Microdissection de tissus embryonnaires Zebrafish Eye

Summary

Cet article décrit une approche pour le poisson-zèbre microdissect rétines avec et sans l'épithélium pigmentaire rétinien attachés, de un à trois embryons jours post-fécondation.

Abstract

Le poisson zèbre est un modèle animal populaires pour la recherche sur le développement des yeux en raison de sa rapidité<em> Ex utero</em> Le développement et la fécondité bon. En trois jours après la fécondation (DPF), les larves se montrent de la première réponse visuelle. De nombreux gènes ont été identifiés pour contrôler un développement de l'œil bon, mais nous sommes loin d'une compréhension complète de l'architecture génétique sous-jacente. Whole profilage de l'expression des gènes du génome est un outil utile pour élucider génétique du réseau de réglementation pour le développement des yeux. Cependant, la petite taille de l'œil embryonnaire chez le poisson zèbre, il est difficile d'obtenir des tissus de l'œil intact et pur pour l'analyse de l'expression. Par exemple, la longueur antéro-postérieure de l'oeil entre le jour 2 et 3 est seulement environ 200-300 um, tandis que le diamètre de la lentille est um moins 100. En outre, l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) qui sous-tendent la rétine est juste un épithélium simple couche. Alors que les profils d'expression génique peuvent être obtenus à partir de l'embryon entier, ils ne représentent pas exactement l'expression de ces tissus. Par conséquent le tissu pur doit être obtenu pour un profil d'expression génique réussie de développement de l'œil. Pour répondre à cette question, nous avons développé une approche de la rétine intacte et microdissect rétine avec RPE jointe de dpf 1-3, qui couvrent les grandes étapes de la morphogenèse des yeux. Toutes les procédures qui peut être fait avec une pince fine et fournitures de laboratoire générale en vertu de stéréomicroscopes standard. Pour la dissection de la rétine, l'EPR à une seule couche est enlevée et décollée par brossage action et l'adhésion préférentielle des restes EPR à la surface de la plaque de culture pour la dissection. Pour RPE-joint la dissection de la rétine, l'adhésion de l'EPR à la plaque de dissection est retiré avant la dissection de telle sorte que l'EPR peut être complètement conservé avec la rétine. Une action de levage attentive de ce tissu peut séparer efficacement la choroïde et la sclère présomptive. La lentille peut être retirée dans les deux cas par une aiguille de tungstène gravé chimiquement. En bref, notre approche peut obtenir des tissus oculaires intact et a été utilisé avec succès pour étudier les profils expression tissu-spécifique de la rétine de poisson zèbre^{1, 2} Et l'épithélium pigmentaire rétinien³.

Protocol

Partie 1: Préparatifs avant microdissection Solutions E3 moyenne 4 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2 et 0,33 mM MgSO 4). Une solution de Ringer, 5 (116 mM NaCl, 2,9 mM de KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM d'HEPES, pH 7,2), stérilisée par filtration. NaOH 5N. Gravure chimique des aiguilles de tungstène Fixez un petit bécher contenant NaOH 5N sur…

Discussion

Microdissection de tissus oculaires poisson zèbre peut effectivement obtenir des rétines intactes et RPE-attachée rétines. Cette aide substantielle des études d'expression se rapportant à un tissu oculaire spécifique (ie la rétine ou RPE). En fait, nous avons utilisé avec succès ces procédures pour obtenir des profils d'expression ARN de la rétine entière ¹ et ³ EPR. L'utilité de ces profils est fortement soutenue par notre récente identification des voies et des familles…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Cordless pestle motor		VWR	47747-370
DC power supply		Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)		VWR	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox		World Precision Instruments	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox		Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm		BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope		Olympus	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone		Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate		Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL		Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter		World Precision Instruments	TGW1510
Wooden Applicator		Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.