הדרך המהירה מתואר להשיג תובנות מבנה סוכרים מטריקס תאיים. השיטה מנצלת את הייחודיות של glycosylhydrolases ואת הרגישות של ספקטרומטריית מסה המאפשר כמויות זעירות של חומרים כדי להיות מנותח. טכניקה זו ניתנת להתאמה כדי לשמש ישירות על הרקמה עצמה.
מגע ישיר של תאים בסביבה מתווכת באורגניזמים רבים על ידי מטריקס תאיים. היבט אחד משותף של מטריצות תאיים היא שהם מכילים סוכר moieties מורכבים בצורה של גליקופרוטאינים, proteoglycans, ו / או סוכרים. דוגמאות כוללות את תאי מטריקס של בני אדם ותאי בעלי חיים המורכב בעיקר חלבונים proteoglycans או סיבי פוליסכריד המבוסס קירות התא של צמחים ופטריות, ואת proteoglycan / glycolipid קירות התא של חיידקים מבוסס. כל glycostructures אלו ממלאים תפקידים חיוניים בתא אל התא תקשורת התא אל הסביבה איתות.
דוגמה יוצאת דופן של מטריצה מורכבת תאיים קיים קירות בתאי צמח גבוה יותר. הקיר שלהם מורכב רובו ככולו של סוכרים, עד 75% ממשקלה היבש, והוא מורכב biopolymers הנפוץ ביותר כיום על פני כדור הארץ. לכן, המחקר נערך כיצד לנצל את החומרים האלה בצורה הטובה ביותר משאב פחמן ניטרלי מתחדשת להחליף פטרוכימיה שמקורם בדלק מחצבי. האתגר העיקרי לגיור דלק נשאר סרבנות קירות השפלה אנזימטית או כימי בשל glycostructures ייחודי נוכח biocomposite ייחודי זה.
כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מהיר ורגיש של תא צמח glycostructures הקיר. שיטה זו המוניים אוליגו Profiling (OLIMP) מבוססת על שחרורו האנזימטית של אוליגוסכרידים מחומרים הקיר בהנחיית glycosylhydrolases ספציפיים ניתוח בדיעבד של תערובות oligosaccharide solubilized באמצעות מטריצה בעזרת לייזר desorption / יינון הזמן של הטיסה ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/MS ) 1 (איור 1). OLIMP דורש קירות רק 5000 תאים לניתוח מלא, ניתן לבצע על הרקמה עצמה 2, ניתנת תפוקה גבוהה ניתוחים 3. אמנם הסכום המוחלט של אוליגוסכרידים solubilized לא ניתן לקבוע על ידי OLIMP השפע היחסי של יונים oligosaccharide השונים ניתן התחום מן הספקטרום המונית נותן תובנות לגבי דפוס, החלפה של פוליסכריד הילידים נוכח הקיר.
OLIMP ניתן להשתמש כדי לנתח מגוון רחב של פולימרים הקיר, מוגבל רק על ידי הזמינות של אנזימים ספציפיים 4. לדוגמה, לניתוח של פולימרים הנמצאים בתא אנזימים צמחיים הקיר זמינים לנתח את xyloglucan hemicelluloses באמצעות xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xylan באמצעות Endo-β-(1-4), xylanase 6,7 , או סוכרים pectic באמצעות שילוב של polygalacturonase לבין methylesterase 8. יתר על כן, באמצעות אותם עקרונות של OLIMP glycosylhydrolase ואפילו פעילויות glycosyltransferase ניתן לנטר נקבע 9.
השיטה המוצגת כאן OLIMP מאפשר ניתוח רגיש מאוד ומהירה של פולימרים נוכח מטריצות תאיים. OLIMP משלב את שחרור האנזימטית של oligomers עם ניתוח MALDI-TOF הבאים. הדור של הספקטרום MALDI-TOF לוקח פחות מדקה, ולכן OLIMP מתאים למגוון רחב של יישומים, כולל תפוקה גבוהה מחקרים כגון מסכי מוטציה. OLIMP אינו מוגבל סוכרים צמח אך עלולה להיות מיושם על מגוון רחב של פולימרים, מוגבל רק על ידי הזמינות של אנזימים hydrolytic ספציפיים. עם זאת, מגבלה של OLIMP הוא שפע מוחלט של הפולימר לא ניתן להשיג.
כפי שהוזכר קודם לכן OLIMP ניתן להשתמש כדי ללמוד את המבנה של מגוון רחב של סוכרים המצויים המטריצה תאיים של מגוון המינים. כדוגמה, איור 4 מייצג ספקטרום OLIMP של hemicellulose העיקרי מינים הדשא, xylan. כאן, דופן התא חומר הנגזר הדשא Miscanthus ממוזג היה מתעכל באמצעות xylanase.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי OO0G01 להעניק Biosciences לאנרגיה של המכון.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water | |
BioRex MSZ 501(D) Resin | BioRad | 142-7425 | ||
Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | ||
Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | ||
3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | ||
Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | ||
MALDI-TOF | Shimadzu BioTech | Axima Performance | ||
MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | ||
SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | ||
Vacuum manifold | Millipore | MSVMHTS00 | ||
Vacuum pump | Welch | DryFast Ultra 2032 |