طريقة لعزل الفرنسيسيلة التولارية الأغشية الخارجي

Summary

بروتوكول لفصل الأغشية الداخلية والخارجية من<em> الفرنسيسيلة التولارية</em> عن طريق تحلل ، spheroplasting التناضحي ، والسكروز تنبيذ فائق التدرج الكثافة.

Abstract

الفرنسيسيلة التولارية هو عصورة سلبية الغرام بين الخلايا والعامل المسبب للمرض التلريات الحيوانية المنشأ. بالمقارنة مع غيرها من مسببات الأمراض البكتيرية ، وجرعة منخفضة للغاية المعدية (<10 CFU) ، تطور المرض بسرعة ، وارتفاع معدلات المراضة والوفيات تشير إلى أن سلالات قاتلة من الفرنسيسيلة ترميز لعوامل الفوعة الرواية. وقد تبين أن السطح المعرضة للجزيئات وبروتينات الغشاء الخارجي هي : (خطط إدارة المكاتب) ، لتعزيز البكتيرية الخلية المضيفة ملزمة ، دخول ، والبقاء داخل الخلايا ، والتهرب من الفوعة المناعي. وشدد كذلك على أهمية لدراسة خطط إدارة المكاتب من حقيقة أنها يمكن أن تكون بمثابة لقاحات واقية ضد عدد من الأمراض البكتيرية. في حين يمكن استخلاصها من خطط إدارة المكاتب البكتيريا سالبة الجرام من خلال غشاء معظم تقنيات الاستخراج ، بما في ذلك الخلايا صوتنة تليها الطرد المركزي و / أو استخراج مواد التنظيف ، وغالبا ما تكون ملوثة مع هذه الاستعدادات محيط بالجبلة و / أو حشوية (الداخلية) الملوثات (IM) الغشاء. لسنوات ، ان "المعيار الذهبي" طريقة لفصل الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية من سلبية الغرام والأغشية IM الخارجي (OM) تم رهنا للبكتيريا تحلل spheroplasting والتناضحي ، تليها كثافة السكروز الطرد المركزي التدرج. مرة واحدة على طبقات متدرجة السكروز ، يمكن فصل OMS من الرسائل الفورية على أساس الاختلافات في كثافة مرتفعة ويعتقد أن يستند إلى حد كبير على وجود lipopolysaccharide (LPS) في مرسيليا. هنا ، نحن تصف طريقة صارمة والأمثل لاستخراج وتخصيب ، وعزل F. الأغشية الخارجي التولارية وخطط إدارة المكاتب المرتبطة بها.

Protocol

اليوم 1 : F. التولارية وحة التلقيح لوحة الثقافات الأسهم المجمدة للF. التولارية على آغار مولر هينتون تستكمل مع 2.5 ٪ (المجلد / المجلد) المانحة العجل المصل ، 2 ٪ (المجلد / المجلد) IsoVitaleX ، 0.1 ٪ (وزن / المجلد) الجلوكوز ، و0.025 ٪ (وزن / المجلد) بيروفوسفات الحديد. تنمو F. التولارية عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 لحوالي 24 ساعة. اليوم 2 : F. التولارية تلقيح السائل وسائل الإعلام إعداد وتعقيم 1 لتر من المعدل المتوسط ​​الموجبة مولر هينتون (التي تحتوي على كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات 1،23 ملم و 1.03 كلوريد المغنيسيوم hexahydrate ملم). عندما تبرد إلى 37 درجة مئوية ، وكذلك الملحق مع الجلوكوز المتوسطة 0.1 ٪ (وزن / المجلد) ، 0.025 ٪ (وزن / المجلد) بيروفوسفات الحديد ، و 2 ٪ (المجلد / المجلد) IsoVitaleX. فلتر تعقيم (0.22 μ) في المتوسط ​​500 مل aliquots اثنين. إزالة 12 مل من المتوسط ​​مولر هينتون استكملت ونقل في أنبوب عقيم فالكون 50 مل. باستخدام حلقة عقيمة تلقيح 10 ميكرولتر ، كشط loopful كبيرة من واو نمو التولارية من لوحات أجار (من يوم 1) ونقل البكتيريا الى 12 مل من مولر هينتون المتوسطة (راجع الخطوة 2). مرات متعددة إلى حل ماصة تفكك كتل وإعداد تعليق البكتيرية متجانسة. لا الدوامة. باستخدام ماصة معقمة وتلقيح كل سفينة 500 مل مع 5 مل من تعليق بكتيرية من الخطوة 3. تنمو الثقافات مرق عند 37 درجة مئوية لمدة 14 إلى 18 ساعة مع الهز لطيف (190-200 دورة في الدقيقة على نيو برونزويك إنوفا شاكر سلسلة 2300). يوم 3 : Spheroplasting ، تحلل التناضحي ، والطرد المركزي السكروز التدرج الكثافة الحصول F. التولارية الثقافات من الحاضنة تهتز وإزالة قسامة 1 مل من كل 500 مل الثقافة للتحقق من كثافة ضوئية منها. لقد تم العثور على أفضل النتائج واستخلاص غشاء العزل عند استخدام F. التولارية الخلايا في مرحلة مبكرة من النمو لوغاريتمي ، والذي يرتبط مع OD 600 بين 0،2-0،4 (~ 10 يوليو — 10 أغسطس CFU / مل). سوف الثقافات مع 600 أقل من 0.2 OD لن ترضخ كمية كافية من المواد غشاء مجموع التدرجات السكروز اللاحقة. على العكس ، تم العثور على الثقافات مع أكبر 600 OD من 0.4 (تقترب من مرحلة ثابتة) لانتاج مختلط غشاء اندماج. أجهزة الطرد المركزي في الثقافات ز س 7500 لمدة 30 دقيقة عند 15 درجة مئوية لجمع الخلايا. نوصي الطرد المركزي للثقافات في أربع زجاجات 250 مل الطرد المركزي ، لأنه يسهل لاحقا بيليه التعليق. إزالة بعناية طاف سائل الإعلام من كل زجاجة الطرد المركزي والاستفادة بقوة الزجاجات على مادة ماصة لإزالة الزائدة المتوسطة النمو. في غضون 10 دقيقة بعد الانتهاء من الطرد المركزي ، وتعليق كل بيليه الجرثومي في 8.75 مل من السكروز 0.75 م (في تريس 5 مم ، ودرجة الحموضة 7.5). ينبغي وقف جميع الكريات four البكتيرية ونقل (35 مل من مجموع تعليق البكتيرية) إلى قارورة 250 مل العقيمة (مع stirbar الصغيرة) في غضون 10 دقيقة. بينما خلط بلطف تعليق على الخلية stirplate ، إضافة ببطء 70 مل (2 مجلدات) EDTA ثنائي الصوديوم من 10 ملم (في تريس 5 مم ، ودرجة الحموضة 7.8) على مدى 10 دقيقة. إضافة محلول EDTA مع غيض من ماصة أسفل الخلية مستوى التعليق لتجنب تركيزات مرتفعة من EDTA المحلية. ينبغي أن تكون متغايرة stirbar بمعدل كاف لمزيج دقيق تعليق الخلية ولكن ليس بسرعة كافية للتسبب في مزبد أو تشكيل الفقاعة. بعد تمت إضافة محلول EDTA ، احتضان الحل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد حضانة و 30 دقيقة ، ببطء إضافة 11 مل (1 / 10 حجم عشر) من حل الليزوزيم 2 ملغ / مل إلى تركيز النهائي من 200 ميكروغرام / مل. الاستمرار في خلط تعليق الخلية خلال إضافة محلول الليزوزيم. كما أشير أعلاه ، إضافة الليزوزيم حل مع طرف دون ماصة السائل مستوى الخلية تعليق لتجنب تركيزات مرتفعة من الليزوزيم المحلية. يمكن إعداد المخزون الليزوزيم الحلول (2 ملغ / مل) في استخدام المفرد aliquots وتخزينها على -20 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أشهر. احتضان الحل الناتج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة و 30 دقيقة ، وإعداد قارورة معقمة 1L مع stirbar الصغيرة و 530 مل من درجة حرارة الغرفة Cellgro الجزيئية الصف O 2 درهم (4.5 مجلدات). ليز Osmotically تعليق خلية (من الخطوة 6) عن طريق تخفيف بطيء (معدل تدفق ما يقرب من 11 مل / دقيقة) في 530 مل من الصف الجزيئية O 2 درهم (من الخطوة 7) على مدى من 10 الى 15 دقيقة مع خلط لطيف. بسبب حجم أكبر الحل في هذه الخطوة ، وزيادة السرعة لضمان خلط stirbar المناسبة. ينبغي أن تكون متغايرة stirbar بمعدل كاف لتفريق بدقة واضاف التعليق الخلية مرة واحدة إلى O 2 درهم ولكن ليس بسرعة كافية لتؤدي إلى تشكيل مزبد أو الفقاعة. إضافة تعليق الخلية مع غيض من ماصة يستريح على الجزء السفلي من القارورة ، المتاخمة للstirbar ، لتسهيل التخفيف الموحد للسلل الايقاف. لقد وجدنا أن 25 مل ماصات تعمل على أفضل وجه خلال هذه الخطوة. ترصد بدقة عملية تخفيف المقاطعة ومعدل التدفق عند الضرورة لتفريق التراكمات المحلية من الخلايا ، كتل الخلية ، والخلية الخصلات. احتضان الحل الناتج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. علما بأن هذه الخطوة على ما يبدو واحدة من أصعب والحاسمة لتحقيق النجاح الشامل للتجربة. بعد حضانة و 30 دقيقة ، ونقل 40 aliquots مل من محلول تحلل التناضحي في 50 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 7500 x ج لمدة 30 دقيقة عند 10 درجة مئوية لإزالة خلايا سليمة والحطام. بعد الطرد المركزي ، وإزالة بعناية 27-30 مل من طاف من كل أنبوب مخروطي الشكل وsupernatants تجمع في قارورة معقمة a 1L نقل 25 مل من طاف المجمعة ، كل ، نابذة فائقة السرعة في أنابيب الطرد المركزي في 16 و ز خ 200000 (44400 دورة في الدقيقة في F50L – 8×39 FiberLite الدوار نابذة فائقة السرعة) لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. علما أن كل الدوار يحمل 8 الأنابيب ، وحتى هذه الخطوة يتطلب اثنين الدوارات وطرد مركزي اثنين. بدلا من ذلك ، ينبغي أن تعقد المجموعة الثانية من 8 أنابيب في 4 درجات مئوية حتى طرد. في غضون 10 دقيقة من الانتهاء من تشغيل نابذة فائقة السرعة ، وإعداد تعديل غشاء العازلة إعادة تعليق. نقل 8 مل من الأغشية العازلة تعليق (25 ٪ [وزن / وزن] السكروز ، تريس 5 ملم ، 30 ملم MgCl 2) إلى أنبوب العقيمة وإضافة 1 قرص من EDTA خالية مثبط البروتياز الكوكتيل و 375 من U Benzonase. المزيج بلطف حل لإذابة قرص مثبط البروتياز. تنبيذ فائق التالية ، صب بعناية قبالة supernatants ، نابذة فائقة السرعة على عكس أنابيب مادة ماصة ، والاستفادة بحزم لإزالة أنابيب طاف الزائدة. بمناسبة موقع كل بيليه الغشاء مع علامة للمساعدة في التصور. resuspend بلطف غشاء الكريات ثمانية مع 600 ميكرولتر كل من الأغشية العازلة تعديل إعادة تعليق. نقل إعادة تعليق كل الغشاء إلى المجموعة التالية من ثمانية أنابيب resuspend بلطف هذه الكريات ثمانية ، وحمام سباحة وresuspensions الغشاء مما أدى إلى أنبوب العقيمة. الأغشية مكعبات يصعب resuspend ، مواصلة بذلك تمرير تعديل لإعادة تعليق الأغشية العازلة على بيليه حتى القشور بعيدا عن جدار الأنبوب. غالبا ما يكون من الضروري استخدام غيض micropipette لكشط غشاء الكرية قبالة جدار الأنبوب والمساعدة في عملية إعادة تعليق. عندما pipetting ، وتجنب مزبد أو تكوين الفقاعة. علما بأن هذه الخطوة على ما يبدو واحدة من أصعب والحاسمة لتحقيق النجاح الشامل للتجربة. عندما تم معلق الكريات الغشاء وإزالتها من جميع الأنابيب 16 ، يغسل كل الأنابيب الأربعة مع 600 ميكرولتر من الأغشية العازلة تعديل إعادة تعليق. ينبغي أن تركز على غسل جميع أنحاء المنطقة وضع علامة (الغشاء بيليه) لكل أنبوب. نقل يغسل في غشاء أنبوب إعادة تعليق. كرر الخطوة غسل للمجموعات الثلاث المتبقية من أربعة أنابيب. إعادة تعليق على احتضان الغشاء مع هزاز لطيف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحط من الحمض النووي والمساعدة في الحد من المواد نديفة. إزالة قسامة صغيرة من الغشاء وتعليق تنفيذ البروتين الكمي لتحديد مجموع المحصول الغشاء. المخفف 01:01 نحن عادة إعداد مخفف ، (2.5 ٪ في SDS) ، و01:03 المخفف (2.5 ٪ في SDS) عينات من الغشاء ، تسخين العينات عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ، واستخدام البروتين العاصمة BioRad الفحص لقياس بروتين الغشاء إعادة تعليق التركيز. إجمالي محصول البروتين عموما بين 1.0 ملغ / مل و 1.6 ملغ / مل. ويتطلب استخدام الحرارة وSDS للافراج عن خطط إدارة المكاتب من الأغشية المستخرج بحيث يمكن الحصول على البروتين الكمي أكثر دقة القيمة. إعداد التدرجات الخطية السكروز 1.8 مل كل طبقات من حلول السكروز (وزن / وزن ، الذي أعد في EDTA 5 مم ، ودرجة الحموضة 7.5) إلى 14 × 95 ملم أنابيب نابذة فائقة السرعة فائقة الوضوح في الترتيب التالي : 55 ٪ ، 50 ٪ ، 45 ٪ ، 40 ٪ ، 35 ٪ ، 30 ٪. طبقات من التدرجات السكروز هو أسهل لأداء عند استخدام pipettor بصلة ، وليس pipettor الآلي. استنادا إلى البروتين الكمي غشاء إعادة تعليق (الخطوة 16) ، وطبقة 1.5 ملغ من إعادة تعليق غشاء على رأس كل التدرج. كل 14 × 95 مم أنبوب نابذة فائقة السرعة لديها القدرة القصوى من 12.5 مل ، وبالنظر إلى أن نسبة 10.8 مل من حلول السكروز من الخطوة 17 ، يجب عدم تحميل أكثر من 1.7 مل من إعادة تعليق الغشاء في التدرج. تزن فرديا وضبط دقيق لوزن الأخير من كل أنبوب التدرج السكروز (بإضافة أو إزالة غشاء إعادة تعليق) حتى يتسنى لجميع أنابيب وزن نفسه (± 0.01 غ). نقل التدرجات السكروز إلى الدوار SW – 40Ti دلو يتأرجح والطرد المركزي في ز س 256000 (38000 دورة في الدقيقة) لمدة لا تقل عن 17 ساعة عند 4 درجات مئوية. 4 اليوم : جمع الكسور التدرج السكروز بعد 17 ساعة من الطرد المركزي ، ووقف تشغيل أجهزة الطرد المركزي ، وإزالة بعناية التدرجات السكروز من الدوار SW – 40Ti. بعناية تنظيف قاع الانحدار السكروز أنبوب مع الايثانول 70 ٪ ، ثقبالجزء السفلي من أنبوب بإبرة 21g ، وجمع متسلسلة كسور 500 ميكرولتر من التدرج في أنابيب microfuge العقيمة. كرر لتدرجات لاحقة. وينبغي أن يسمح التدرج لبالتنقيط تدفق بواسطة الجاذبية ، وحتى لا تعكر صفو التدرج السكروز. ومع ذلك ، إذا كان يقطر من توقف الجزء السفلي من أنبوب التدرج ، قد يتم تطبيقها على كمية صغيرة من الضغط على الجزء العلوي من الأنبوب باستخدام إصبع واحد. تحديد معامل الانكسار في كل جزء السكروز التدرج باستخدام الإنكسار وربط معامل الانكسار مع كثافة محددة في غرام / 1 مل. تقييم الترجمة البروتين من خلال إعداد ممثل الكسور التدرج السكروز (بزيادة كثافة 0.01 ، 1.11 غرام من / الى 1.26 مل جرام / مل) لSDS – PAGE الانفصال ، ونقل إلى النيتروسليلوز ، وimmunoblotting. ممثل النتائج عندما يقوم بشكل صحيح ، فإن هذا الإجراء يؤدي إلى فصل كامل من الدردشة والحويصلات OM من كل نوع (أ) نوع (على سبيل المثال SchuS4) و B (على سبيل المثال LVS) سلالات F. التولارية. كما هو مبين في immunoblots ممثل في الشكل 1 ، F. خطط إدارة المكاتب التولارية توطين بين الكثافة وقدره 1.17 و 1.20 جم / مل. بالمقارنة ، IMPS توطين بين الكثافات من 1.13 و 1.14 جم / مل. الشكل 1. Immunoblotting ف. التدرجات التولارية السكروز الكثافة. وقد تم جمع الكسور متسلسلة من التدرجات والكثافة (جم / مل) حسبت على أساس مؤشرات الانكسار. تم فصل البروتينات بواسطة SDS – PAGE ، ثم نقل إلى النيتروسليلوز ، وimmunoblotted لكشف المرصد المغربي للسجون وتجزيء الوجود العسكري الدولي. prestained ميجاوات ، ومعايير الوزن الجزيئي مع أحجام (في كيلو دالتون) لاحظت على الجانب الأيسر من كل خانة. LVS ، lysates خلية كاملة من F. التولارية LVS. ويلاحظ التدرج الكثافة السكروز جزء المقابلة أعلاه الممرات الخاصة بكل منها. تم الكشف عن خطط إدارة المكاتب وIMPS ، كما لوحظ في الهامش الأيسر ، مع الأمصال الضدية ، النسائل المتعددة أحادي النوعية. وتم الحصول على نتائج مماثلة لF. التولارية SchuS4.

Discussion

هذا البروتوكول وصف الاختلاف من تحلل ، spheroplasting التناضحي ، والسكروز الطرد المركزي المتدرج الكثافة "المعيار الذهبي" للفصل المادي وإثراء سلبية الغرام OMS بكتيرية من المكونات الخلوية الأخرى ^{2 ، 3 ، 4.} في حين أننا سبق وصفها في تطبيق هذا الأسلوب لعزل OMS من كل نوع A و B سلالات نوع F. التولارية ⁵ ، يقدم هذا العرض إجراء أكثر تفصيلا والأمثل لعزل OM. في الواقع ، وهذا هو تقدم مهم لتحديد احتمال والسطحية المعرضة للعوامل الفوعة المفترض من هذا الممرض القاتل. وقد تجلى أهمية هذا الإجراء في الدراسات التي تبين ان مختبرنا تحصين الفئران مع خطط إدارة المكاتب المنقى توفير حماية كبيرة ضد نوع ضراوة A F. التولارية التحدي الرئوي ^6. كما لوحظ اعلاه مرحلة النمو ، من الخلايا البكتيرية ، والرصد الدقيق خلال تحلل التناضحي ، وإعادة تعليق لطيف من غشاء الكريات هي الخطوات الحاسمة التي تظهر لربط مع نجاح / فشل هذا الغشاء الداخلي الانفصال. في حين أن هذا الأسلوب الأمثل هو دقيق ويخضع لبعض المتغيرات التجريبية ، ونظام إدارة العمليات الناتجة على ما يبدو من النقاء معززة بشكل ملحوظ بالمقارنة مع تلك التي حصل من استخدام المنظفات الصناعية ، وكلوريد الليثيوم ، وكربونات الصوديوم أو ^{7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12.}

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Donor calf serum		Mediatech	35-022-CV
IsoVitaleX		Becton Dickinson	211876
Cellgro molecular grade dH2O		Mediatech	46-000-CM
38.5 ml polycarbonate bottle		FiberLite	010-0514
F50L-8×39 ultracentrifuge rotor		FiberLite	096-087051
Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail		Roche Diagnostics	04693132001
Benzonase		Novagen	70664-3
DC protein assay		BioRad	500-0116
Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes		Beckman	344060
SW-40Ti swinging bucket rotor		Beckman Coulter	331301
Abbe benchtop refractometer		Fisher Scientific	13-964-10