Summary
De vroege embryonale long orgelcultuur is een zeer nuttig systeem om epitheliale-mesenchymale interacties te bestuderen. Zowel de epitheliale en mesenchymale morfogenese verloopt onder specifieke omstandigheden die gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd in dit systeem.
Abstract
Lung oorspronkelijke specificaties als vertakking morfogenese, en de vorming van diverse pulmonale cellijnen vereist een specifieke interactie van de long endoderm met de omringende mesenchym en mesothelium. Lung mesenchym is aangetoond dat de bron van inductieve signalen voor long vertakking morfogenese worden. Epitheliale-mesenchymale-mesothelial interacties zijn ook van cruciaal belang embryonale long morfogenese. De vroege embryonale long orgelcultuur is een zeer nuttig systeem om epitheliale-mesenchymale interacties te bestuderen. Zowel de epitheliale en mesenchymale morfogenese verloopt onder specifieke omstandigheden die gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd in dit systeem (in afwezigheid van de moeder invloed en de doorbloeding). Nog belangrijker is deze techniek kan eenvoudig worden gedaan in een serumless, chemisch gedefinieerde cultuur media. Winst en verlies van functie kan worden bereikt met behulp van tot expressie gebrachte eiwitten, recombinante virale vectoren en / of analyse van transgene muizenstammen, antisense RNA, evenals RNA-interferentie-gen knockdown.
Protocol
Orgelcultuur is een zeer nuttige en veelzijdige techniek om gen-en eiwitexpressie te bestuderen. Deze ex vivo cultuur methoden kunnen worden gebruikt als een voorafgaande of in aanvulling op de in vivo studies.
1. Embryonale Lung Isolatie
- Timed-zwangere muizen worden opgeofferd op postcoitum dag 11,5 of 12,5 (E11.5-12.5) door de CO 2 narcose volgens de NIH en OLAW richtlijnen. Het dier is geplaatst in een kamer en 100% CO 2 wordt geïntroduceerd. Nadat het dier bewusteloos is de CO 2-stroom wordt verhoogd. Klinisch dood van het dier moet worden gewaarborgd.
- Al de volgende stappen moeten worden voltooid onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. De baarmoeder is verwijderd uit de zwangere vrouwtjes. Voor het verwijderen van de baarmoeder van het dier, worden de zwangere vrouwtjes die op hun rug en besproeid met 70% ethanol. Een incisie wordt gemaakt in de buik, en de huid wordt verwijderd door het trekken van de huid naar boven terwijl het dier achterpoten. De peritoneale holte wordt geopend en de baarmoeder is verwijderd uit het dier.
- Het bloed wordt weggespoeld door het plaatsen van de baarmoeder in een 50 ml conische buis gevuld met koud Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), en de buis wordt zachtjes geschud gedurende 2 minuten.
- De baarmoeder wordt dan geplaatst in een petrischaal onder de microscoop stereoscopische ontleden, en de embryo's vrijgelaten uit de baarmoeder door incisie de baarmoederwand met behulp van de lente een schaar. De embryo's worden geoogst met behulp van een geperforeerde lepel, en geplaatst op ijs in een nieuwe petrischaal met HBSS.
- Onder de stereoscopische microscoop ontleden, zijn embryonale longen doorsneden een voor een in een petrischaal met koud HBSS (figuur 1).
- De geïsoleerde embryonale long is geplaatst op ijs in een petrischaal met HBSS met behulp van een steriele pipet overdracht.
2. Embryonale Lung Cultuur
- 500 microliter tot 1 milliliter per putje van D-MEM/F-12 aangevuld met 50 eenheden / ml penicilline-streptomycine is toegevoegd in een Nunclon Polystyreen schotel.
- Een Nuclepore Polycarbonaat Track-Etch Membraan wordt geplaatst op de top van de media. Wanneer de Nuclepore Polycarbonaat Track-Etch Membraan wordt geplaatst op de top van de media, ervoor zorgen dat de glimmende kant is tegen de media, en de ruwe zijde naar boven is gericht.
- Een ontleed embryonale longen is geplaatst op de top van de Nuclepore Polycarbonaat Track-Etch membraan met behulp van een steriele pipet overdracht.
- De embryonale long positie wordt aangepast met de tang. Embryonale long op de filter moet een intact luchtpijp en worden geplaatst met hun luchtpijp met een rechte positie, zodat alle longen naar dezelfde interne druk hebben.
- De Nunclon Polystyreen schotel wordt overgedragen voor de gewenste cultuur van de tijd in een cel incubator (figuur 2).
3. Materialen
1. Embryonale Hele Lung Isolatie
- Timed-zwangere (C57Bl6 wild-type of transgene) muizen worden opgeofferd op postcoitum dag 11,5 tot 13,5 (E11.5-13.5).
- Balanced Salt Hanks 'Solution (HBSS) (1x), vloeistof, zonder calciumchloride, magnesiumchloride of magnesiumsulfaat. (Invitrogen, Carlsbad, CA), aangevuld met 50 eenheden / ml penicilline-streptomycine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Bewaar de HBSS bij kamertemperatuur en bij 4 ° C na opening. Aliquot en opslaan van de penicilline-streptomycine bij -20 ° C.
- Stereoscopische ontleden microscoop (Leica, Wetzlar, Duitsland).
- Dissection tools zoals Dumont tang, schaar Fine iris (recht), Noyes voorjaar schaar en Moria ® lepel (geperforeerd) (Fine Science Tools, Foster City, CA).
2. Embryonale Hele Lung Cultuur
- Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mix F-12 (D-MEM/F-12) (1x), vloeistof, 01:01 Bevat L-glutamine, maar geen HEPES buffer. (Invitrogen, Carlsbad, CA), aangevuld met 50 eenheden / ml penicilline-streptomycine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Houd de DMEM/F-12 fles weg van het licht (bv. onder aluminiumfolie) en bewaar bij 4 ° C. Aliquot en opslaan van de penicilline-streptomycine bij -20 ° C.
- Nuclepore Polycarbonaat Track-Etch Membraan, 8,0-m, 13mm (Whatman Nuclepore Track-Etch membraan (Whatman, Florham Park, NJ).
- Nunclon Polystyreen schotel met deksel, 4 putten (Rochester, NY).
- Wegwerp overdracht pipetten, steriele (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).
Figuur 1. Dissectie van de E12 embryonale longen. (A) E12.5 hele embryo gezien vanaf de rechterkant. (B) Rechter voorpoot is verwijderd uit het embryo. (C) Tang in het bezit van de linkerhand die de embryo stabiel in de schaal. Pijlen geven plan van dissectie (D) Embryonale long ligt posterior naar het hart (verwijderd) En anterior van de wervelkolom. Deze figuur toont de longen na de huid en het hart te verwijderen. (E) Pharynx verwijderen scheiding van de intacte long maakt van het embryo. (F) onzuiverheden faryngeale weefsels en slokdarm zijn weggesneden. Ontleed E12.5 embryonale long met intacte luchtpijp en het strottenhoofd wordt weergegeven. (Cr) Craniale kwab, (Med) mediale kwab, (Ca) Caudal kwab, (Acc) accessoire kwab, (Le) Linker kwab.
Figuur 2. FGF9 induceert uitbreiding van het mesenchym en de verwijding van het epitheel in de longen gekweekt in vitro. (AC) E12.5 longen wordt verbouwd voor 48 uur in afwezigheid van FGF9. Let op de toename van de vertakking. (DF) E12.5 longen geteeld voor 48 uur in aanwezigheid van FGF9. Let op de verwijding van het epitheel en mesenchym zo vroeg als na 24 uur van de cultuur (E). Na 48 uur (F), het effect op het epitheel is nog meer uitgesproken. Schaalbalk: AF 400 um 4.
De volledige tekst protocol voor deze experimentele aanpak is beschikbaar in Springer Protocols .
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Saban Research Institute Pre-doctorale Award (PMDM), en door NIH RO1 HL75773 (DW).
References
- Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
- Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
- Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
- Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
- Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures. Cell Differ. 24, 105-117 (1988).
- Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).
