एक रिवर्स जेनेटिक Embryogenesis दौरान दृष्टिकोण कार्यात्मक अतिरेक टेस्ट
Summary
जीन समारोह के नुकसान के समारोह प्रयोगों में छिप जा सकता है अगर वहाँ एक और जीन द्वारा मुआवजा है. zebrafish मॉडल एक अपेक्षाकृत उच्च throughput भ्रूण में रहने वाले ऐसे कार्यात्मक अतिरेक प्रकट का मतलब प्रदान करता है.
Abstract
Embryogenesis दौरान जीन समारोह आम तौर पर नुकसान के समारोह के प्रयोगों द्वारा परिभाषित किया गया है, माउस में लक्षित mutagenesis (पीटा) के द्वारा उदाहरण के लिए,. Zebrafish मॉडल में, प्रभावी रिवर्स आनुवंशिक तकनीक जीन विशिष्ट antisense morpholinos के microinjection का उपयोग कर विकसित किया गया है. Morpholinos विशिष्ट आधार बाँधना और ब्लॉक जीन समारोह के माध्यम से एक mRNA transiently लक्ष्य बाधा अनुवाद या embryogenesis (पछाड़ना) के दौरान कई दिनों के लिए splicing के द्वारा. हालांकि, माउस या zebrafish जैसे रीढ़ में, कुछ जीन कार्यों इन एक और जीन है कि नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति की उपस्थिति के कारण दृष्टिकोण से छिप जा सकता है. यह जीन कर रहे हैं कि एक ही विकासशील ऊतकों में सह व्यक्त बहन जीन युक्त परिवारों के लिए विशेष रूप से सच है. Zebrafish में, कार्यात्मक मुआवजा एक अपेक्षाकृत उच्च throughput तरीके से परीक्षण किया जा सकता है है morpholinos सह इंजेक्शन द्वारा, कि दोनों जीनों के एक साथ लक्ष्य पछाड़ना. इसी तरह, का उपयोग morpholinos, किसी भी दो जीन के बीच एक आनुवंशिक बातचीत दोनों जीनों के पछाड़ना के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है एक साथ उप दहलीज स्तरों पर. उदाहरण के लिए, morpholinos ऐसी है कि न तो व्यक्ति पछाड़ना phenotype उत्पन्न titrated किया जा सकता है. यदि इन शर्तों के तहत, दोनों morpholinos सह इंजेक्शन phenotype का कारण बनता है, एक आनुवंशिक बातचीत से पता चला है. यहाँ हम का प्रदर्शन कैसे दो संबंधित GATA प्रतिलेखन कारकों के संदर्भ में कार्यात्मक अतिरेक दिखाने के लिए. GATA कारकों हृदय progenitors के विनिर्देशन के लिए आवश्यक हैं, लेकिन यह दोनों Gata5 और Gata6 के नुकसान से ही पता चला है. हम बताते हैं कैसे बाहर microinjection प्रयोगों ले, morpholinos मान्य है, और cardiogenesis के लिए मुआवजा phenotype मूल्यांकन.
Protocol
Discussion
में प्रयोग यहाँ वर्णित है, हम दो morpholinos, प्रत्येक जिनमें से अकेले phenotypes की एक अलग श्रृंखला उत्पन्न संयुक्त, और एक पूरी तरह से अलग phenotype है जब वे एक साथ थे सह इंजेक्शन मिला. बेशक, हम पहली जगह में इस प्रयोग करने के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रस्तुति तैयार करने में उनकी मदद के लिए इवांस प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. यहां इस्तेमाल किया morpholinos मूल रूप से डॉ. ऑड्रे Holtzinger द्वारा मान्य किया गया. ते स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (HL064282 और HL056182) से अनुदान द्वारा समर्थित है. जानवरों पर प्रयोग वेल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज के दिशा निर्देशों और नियमों पशु देखभाल और उपयोग समिति के लिए संस्थान द्वारा निर्धारित है, के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
| Fish nets | Aquatic Habitats | |||
| System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
| 100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
| Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
| 3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
| Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
| Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
| Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
| Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
| Conventional microwave | General Electric | |||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
| Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
| Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
| N2 tank | Tech Air | |||
| Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
| Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
| Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
| Depression Microslides | VWR | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
