeer de PVDF-membraanvlekken met 5% magere melk in PBS-P gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was het membraan driemaal met PBS-P op een shaker op topsnelheid gedurende 5 min. Voer daarna dezelfde procedure uit bij het wassen.
- Incubeer een nacht op een shaker met het primaire antilichaam (zie materiaaltabel) bij 4 °C.
- Was het membraan de volgende dag driemaal met PBS-P.
- Incubeer gedurende 1 uur met het secundaire antilichaam op een shaker bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Als het molecuulgewicht van het doeleiwit dicht bij de zware IgG-keten ligt, die een molecuulgewicht heeft van ongeveer 50 kDa, kan een lichteketenspecifiek secundair antilichaam worden gebruikt om overlapping van de doelband met de zware IgG-keten te voorkomen. In deze studie werd gebruik gemaakt van lichteketenspecifieke antilichamen7 of Veriblot als IP-detectiereagens (zie materiaaltabel). - Identificeer banden van eiwitten met peroxidase lichtgevende substraten. Het membraan kan worden opgeslagen in PBS na twee keer wassen met PBS-P.
- Strip gedurende 10 minuten met een stripoplossing (zie Materiaaltabel).
- Was driemaal en blokkeer met 5% magere melk in PBS-P. Het protocol daarna is hetzelfde als in stap 7.6 en verder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thermogene adipocyten, ook bekend als bruine en beige adipocyten, hebben potentiële anti-obesitas en anti-glucose-intolerantie effecten. PR (PRD1-BF1-RIZ1 homoloog) domeinbevattend 16 (PRDM16) is een transcriptiecofactor die een belangrijke rol speelt bij het bepalen van de thermogene adipocytenidentiteit 9,10.
EHMT1 (euchromatisch histon-lysine N-methyltransferase 1), ook bekend als GLP, katalyseert voornamelijk de mono- en dimethylering van lysine 9 van histon H3 (H3K9) met behulp van de cofactor S-adenosylmethionine 11. Een eerder rapport gaf aan dat EHMT1 een essentiële methyltransferase is in het PRDM16-complex dat het lot van thermogene vetcellen regelt door middel van histonmethylering12,13. Bovendien hebben we eerder gerapporteerd dat de expressieniveaus van PRDM16 en EHMT1 significant gecorreleerd zijn met die van thermogene genen in menselijk perirenaal bruin vetweefsel (BAT), wat suggereert dat zowel PRDM16 als EHMT1 een belangrijke rol spelen bij de ontwikkeling van menselijke BAT's8.
Om de efficiëntie van dit protocol als methode voor het bevestigen van PPI's aan te tonen, hebben we DYKDDDDK-PRDM16 en HA-EHMT1 getransfecteerd in HEK-293-cellen en DYKDDDDK-PRDM16 geimmunoprecipiteerd met behulp van het bovenstaande protocol. DYKDDDDK-gelabelde PRDM16 en HA-gelabelde EHMT1 werden ingebracht in de kloonplaatsen van de zoogdierexpressievector pcDNA3.1 (zie Tabel met materialen). Immunoblotting bevestigde de associatie tussen DYKDDDDK-PRDM16 en HA-EHMT1 in groepen getransfecteerd met DYKDDDDK-PRDM16 en HA-EHMT1 (Figuur 2).
Figuur 1: Schematische weergave van co-immunoprecipitatie. Het schema van het protocol is hier weergegeven. De rechterkant toont de workflow van het protocol; De linkerkant toont een grafische weergave van de reacties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: PRDM16 associeert met EHMT1. HEK-293-cellen werden getransfecteerd met vector (negatieve controle), DYKDDDDK-PRDM16 of DYKDDDDK-PRDM16 en HA-EHMT1. Co-immunoprecipitatie werd vervolgens uitgevoerd met behulp van een DYKDDDDDK-tagaffiniteitsgel, gevolgd door immunoblotting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Eiwitlysebuffer 250 ml (filtratie 0,22 μm, bewaren bij 4 °C) | ||
| Ml | Eindconcentratie | |
| 1 M Tris pH 8.0 | 12.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 7.5 | 150 mM |
| 0,5 M Ethyleendiaminetetra-azijnzuur | 0.5 | 1 mM |
| Glycerol | 25 | 10% |
| Polyoxyethyleen(10) octylfenylether | 2.5 | 1% |
| DDW | 202 | |
| Totaal | 250 | |
Tabel 1: Samenstelling van de eiwitlysisbuffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol lijkt bijna op de eerder gerapporteerde protocollen 5,7,14,15. Het belangrijke punt van dit protocol is dat we het experiment nooit stoppen van de cellysestap tot de immunoprecipitatiestap. Eiwitafbraak belemmert de detectie van PPI. Langere tijdsverloop en herhaalde vries-dooicycli breken eiwitten af. Elektroforese in SDS-PAGE moet ook op dezelfde dag van immunoprecipitatie worden uitgevoerd, niet alleen om eiwitafbraak te minimaliseren, maar ook om PPI-detectie te maximaliseren.
Bij thermogene adipocyten werd de interactie tussen EHMT1 en PRDM16 gerapporteerd in een eerdere studie13. Het EHMT1 - PRDM16-complex reguleert het lot en de thermogenese van bruine adipocytencellen13. EHMT1 zorgt ervoor dat PRDM16 stabiliseert door de interactie van PRDM16 - Amyloïde eiwitbindend eiwit (APPBP) te onderbreken 216. Deze PRDM16 stabilisatie wordt gereguleerd door cullin(CUL) 2-APPBP2 en EHMT116.
In deze studie werden HEK-293-cellen gebruikt omdat HEK-293-cellen veel worden gebruikt bij de productie van recombinante eiwitten17. Andere cellijnen die gemakkelijk te transfecteren zijn met plasmiden kunnen worden gebruikt, zoals Cos-7-cellen en Hela-cellen. PEI werd gebruikt voor transfectie omdat PEI zuiniger en eenvoudiger is in vergelijking met conventionele lipofectie.
Preclearing, rotatie in een epitoop tag affiniteitsgel en wassen zijn bijzonder belangrijke stappen in deze methode. Preclearing kan de eiwitten verwijderen die niet-specifiek aan de gel binden. Bovendien is de tijd voor rotatie met de epitoop-tag-affiniteitsgel belangrijk omdat overmatige tijd kan leiden tot detectie van niet-specifieke eiwitten en onvoldoende tijd de detectie van de doeleiwitten kan belemmeren.
De volgende punten dienen te worden opgemerkt. HEK-293-cellen kunnen gemakkelijk worden losgemaakt; Daarom moeten bij het bereiden van de monsters met collageen beklede schalen worden gebruikt. PEI-oplossing is cytotoxisch; Daarom moet het medium na transfectie worden vervangen zonder de cellen voor een langere periode te verlaten. Als er geen PPI's worden waargenomen, kan de hoeveelheid getransfecteerde plasmiden onvoldoende zijn en/of kan de hoeveelheid eiwit die in het OT wordt gebracht laag zijn. Bovendien, als het aantal wasbeurten te groot is, kunnen de interacties worden gemist. Om deze aan te pakken, kan het volgende worden overwogen: het verhogen van de hoeveelheid plasmide die in HEK-293-cellen wordt geïntroduceerd, het verhogen van de hoeveelheid eiwit die wordt gebruikt voor IP en het verminderen van het aantal wasbeurten. Bovendien, als er te veel supernatans overblijft in de laatste wasbeurt, zal het overlopen uit de putjes van de natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel. Als niet-specifieke banden worden waargenomen, kan de hoeveelheid plasmide/eiwit die voor IP wordt gebruikt te hoog zijn, of kan het aantal of de intensiteit van de wasbeurten onvoldoende zijn. Deze kunnen worden aangepakt door de hoeveelheid plasmide/eiwit die voor IP wordt gebruikt te verminderen, het aantal wasbeurten te verhogen of de waskracht te verhogen door de zoutconcentratie in de wasbuffer te verhogen.
Veelgebruikte detergentia zoals polyoxyethyleen (10)octylfenylether kunnen functioneel significante PPI's verstoren18. Mildere wasmiddelen kunnen het herstel van functioneel belangrijke complexen verhogen, terwijl ze een onaanvaardbaar niveau van niet-specifieke interacties kunnen opleveren als gevolg van onvolledige oplosbaarheid. De eiwitlysisbuffer die in de huidige studie wordt gebruikt, bevat 1% polyoxyethyleen (10) octylfenylether. Deze buffer lyseert cytoplasmatische eiwitten met grote hoeveelheden eiwitten die tot overexpressie worden gebracht door de getransfecteerde plasmiden. Wanneer immunoprecipitatie wordt uitgevoerd op monsters die zijn bereid door kernen en cytoplasma te scheiden, wordt de achtergrond verminderd in vergelijking met monsters die zijn bereid door lyse van hele cellen, en kunnen duidelijke doelbanden worden geïdentificeerd17. Als immunoprecipitatie wordt uitgevoerd met eiwitten in de kern, kunnen nucleaire eiwitten worden geëxtraheerd met behulp van een commerciële nucleaire extractiekit of door cytoplasma te vernietigen en te verwijderen met een lage zoutbuffer die detergent bevat en vervolgens nucleaire eiwitten met een hoge zoutbuffer19 te extraheren. De ontwikkelingstijd bij immunoblotting moet niet alleen worden aangepast om achtergrond te vermijden, maar ook om bepaalde banden te detecteren.
Deze methode had verschillende beperkingen. Eerst gebruikten we een PPI waarvan sterk wordt verwacht dat deze zal detecteren. Ten tweede, omdat de expressie van elk gen afhangt van de combinatie van plasmiden, kan er onvoldoende eiwit worden verkregen en kan de interactie daarom niet worden gedetecteerd.
Samenvattend kunnen PPI's met deze methode economisch en gemakkelijk worden bevestigd in vergelijking met massaspectrometrie. De PPI tussen de verschillende gefuseerde eiwitten van epitooptags kan ook worden bevestigd door affiniteitsantilichamen tegen elke tag te gebruiken in plaats van de affiniteitsgel van de epitooptag. Vergelijkbare immunoprecipitatiemethoden kunnen worden uitgevoerd in andere celtypen door een plasmide te introduceren dat een eiwit tot expressie brengt dat is gefuseerd met de DYKDDDDK-tag. Bovendien maakt het gebruik van endogene antilichamen in plaats van een epitoop-tag-affiniteitsgel het mogelijk om endogene PPI's in verschillende celtypen te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We verklaren dat geen van de auteurs belangenconflicten heeft met betrekking tot deze studie.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) en MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA (pH8.0) | Nippon gene | 311-90075 | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL | Biorad | 4561034 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Biorad | 1610772 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep | GE Healthcare | NA931-1ML | |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey | GE Healthcare | NA934-1ML | |
| Cell Scraper M | Sumitomo Bakelite | MS-93170 | |
| Collagen I Coat Dish 100 mm | IWAKI | 4020-010 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Invitrogen | 10565042 | |
| D-PBS (-) | FUJIFILM Wako | 045-29795 | |
| Glycerol | FUJIFILM Wako | 072-00626 | |
| Glycine | FUJIFILM Wako | 077-00735 | |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 | Cell Signaling | C29F4 | |
| Laemmli Sample buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Biorad | 7326204 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels | Biorad | 1658004JA | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma | F3165 | |
| NaCl | FUJIFILM Wako | 191-01665 | |
| pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-HA-EHMT1 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-vector | This paper | N/A | |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride | PSI | 24765 | |
| Penicillin-streptomycin solution | FUJIFILM Wako | 168-23191 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 23227 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | FUJIFILM Wako | 168-11805 | |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako | 167-11515 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs | Cytiva | 17061801 | |
| Protein LoBind Tubes | eppendorf | 30108442 | |
| ROTATOR RT-5 | TAITEC | RT-5 | |
| skim milk | Morinaga | 0652842 | |
| Stripping Solution | FUJIFILM Wako | 193-16375 | |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack | Biorad | 1704156B03 | |
| Trans-Blot Turbo System | Biorad | N/A | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30910.03 | |
| Veriblot | Abcam | ab131366 | |
| β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 | Cell Signaling | 4970S |
References
- Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
- Yanagida, M.
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Hopp, T. P., et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Gerace, E., Moazed, D. Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads. Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).
- Einhauer, A., Jungbauer, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).
- Egusa, G., et al. Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes. iScience. 26 (7), 107143 (2023).
- Nagano, G., et al. Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression. PLoS One. 10 (3), e0122584 (2015).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
- Shinkai, Y., Tachibana, M. H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP. Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).
- Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1). Biology. 12 (5), 674 (2023).
- Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).
- Bian, W., et al. Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (3), 101569 (2022).
- Cristea, I. M., Chait, B. T.
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Holden, P., Horton, W. Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines. BMC Research Notes. 2, 243 (2009).
- Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins. Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).
- Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175 (2017).
