Toxoplasma gondii Formation paroi du kyste dans la moelle osseuse Activé macrophages dérivés et Conditions Bradyzoite
Summary
Toxoplasma gondii se convertit en une forme un kyste, en réponse aux stress environnementaux, ce qui peut être imité dans les modèles de culture de tissus. Cette vidéo montre des techniques pour examiner la formation des parois du kyste en activant la moelle osseuse dérivées des macrophages ou des changements de pH moyen de croissance des cellules de fibroblastes.
Abstract
Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire qui peut envahir toute cellule nucléée des animaux à sang chaud. Lors de l'infection, T. gondii diffuse comme une forme rapide répliquant appelé tachyzoïtes. Tachyzoïtes convertir en une forme à croissance lente enkystées appelé bradyzoite par un processus de signalisation qui ne sont pas bien caractérisés. Dans les animaux, les kystes bradyzoite sont trouvés dans le système nerveux central et les tissus musculaires et représentent la phase chronique de l'infection. Conversion à bradyzoïtes peut être simulé en culture de tissus par le CO 2 la famine, l'aide moyenne avec un pH élevé, ou l'ajout d'interféron gamma (IFN). Bradyzoïtes sont caractérisées par la présence d'un kyste, à laquelle la lectine de Dolichos biflorus agglutinine (DBA) lie. DBA marqué par fluorescence est utilisée pour visualiser la paroi du kyste chez des parasites cultivés dans des fibroblastes de prépuce humain (HFFS) qui ont été exposés à faibles émissions de CO 2 et moyennes pH élevé. De même, les parasites qui résident dans les os murins dérivés de la moelle macrophages (BMMs) affichent une paroi du kyste détectable par DBA après la BMMs sont activés avec IFN et de lipopolysaccharides (LPS). Ce protocole va montrer comment induire une conversion de T. gondii à l'aide d'un support bradyzoïtes pH élevé de croissance avec le CO 2 à faible et l'activation de BMMs. Les cellules hôtes seront cultivés sur des lamelles, infectés par tachyzoïtes et soit activé avec plus d'IFNy et LPS (BMMs) ou exposé à un milieu de croissance à pH élevé (HFFS) pendant trois jours. À la fin des infections, des cellules hôtes seront fixées, perméabilisées, et bloqués. Parois des kystes seront visualisés en utilisant la rhodamine DBA avec la microscopie à fluorescence.
Protocol
Discussion
Bien que le mécanisme de développement bradyzoite n'est pas entièrement comprise, des analyses génétiques moléculaires de T. conversion de l'étape gondii dans la culture de tissus a conduit à la découverte des gènes qui sont impliqués dans la formation de kystes bradyzoite 2,3,4. Les analyses ont également conduit à l'observation que certains marqueurs bradyzoite sont exprimés dans d'autres conditions de stress prolongé, y compris la croissance dans les macroph…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate | |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | ||
| Formaldehyde (16%) | Polysciences | 18814 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | ||
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | ||
| IFNγ | PeproTech | 315-05 | Store in single use aliquots | |
| L-glutamine (200mM) | Gibco | 25030 | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391-1MG | Store in single use aliquots | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | Gibco | 31800-022 | ||
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 | ||
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
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