Levande cell Svar på mekanisk stimulering studerats av integrerad optisk och atomkraftsmikroskopi
Summary
Detta dokument syftar till att instruera läsaren i driften av ett integrerat atomic force-optisk avbildning mikroskop för mekanisk stimulering av levande celler i kultur. En steg-för-steg-protokollet presenteras. En representant datauppsättning som visar levande cell svar på mekanisk stimulering presenteras.
Abstract
För att förstå den mekanism genom vilken levande celler känsla mekaniska krafter och hur de reagerar och anpassa sig till sin miljö, en ny teknik kan undersöka cellerna beteende vid sub-cellnivå med hög tidsmässiga och geografiska utvecklades. Således var ett atomkraftsmikroskop (AFM) integrerad med en total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi och snabbt snurrande skiva (FSD) konfokalmikroskopi. Det integrerade systemet som är brett tillämpbar inom ett brett spektrum av molekylära dynamiska studier i någon anhängare levande celler, vilket gör att direkt optisk avbildning av cell svar på mekanisk stimulering i realtid. Betydande ombildning av aktin filament och fokus sammanväxningar visades på grund av lokal mekanisk stimulering på apikala cellytan som inducerade förändringar i cellstrukturen i hela cellkroppen. Dessa innovativa tekniker kommer att ge ny information för att förstå levande cell omstrukturering och dynamik som svar på mekanisk kraft. En detaljerad protokoll och en representant datauppsättning som visar levande cell svar på mekanisk stimulering presenteras.
Protocol
Discussion
Cytoskelettet 7-10 och fokus sammanväxningar är 11-16 dynamiska strukturer som monterar, sprida och vänd över som celler migrera eller svarar på mekanisk kraft 17. De har betydande funktioner i regleringen av celltillväxt, överlevnad och genuttryck. Att veta deras specifika distribution och dynamik ger en bättre förståelse för hur celler kommunicerar med matris och mellan sig.
Det nya mikroskop systemet är mångsidigt användbar inom ett brett spe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vinculin-GFP plasmid var en gåva från Kenneth Yamada, National Institutes of Health, National Institute of Dental och Craniofacial Forskning, Bethesda, Maryland, och aktin-mRFP plasmid var en gåva från Michael Davidson, Florida State University, Tallahassee, Florida.
Detta arbete stöddes av NSF Karriär utmärkelse # 0747334 och AHA-National SDG # 0835205N till Andreea Trache.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AFM tip | Novascan Technologies | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | ||
| avidin | Sigma Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F4759 | 1 mg/mL | |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | ||
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza | VPI-1004 | ||
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corporation | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A., Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , 2.1-2.17 (2008).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
- Trache, A., Meininger, G. A., Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , 2.1-2.22 (2008).
- Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
- Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
- Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
- Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
- Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
- Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
- Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
- Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
- Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).
