Быстрый способ описан, чтобы получить полное представление о структуре полисахаридов в внеклеточного матрикса. Метод использует специфику glycosylhydrolases и чувствительности масс-спектрометрия позволяет незначительное количество материалов для анализа. Этот метод можно адаптировать для использования непосредственно на самой ткани.
The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-β-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.
ОЛИМП метод, представленный здесь дает очень чувствительный и быстрый анализ полимеров, присутствующих в внеклеточных матриц. ОЛИМП сочетает ферментативного освобождения олигомеров с последующим MALDI-TOF анализа. Поколение MALDI-TOF спектр занимает менее одной минуты, поэтому ОЛИМП подходит для широкого спектра приложений, включая высокую пропускную способность исследования, такие как мутант экранов. ОЛИМП не ограничивается растительных полисахаридов, но потенциально могут быть применены к широкому кругу полимеров, ограничивается только наличием конкретных гидролитических ферментов. Тем не менее, ограничение ОЛИМП является то, что абсолютное изобилие полимера не могут быть получены.
Как упоминалось ранее ОЛИМП могут быть использованы для изучения структуры различных полисахаридов присутствует в внеклеточного матрикса разнообразия видов. В качестве примера, на рисунке 4 представлена ОЛИМП спектр основных гемицеллюлозы в траве видов, ксилан. Здесь, клеточная стенка материал, полученный из травы умеренных Miscanthus расщепляли использованием ксиланазы.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась грантом OO0G01 Энергия биологических наук Института.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water | |
BioRex MSZ 501(D) Resin | BioRad | 142-7425 | ||
Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | ||
Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | ||
3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | ||
Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | ||
MALDI-TOF | Shimadzu BioTech | Axima Performance | ||
MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | ||
SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | ||
Vacuum manifold | Millipore | MSVMHTS00 | ||
Vacuum pump | Welch | DryFast Ultra 2032 |