בפרוטוקול באתרו על כנפי פרפר גלמי שימוש Riboprobes
Summary
כדי לבחון ביטוי גנים ברקמות הזרוע גלמי של Bicyclus anynana, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה של הכלאות באתרו באמצעות riboprobes. כמו כן אנו מספקים הנחיות אופטימיזציה נוספת של פרוטוקול זה לשימוש כנפיים גלמי Lepidopteran של מינים אחרים.
Abstract
כאן אנו מציגים, בפורמט וידיאו, פרוטוקול של הכלאות באתרם גלמי כנפיים של פרפר Bicyclus anynana באמצעות riboprobes. ב הכלאות באתרו, עמוד התווך של הביולוגיה ההתפתחותית, מועילים כדי ללמוד את דפוסי במרחב ובזמן של ביטוי גנים בפיתוח רקמות ברמה של שעתוק. אם נוגדנים היעד מוצרי חלבון של שעתוק הגנים טרם פותחו, ו / או יש גן עותקים מרובים של חלבון מסוים בגנום זה לא יכול להיות מובחן באמצעות נוגדנים זמינים, בכל מנח יכול לשמש במקום. בעוד בטכניקה באתרו עבור דיסקים כנף הזחל כבר זמין לקהילה פרפר במשך כמה שנים, פרוטוקול הנוכחי עבר אופטימיזציה עבור כנפי גלמי גדול יותר ועדין יותר.
Protocol
Discussion
אופטימיזציה של הפרוטוקולים הקיימים
ב הכלאות באתרם על דיסקים כנף הזחל בוצעו בהצלחה באמצעות דיסקים של פרפרים תמצית coenia (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. ותרבי et al 1999).. הפרוטוקול הנוכחי הותאם מתוך פרוטוקול כתוב מפורט זמין על פי דרישה מן המעבדה קרול עבור stainings כנף הזח…
Acknowledgements
אנו מודים ג'יין Selegue, מרגרט הולינגסוורת', ג'ין ברי, ריו Futahashi, Najmus סהר מחפוז, אלכסנדר Popadic, בוב ריד, תמיכה טכנית עבור רוש לסייע לפתרון בעיות בפרוטוקול זה. אנו מודים גם ויליאם Piel עצה על עריכת הסרט.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5g/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Applied Science | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Applied Science | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
