Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport
Summary
Einzel-Molekül-Mikroskopie approch neue Einblicke in atomare Transport.
Abstract
Der Nutzen des einzelnen Moleküls Fluoreszenzmikroskopie Ansätze ist nachgewiesen worden, von einem großen Anspruch in das Verständnis von biologischen Reaktionen während des letzten Jahrzehnts werden. Die Untersuchung molekularer Wechselwirkungen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung tief in den Zellen blieb Herausforderung aufgrund der inhärent schwachen Signalen, die aus einzelnen Molekülen. Neuere Arbeiten von Yang et al. gezeigt, dass Schmalband-Bereich Epifluoreszenzmikroskopie Visualisierung von nukleozytoplasmatischen Transport ermöglicht auf der Ebene einzelner Moleküle. Durch die einzigen Molekül Ansatz, wichtige Kinetik, wie Kerntransport Zeit und Effizienz, für die Signalverarbeitung und-unabhängige Cargomoleküle gewonnen wurden. Hier haben wir beschrieben, ein Protokoll für den methodischen Ansatz mit einer verbesserten zeitlichen Auflösung von 0,4 ms und 12 nm aufweisen. Die verbesserte Auflösung ermöglichte es uns, vorübergehend den aktiven Transport und passive Diffusion Ereignisse durch die Kernporenkomplexe (NPC) erfassen in semi-intakten Zellen. Wir erwarten, dass diese Methode, um bei der Aufklärung anderer bindender und Menschenhandel Ereignisse innerhalb von Zellen verwendet werden.
Protocol
Discussion
Es muss darauf geachtet, um eine ordnungsgemäße Kolokalisation von NE und einzelne Moleküle während des Experiments zu versichern. Es ist auch wichtig, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis bieten, vor allem, wenn das Signal schwach ist aufgrund der schlechten Kennzeichnung oder Ausbleichen. Localization Präzision wird durch Hintergrundgeräusche (aus out-of-focus-Fluoreszenz, CCD Ausleserauschen, Dunkelstrom und anderen Faktoren) begrenzt.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde von der Forschung Capacity Enhancement Grant (Bowling Green State University) unterstützt.
References
- Ma, J., Yang, W. Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2010).
- Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability. , .
- Yang, W., Musser, M. S. Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy. Methods. 39, 316-328 (2006).
- Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).
