Resposta celular ao vivo para Estimulação mecânicas estudadas por Microscopia de Força Atômica e Óptica Integrada
Summary
Este trabalho tem como objetivo instruir o leitor na operação de um sistema integrado de força atômica-microscópio óptico de imagem para a estimulação mecânica de células vivas em cultura. Um protocolo passo a passo é apresentado. Um representante conjunto de dados que mostra a resposta de células vivas ao estímulo mecânico é apresentado.
Abstract
Para entender o mecanismo pelo qual as células vivas sentido forças mecânicas, e como eles reagem e se adaptam ao seu ambiente, uma nova tecnologia capaz de investigar o comportamento de células em sub-nível celular com resolução espacial e temporal alta foi desenvolvido. Assim, um microscópio de força atômica (AFM) foi integrado com um total reflexão interna de fluorescência microscopia (TIRF) e velocidade de rotação do disco (FSD) microscopia confocal. O sistema integrado é amplamente aplicável em uma ampla gama de estudos de dinâmica molecular em qualquer células aderentes ao vivo, permitindo que imagens ópticas direta de respostas das células ao estímulo mecânico em tempo real. Reorganização significativa dos filamentos de actina e aderências focal foi mostrado devido à estimulação mecânica local na superfície da célula apical, que induziu alterações na estrutura celular em todo o corpo da célula. Estas técnicas inovadoras irá fornecer novas informações para a compreensão de reestruturação de células vivas e dinâmicas em resposta à força mecânica. Um protocolo detalhado e um conjunto de dados representativos que mostram a resposta de células vivas ao estímulo mecânico são apresentados.
Protocol
Discussion
Aderências citoesqueleto 10/07 e 16/11 focal são estruturas dinâmicas que montar, dispersar e virar as células migram ou responder a força mecânica 17. Eles têm funções importantes na regulação do crescimento celular, sobrevivência e expressão gênica. Sabendo sua distribuição e dinâmicas específicas fornece uma melhor compreensão de como as células se comunicam com a matriz e entre si.
Este sistema novo microscópio é amplamente aplicáve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vinculina-GFP plasmídeo foi um presente de Kenneth Yamada, National Institutes of Health, Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial, Bethesda, Maryland, e actina-MRFP plasmídeo foi um presente de Michael Davidson, Universidade Estadual da Flórida, Tallahassee, Florida.
Este trabalho foi financiado pela NSF Prémio Carreira # 0747334 e AHA-Nacional SDG # 0835205N a Andreea Trache.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AFM tip | Novascan Technologies | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | ||
| avidin | Sigma Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F4759 | 1 mg/mL | |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | ||
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza | VPI-1004 | ||
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corporation | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
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