Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования
Summary
Трансгенные черви обычно используются в<em> С. Элеганс</em> Исследования. Описывается простой, но эффективный, протокол ввести трансгены в червей использующих biolistic бомбардировки с ДНК-частиц, покрытых золотом. Усилия, затраченные и результаты бомбардировки выгодно микроинъекции для создания трансгенных животных.
Abstract
Число лабораторий, использующих бесплатный С. нематода жизни Элеганс быстро растет. Популярность этой биологической модели объясняется быстрое время генерации и короткий срок службы, легкий и недорогой технического обслуживания, полностью секвенированы генома, и массив RNAi ресурсов и мутантных животных. Кроме того, анализ C. Элеганс генома показало большое сходство между червями и высших позвоночных животных, что позволяет предположить, что исследования в червей могло бы стать важным дополнением к исследований, проведенных в целом мышей и культуре клеток. Мощная и важная часть червя исследования заключается в возможности использования трансгенных животных для изучения локализации генов и функции. Трансгенные животные могут быть созданы либо с помощью микроинъекции червь зародышевой линии или через использование biolistic бомбардировки. Бомбардировка является новой техникой и менее знакомые число лабораторий. Здесь мы опишем простой протокол для создания трансгенных червей biolistic бомбардировки частицами золота использованием Bio-Rad PDS-1000 системе. По сравнению с ДНК микроинъекции в гермафродита зародышевой линии, этот протокол обладает тем преимуществом, что не требует специальных навыков от оператора в отношении выявления червя анатомии или выполнение микроинъекции. Далее несколько трансгенных линий чаще всего получаются из одного бомбардировки. Кроме того, в отличие от микроинъекции, biolistic бомбардировки производит трансгенных животных с обоими внехромосомными массивы и интегрированных трансгены. Возможность получения интегрированной трансгенных линий может избежать использования мутагенных протоколов для интеграции чужеродной ДНК. В заключение biolistic бомбардировка может быть привлекательным методом для создания трансгенных животных, особенно для исследователей, не заинтересованы в инвестировании времени и усилий, необходимых, чтобы стать опытным специалистом в микроинъекции.
Protocol
Discussion
Biolistic бомбардировки простой метод введения чужеродной ДНК в многих организмов, в том числе С. Элеганс 1,5,6,7,16. Он опирается на золоте частиц, образующих комплекс с ДНК в присутствии CaCl 2. Катионные полиамины, такие, как спермидина, защищают ДНК от деградации нуклеазой в ест…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана семян средств из Университета Питтсбурга и грант NIH AG028977 для ALF
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gold particles | Inbio gold | BD021 | 1micron | |
| Midiprep kit | Qiagen | 12143 | ||
| Spermidine | Sigma | S4139 | ||
| Protamine | Sigma | P4505 | ||
| Macrocarriers | Biorad | 165-2335 | ||
| PDS-1000/He Hepta System | Biorad | 165-2257 | ||
| Rupture disk | Biorad | 165-2330 | ||
| Nystatin | Sigma | N1638 | ||
| Streptomycin | MP | 100556 |
References
- Evans, T. C. . Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Wilm, T., Demel, P., Koop, H. U., Schnabel, H., Schnabel, R. Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans. Gene. 229, 31-35 (1999).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic Acids Res. 32, e40-e40 (2004).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
- Riddle, D. L., Swanson, M. M., Albert, P. S. Interacting genes in nematode dauer larva formation. Nature. 290, 668-671 (1981).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Conservation of function and expression of unc-119 from two Caenorhabditis species despite divergence of non-coding DNA. Gene. 183, 77-85 (1996).
- Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Retrofitting ampicillin resistant vectors by recombination for use in generating C. elegans transgenic animals by bombardment. Plasmid. 62, 140-145 (2009).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-30 (1995).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R., Wood, W. B. . The nematode, Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Sivamani, E., DeLong, R. K., Qu, R. Protamine-mediated DNA coating remarkably improves bombardment transformation efficiency in plant cells. Plant Cell Rep. 28, 213-221 (2009).
- Johnston, S. A. Biolistic transformation: microbes to mice. Nature. 346, 776-777 (1990).
