Обратный генетический подход для тестирования функциональной избыточностью во время эмбриогенеза
Summary
Гена функция может быть скрыта в связи с потерей функции эксперименты, если есть возмещение другого гена. Модель данио обеспечивает относительно высокую пропускную способность средств выявить такие функциональной избыточностью в живых эмбрионов.
Abstract
Гена функции во время эмбриогенеза, как правило, определяется с потерей функции экспериментов, например, путем направленного мутагенеза (нокаут) в мышь. В данио модель, эффективная обратная генетические методы были разработаны с использованием микроинъекции генов конкретного morpholinos антисмысловых. Morpholinos целевой мРНК с помощью конкретных спариванием оснований и функциональных блоков генов временно, подавляя перевод или сплайсинг в течение нескольких дней во время эмбриогенеза (нокдаун). Тем не менее, у позвоночных, таких как мышь или данио, некоторые гена функции могут быть скрыта этих подходов в связи с присутствием другого гена, который компенсирует потери. Это особенно верно для генов семейств, содержащих сестра генов, которые совместно выраженных в той же самой развивающейся ткани. В данио, функциональной компенсации может быть проверена в относительно высокой пропускной образом, путем совместного введения morpholinos этой цели нокдаун обоих генов одновременно. Аналогично, используя morpholinos, генетического взаимодействия между любыми двумя генами можно продемонстрировать на нокдаун оба гена вместе на суб-пороговые уровни. Например, morpholinos можно титровать, что ни отдельные нокдаун формирует фенотип. Если в этих условиях, со-инъекции как morpholinos причины фенотипа, генетической взаимодействие показано на рисунке. Здесь показано, как показать функциональной избыточностью в контексте двух взаимосвязанных факторов транскрипции GATA. GATA факторы имеют важное значение для спецификации сердечной предков, но это проявляется только потеря обеих Gata5 и Gata6. Покажем, как провести микроинъекции эксперименты, проверять morpholinos, и оценивать фенотип компенсацию за cardiogenesis.
Protocol
Discussion
В эксперименте, описанном здесь, мы объединили два morpholinos, каждый из которых только генерировать различные диапазон фенотипов, и нашел совершенно иной фенотип, когда они были совместно вводят вместе. Конечно, нам нужно оправдание для этого эксперимента в первую очередь. Мы подозревали, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов Эванс лаборатории за помощь в подготовке этой презентации. Morpholinos используется здесь были первоначально одобрены Доктор Одри Holtzinger. TE при поддержке грантов от Национального института здоровья (HL064282 и HL056182). Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Институтом уходу и использованию животных комитета, из Weill Cornell Medical College.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
| Fish nets | Aquatic Habitats | |||
| System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
| 100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
| Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
| 3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
| Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
| Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
| Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
| Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
| Conventional microwave | General Electric | |||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
| Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
| Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
| N2 tank | Tech Air | |||
| Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
| Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
| Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
| Depression Microslides | VWR | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
