Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation
Summary
Transgene Würmer werden häufig in Verwendung<em> C. elegans</em> Forschung. Beschrieben wird eine einfache, aber effektive, Protokoll Transgene in Würmer mit biolistischen Bombardierung mit DNA-beschichteten Goldpartikeln einzuführen. Der Aufwand und die Ergebnisse der Bombardierung den Vergleich mit Mikroinjektion für die Erzeugung von transgenen Tieren.
Abstract
Die Anzahl der Laboratorien, die die frei lebenden Nematoden C. elegans wächst rasant. Die Popularität dieser biologischen Modell ist eine schnelle Erzeugung und kurze Lebensdauer, einfache und kostengünstige Wartung, vollständig sequenzierten Genoms und Array von RNAi Ressourcen und mutierten Tieren zugeschrieben. Zusätzlich Analyse der C. elegans Genoms ergab eine große Ähnlichkeit zwischen Würmern und höheren Wirbeltieren, die die Forschung in Würmer könnten eine wichtige Ergänzung zu Studien in ganze Mäuse oder kultivierten Zellen durchgeführt werden, schlägt. Ein leistungsfähiger und wichtiger Bestandteil der Wurm Forschung ist die Fähigkeit, transgene Tiere zu verwenden, um Gen-Lokalisation und Funktion zu untersuchen. Transgene Tiere können entweder über Mikroinjektion der Wurm Keimbahn oder durch den Einsatz von biolistischen Bombardement erstellt werden. Bombardment ist eine neuere Technik und weniger vertraut ist, eine Reihe von Laboren. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, um transgene Würmer biolistischen Beschuss mit Goldpartikeln mit dem Bio-Rad PDS-1000-System zu generieren. Im Vergleich mit DNA-Mikroinjektion in Hermaphrodit Keimbahn, hat dieses Protokoll den Vorteil, dass keine besonderen Fähigkeiten des Betreibers im Hinblick auf die Identifizierung Wurm Anatomie oder die Durchführung Mikroinjektion. Weitere mehreren transgenen Linien sind in der Regel aus einer einzigen Bombardierung erhalten. Ebenfalls im Gegensatz zu Mikroinjektion, produziert biolistischen Bombardement transgene Tiere mit sowohl extrachromosomale Arrays und integrierte Transgene. Die Fähigkeit, integrierte transgenen Linien zu erhalten kann die Verwendung von mutagenen Protokolle Fremd-DNA zu integrieren. Zusammenfassend kann biolistischen Bombardement eine attraktive Methode für die Erzeugung von transgenen Tieren, vor allem für die Ermittler nicht in der Anlage der Zeit und den Aufwand, sich geschickt in Mikroinjektion interessiert.
Protocol
Discussion
Biolistic Bombardement ist eine einfache Methode, um Fremd-DNA in vielen Organismen einzuführen, einschließlich C. elegans 1,5,6,7,16. Es stützt sich auf Goldpartikel Bildung eines Komplexes mit DNA in Gegenwart von CaCl 2. Kationische Polyamine wie Spermidin, schützen DNA aus Nucleaseabbau in vivo. Da Spermidin ist ein instabiles Molekül, ist es wichtig, sie in kleinen Portionen bei -20 ° C, und nehmen Sie die Lösung direkt vor der Durchführung des Bombardements. Wie wir in der Bo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Seed-Fonds von der University of Pittsburgh und NIH AG028977 zu ALF unterstützt
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gold particles | Inbio gold | BD021 | 1micron | |
| Midiprep kit | Qiagen | 12143 | ||
| Spermidine | Sigma | S4139 | ||
| Protamine | Sigma | P4505 | ||
| Macrocarriers | Biorad | 165-2335 | ||
| PDS-1000/He Hepta System | Biorad | 165-2257 | ||
| Rupture disk | Biorad | 165-2330 | ||
| Nystatin | Sigma | N1638 | ||
| Streptomycin | MP | 100556 |
References
- Evans, T. C. . Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Wilm, T., Demel, P., Koop, H. U., Schnabel, H., Schnabel, R. Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans. Gene. 229, 31-35 (1999).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic Acids Res. 32, e40-e40 (2004).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
- Riddle, D. L., Swanson, M. M., Albert, P. S. Interacting genes in nematode dauer larva formation. Nature. 290, 668-671 (1981).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Conservation of function and expression of unc-119 from two Caenorhabditis species despite divergence of non-coding DNA. Gene. 183, 77-85 (1996).
- Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Retrofitting ampicillin resistant vectors by recombination for use in generating C. elegans transgenic animals by bombardment. Plasmid. 62, 140-145 (2009).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-30 (1995).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R., Wood, W. B. . The nematode, Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Sivamani, E., DeLong, R. K., Qu, R. Protamine-mediated DNA coating remarkably improves bombardment transformation efficiency in plant cells. Plant Cell Rep. 28, 213-221 (2009).
- Johnston, S. A. Biolistic transformation: microbes to mice. Nature. 346, 776-777 (1990).
