Un moyen rapide est décrite afin de mieux connaître la structure des polysaccharides dans une matrice extracellulaire. La méthode tire parti de la spécificité de glycosylhydrolases et la sensibilité de la spectrométrie de masse permettant d'infimes quantités de matériaux à analyser. Cette technique est adaptable pour être utilisé directement sur le tissu lui-même.
Le contact direct des cellules à l'environnement est médiatisé dans de nombreux organismes par une matrice extracellulaire. Un aspect commun des matrices extracellulaires est qu'ils contiennent des résidus sucres complexes sous forme de glycoprotéines, des protéoglycanes, et / ou des polysaccharides. Les exemples incluent la matrice extracellulaire des humains et des cellules animales composé principalement de protéines fibrillaires et des protéoglycanes ou les murs polysaccharide à base de cellules de plantes et de champignons, et les protéoglycanes / glycolipide murs à base de cellules de bactéries. Tous ces glycostructures jouent un rôle vital dans la cellule à cellule de communication et de cellule à l'environnement et de signalisation.
Un exemple extraordinaire complexité d'une matrice extracellulaire est présente dans les parois des cellules de plantes supérieures. Leur paroi est constituée presque entièrement de sucres, jusqu'à 75% du poids sec, et se compose des biopolymères les plus abondants sur cette planète. Par conséquent, la recherche est menée comment utiliser ces matériaux les mieux comme une ressource renouvelable neutre en carbone pour remplacer les produits pétrochimiques dérivés de combustibles fossiles. Le principal défi pour la conversion de carburant reste à la réticence de murs à la dégradation enzymatique ou chimique due à la glycostructures uniques présents dans cette biocomposites unique.
Ici, nous présentons une méthode pour l'analyse rapide et sensible de glycostructures parois cellulaires végétales. Cette méthode de profilage Mass Oligo (OLIMP) est basée la libération enzymatique d'oligosaccharides à partir de matériaux mur de faciliter glycosylhydrolases spécifiques et l'analyse subséquente des mélanges d'oligosaccharides solubilisée à l'aide assistée par matrice désorption / ionisation laser à temps de vol de spectrométrie de masse (MALDI-TOF/MS ) 1 (figure 1). OLIMP nécessite murs de seulement 5000 cellules pour une analyse complète, peut être effectué sur le tissu lui-même deux, et se prêtent à des analyses à haut débit 3. Alors que le montant absolu des oligosaccharides solubilisés ne peut pas être déterminée par OLIMP l'abondance relative des différents ions oligosaccharides peuvent être délimitées à partir des spectres de masse donnant un aperçu sur la substitution modèle du polysaccharide natif présent dans le mur.
OLIMP peut être utilisée pour analyser une grande variété de polymères de la paroi, limitée seulement par la disponibilité d'enzymes spécifiques 4. Par exemple, pour l'analyse des polymères présents dans les enzymes de la paroi cellulaire des plantes sont disponibles pour analyser les hémicelluloses xyloglucane utilisant un xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xylane utilisant une endo-β 6,7-(1-4)-xylanase , ou pour les polysaccharides pectiques en utilisant une combinaison d'une polygalacturonase et une méthylestérase 8. Par ailleurs, en utilisant les mêmes principes de OLIMP glycosylhydrolase et même des activités glycosyltransférase peuvent être surveillés et déterminée 9.
La méthode présentée ici permet OLIMP une analyse très sensible et rapide des polymères présents dans les matrices extracellulaires. OLIMP combine la libération enzymatique des oligomères avec subséquentes analyse MALDI-TOF. La génération d'un spectre MALDI-TOF prend moins d'une minute, d'où OLIMP est adapté à un large éventail d'applications, notamment à haut débit des études telles que des écrans mutant. OLIMP n'est pas limitée aux polysaccharides végétaux mais peuvent éventuellement être appliquées à une large gamme de polymères, seulement limitée par la disponibilité de certaines enzymes hydrolytiques. Toutefois, une limitation de OLIMP est que l'abondance absolue du polymère ne peut pas être obtenue.
Comme mentionné précédemment OLIMP peut être utilisé pour étudier la structure d'une variété de polysaccharides présents dans la matrice extracellulaire de la diversité des espèces. À titre d'exemple, la figure 4 représente un spectre OLIMP de l'hémicellulose majeur dans les graminées, le xylane. Ici, matériau de paroi cellulaire dérivée de l'herbe tempérée Miscanthus a été digéré avec une xylanase.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par l'énergie Biosciences Institute octroi OO0G01.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water | |
BioRex MSZ 501(D) Resin | BioRad | 142-7425 | ||
Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | ||
Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | ||
3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | ||
Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | ||
MALDI-TOF | Shimadzu BioTech | Axima Performance | ||
MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | ||
SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | ||
Vacuum manifold | Millipore | MSVMHTS00 | ||
Vacuum pump | Welch | DryFast Ultra 2032 |